Somministrazione intraduttale e visualizzazione a raggi X della soluzione ablativa a base di etanolo per la prevenzione e il trattamento locale del cancro al seno in modelli murini

Il cancro al seno è il cancro più diffuso e la seconda causa principale di morte correlata al cancro per le donne negli Stati Uniti. Gli attuali approcci di prevenzione sono limitati e hanno una varietà di effetti collaterali avversi. Sono necessari nuovi interventi per la prevenzione primaria. Abbiamo sviluppato un metodo per la somministrazione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo agli epiteli mammari del topo per la prevenzione del cancro al seno.

L'iniezione direttamente nell'apertura del capezzolo consente di colpire le cellule epiteliali che rivestono l'albero duttale con un danno tissutale collaterale minimo. Questo metodo consente l'imaging simultaneo in vivo utilizzando nanoparticelle di ossido di tantalio come agente di contrasto ad alta risoluzione. Questo metodo può essere adattato per l'uso con altri agenti di contrasto a raggi X e vari trattamenti preventivi con diverse soluzioni ablative chimiche o termiche.

Il primo passo coinvolto in questo metodo di prevenzione del cancro al seno guidato da immagini è quello di indurre un trattamento antinfiammatorio esteso attraverso il dosaggio orale di carprofene utilizzando tazze di gel di sucralosio preparate in laboratorio. Prepariamo l'animale utilizzando la crema depilatoria per rimuovere la pelliccia dalla zona circostante i capezzoli da iniettare. Quindi le iniezioni intraduttali vengono eseguite con l'aiuto di uno stereoscopio per individuare e visualizzare al meglio l'apertura del capezzolo per l'inserimento dell'ago.

Dopo la somministrazione della soluzione, gli animali vengono ripresi mediante micro-TC o fluoroscopia per determinare il successo delle iniezioni. Le scansioni micro-TC possono essere elaborate per creare ricostruzioni 3D dell'albero duttale mammario iniettato per ulteriori analisi del riempimento riuscito e altre metriche. In primo luogo, preparare il carprofene alla concentrazione richiesta.

Facciamo una soluzione di lavoro di due mg per mL per iniettare 0,5 mL e ottenere una dose finale di un mg per tazza. È possibile aggiungere colorante alimentare sterile alla miscela per confermare meglio la miscelazione completa del farmaco nel sucralosio della tazza. Quindi, posizionare le tazze a bagnomaria a 60 gradi Celsius per 15 minuti.

Rimuovere le tazze e asciugarle per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione. Utilizzare salviette al 70% di etanolo o etanolo per pulire la superficie del coperchio della tazza e lasciare asciugare. Utilizzare una siringa per iniettare la quantità necessaria di soluzione di carprofene attraverso il coperchio.

In questo caso, dobbiamo iniettare 500 microlitri per il risultato desiderato. Posizionare un adesivo sopra il foro dall'ago e scuotere la tazza per 15 secondi prima di vorticare per altri 15 secondi. Controllare la tazza per una miscelazione omogenea cercando ciuffi di blu scuro.

Le tazze possono quindi essere refrigerate per un massimo di un mese. La preparazione dell'animale deve avvenire due o tre giorni prima della procedura intraduttale. Inizia anestetizzando l'animale usando l'isoflurano.

Trasferire il mouse anestetizzato su un cono nasale che continua a fornire isoflurano. Applicare lubrificante per gli occhi al mouse mentre si trova al cono del naso e quindi posizionare il mouse sul retro. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare la crema depilatoria all'area delle ghiandole mammarie che si prevede di iniettare.

Strofinare l'applicatore su e giù sulla pelle dell'animale nell'area desiderata per aiutare con un allentamento più rapido della pelliccia. È importante lasciare la crema sul mouse per il minor tempo possibile per evitare di bruciare la pelle. Dopo 10-30 secondi di applicazione, utilizzare acqua tiepida su una garza per rimuovere completamente la crema.

Utilizzare da due a quattro risciacqui per garantire la completa rimozione prima di asciugare la pelle con una garza pulita. Controllare le aree di rimozione della pelliccia per confermare una buona visibilità e l'accesso ai capezzoli. Ripetere la procedura depilatoria se necessario.

Metti il mouse in una gabbia di recupero pulita su un pad riscaldante per riprendersi dall'anestesia. Dare una tazza di carprofene per preparare i topi nella loro gabbia di casa dopo il recupero. Inizierai di nuovo anestetizzando l'animale usando l'anestesia isoflurano e spostando il topo su un cono nasale una volta che è stato completamente indotto.

Il lubrificante per gli occhi verrà applicato prima di posizionare l'animale sulla schiena per le iniezioni. Può essere utile fissare le gambe vicino alle ghiandole mammarie che verranno iniettate, ma non è necessario. Preparare la siringa con il volume desiderato di soluzione iniettabile più un microlitro nel caso in cui alcuni fuoriuscimenti dopo la rimozione dell'ago.

Può essere utile riempire con un volume aggiuntivo per testare l'ago per il libero flusso della soluzione immediatamente prima dell'iniezione. Se si inietta più di una ghiandola mammaria, può risparmiare tempo per preriempire più siringhe, se disponibili. Fare attenzione a non farlo troppo presto se la soluzione è soggetta a intasamento quando viene lasciata a sedere.

Preparare il capezzolo rimuovendo qualsiasi pelle morta visibile usando una pinza a punta fine, se possibile. Non è necessario rimuovere tutta la pelle morta se non blocca l'apertura del capezzolo ed è resistente al tiraggio. Questo a volte può causare lesioni e gonfiore al capezzolo se la pelle morta è fissata per vivere la pelle troppo strettamente.

Con la smussatura dell'ago visibile, inserire l'ago nell'apertura del capezzolo con l'aiuto della guida della pinza a punta fine. A seconda della lunghezza e della fermezza del capezzolo, potrebbe non essere sempre possibile tenere il capezzolo mentre si guida nell'ago. A volte è necessario manovrare il capezzolo con l'ago per consentire alla pinza di tirare il capezzolo sopra l'ago piuttosto che guidare l'ago verso il basso nel capezzolo.

Una volta che la smussatura dell'ago è completamente circondata dal capezzolo e nel condotto principale, iniziare lentamente a iniettare la soluzione. La velocità desiderata è di circa 40 microlitri al minuto. Evitare di iniettare più rapidamente di questo per prevenire possibili danni all'albero duttale.

Dopo l'iniezione completa, attendere 30 secondi prima di rimuovere l'ago dal capezzolo con l'assistenza della pinza. Ciò ridurrà al minimo qualsiasi perdita dal capezzolo. Valutare l'area per eventuali segni di un'iniezione non riuscita.

Un aspetto a cupola può indicare un'iniezione di cuscinetto di grasso o un trauma nell'area. Spesso è possibile vedere che si sta verificando un'iniezione nel cuscinetto di grasso se la soluzione contiene colorante o se si sta cercando attentamente il doming nel sito di iniezione, come si può vedere qui. Procedere all'iniezione delle ghiandole mammarie rimanenti necessarie per l'esperimento in modo simile, annotando i volumi di iniezione e le eventuali incidenze di perdite.

Alcune aree del mouse possono essere più difficili da iniettare a causa di problemi come il posizionamento scomodo della mano o l'interferenza respiratoria. Ad esempio, un iniettore destrorso avrà probabilmente più difficoltà a iniettare le ghiandole sul lato in alto a destra del topo visto qui. Questi si muovono di più a causa della vicinanza ai polmoni e può essere difficile trovare un buon posizionamento della mano con il corpo dell'animale nel modo di appoggiare il polso sulla superficie.

Alcuni potrebbero trovare più facile riposizionare il mouse se il cono del naso lo consente. Quando si inietta una soluzione contenente etanolo, è necessario prestare attenzione per evitare l'intossicazione sistemica da alcol. Ciò richiede di sapere quanto etanolo può essere iniettato in una sessione e la somministrazione di soluzione IP contenente saccarosio durante la procedura per contrastare gli effetti.

Dopo la procedura intraduttale, gli animali possono essere recuperati in una gabbia pulita su una piastra riscaldante o spostati nel sistema micro-CT per l'imaging di alberi duttali riempiti. Il mouse deve anche essere recuperato dopo qualsiasi sessione di imaging. Dopo aver spostato l'animale iniettato nel sistema micro-CT, continuare a somministrare isoflurano per mantenere l'anestesia durante l'imaging.

Può essere utile standardizzare la posizione dell'imaging registrando le gambe vicino al sito per essere ripresi. Ad esempio, il taping delle zampe posteriori in una posizione estesa può impedire all'osso delle gambe di impedire la vista delle ghiandole iniettate. Nastrare le zampe anteriori in una posizione estesa verso l'alto può allo stesso modo aiutare a visualizzare le ghiandole superiori.

Abbiamo anche scoperto che il taping attraverso l'addome del topo può aiutare a ridurre l'artefatto respiratorio per le ghiandole inferiori. Esistono molti parametri di scansione accettabili per la visualizzazione dell'albero duttale. Bisogna sempre fare attenzione per garantire che la dose di radiazioni risultante da queste scansioni non superi i limiti di radiazione per un determinato ceppo di topi.

Il dosaggio delle radiazioni può essere notevolmente ridotto visualizzando la fluoroscopia e notando il successo della consegna piuttosto che acquisire immagini con tempi di esposizione più lunghi. I nostri parametri di scansione standard sono accettabili per l'imaging ripetuto se si acquisiscono solo brevi scansioni standard di due minuti. Scansioni più lunghe ad alta risoluzione fino a 14 minuti sono accettabili come procedura terminale prima dell'eutanasia.

Queste scansioni più lunghe non sono accettabili per gli studi longitudinali in quanto possono causare malattie da radiazioni nell'animale. Questo animale è stato iniettato con una soluzione di etanolo contenente 100 millimolari di contrasto di ossido di tantalio nelle ghiandole quattro e nove. L'acquisizione attuale è una scansione ad alta risoluzione di 14 minuti delle ghiandole inferiori iniettate.

La fluoroscopia dell'animale ci consente di vedere l'architettura dell'albero duttale evidenziata dal contrasto all'interno della soluzione di iniezione. Il sistema micro-CT che utilizziamo è dotato di software integrato che consente la creazione di rendering rapidi per valutare il successo dell'iniezione senza analisi formale. Questa funzione ha un semplice cursore di contrasto che consente una ragionevole riduzione del segnale-rumore.

Il limite di queste copie trasformate è che le stesse soglie di segnale vengono applicate all'intera immagine. Ciò consente ai segnali luminosi che chiaramente non fanno parte dell'albero duttale, come il ferro nella dieta, di rimanere nella resa. Migliori rappresentazioni formali possono essere effettuate utilizzando un software di analisi più sofisticato che consente la segmentazione dell'area di interesse.

Per ottenere il miglior rendering dell'unico albero duttale, si consiglia di segmentare il cuscinetto di grasso mammario per un'ulteriore elaborazione delle immagini. Questo processo richiede che la linea tracci i confini del cuscinetto di grasso attraverso lo spessore completo dell'animale. Abbiamo scoperto che tracciare ogni terza fetta e propagare l'oggetto è sufficiente per catturare l'intero condotto.

Questo può essere un processo soggettivo, che richiede l'aderenza agli standard di laboratorio per il tracciamento per garantire un output simile da tutti gli individui che analizzano le scansioni. La familiarità con l'anatomia può aiutare con le chiamate di giudizio su quali aree includere. Dopo aver propagato le tracce, è quindi possibile sogliere la rappresentazione entro un certo intervallo per visualizzare solo il contrasto contenuto all'interno della ghiandola mammaria.

Questa dovrebbe essere la soluzione all'interno dell'albero duttale, così come qualsiasi perdita nelle immediate vicinanze. Un intervallo da 300 a 3.000 HU tende a funzionare bene nel caso di soluzioni contenenti ossido di tantalio. Un esempio di una copia trasformata completamente elaborata può essere visto qui in più aspetti.

A seconda di come l'animale è orientato nella micro-TC, potrebbe essere necessario riorientare i file DICOM nel software di analisi per rappresentare il posizionamento anatomico intuitivo con la testa dell'animale nella parte superiore dell'immagine. Può anche essere difficile determinare quale ghiandola viene visualizzata se non si ha cura di ruotare l'immagine in modo simile ogni volta. Ulteriori misurazioni come il volume o la lunghezza possono essere effettuate una volta creata una ricostruzione dell'albero duttale.

La convalida per una consegna di successo attraverso questa procedura può essere dimostrata non solo da rappresentazioni micro-CT 3D come descritto qui, ma anche attraverso supporti interi a doppia macchia con blu Evans iniettato che si sovrappone all'intero albero duttale evidenziato con allume carminio. La microscopia confocale 3D può evidenziare l'architettura dell'albero duttale in una ghiandola ripulita macchiata di e-caderina. La variabilità da ceppo a ceppo e da topo a topo e l'anatomia del capezzolo possono rendere più o meno difficile l'iniezione delle ghiandole.

Questo è un esempio di un capezzolo ideale per iniezione con un alto profilo per facilità di presa. I capezzoli con profili più bassi, come questo, possono essere più difficili da cannulare con successo. Queste differenze possono rendere più probabile ottenere un'iniezione di successo senza traumi o doming come visto qui o più probabilità di non avere successo come dimostrato dall'aspetto a cupola di questa iniezione di grasso pad.

Quando si tratta di prevenzione del cancro al seno, ci sono attualmente due tattiche principali impiegate. La prima, vigile attesa, non comporta alcun vero intervento. Gli individui che perseguono questo percorso sono regolarmente monitorati per eventuali grumi nel loro tessuto mammario che indicherebbero la formazione di cancro si sta verificando.

Il rilevamento della malattia richiederebbe quindi un trattamento. La mastectomia profilattica è una procedura più invasiva che rimuove tutte le cellule epiteliali da cui può insorgere il cancro al seno insieme allo stroma circostante. Questo intervento chirurgico può avere gravi effetti collaterali negativi ed è raramente selezionato come opzione profilattica per gli individui con basso o moderato rischio di malattia.

Il nostro approccio prevede l'ablazione epiteliale locale attraverso l'iniezione di una soluzione ablativa direttamente nell'albero duttale mammario. Questo metodo riduce i danni collaterali e sarebbe probabilmente un'opzione più attraente per gli individui non a grave rischio di malattia. L'aggiunta del contrasto per l'imaging immediato post-iniezione rende anche questo facilmente traducibile per la clinica.