Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Questo metodo fornirà una migliore comprensione della funzione dell'endotelio arteriolare parenchimale che collega direttamente il flusso sanguigno intracerebrale all'alimentazione dell'attività neuronale e gliale in tutto il cervello. Un netto vantaggio tecnico rispetto all'endotelio arteriole è la maggiore risoluzione delle dimensioni morfologiche e della segnalazione calcica ed elettrica tra le singole cellule endoteliali intracerebraliali e i rispettivi organelli. Inizialmente, l'isolamento e l'esame dell'endotelio intracerebrale saranno molto impegnativi.

Tuttavia, è possibile padroneggiare questa tecnica con molta pratica accompagnata da pazienza e dedizione. Lavare il cervello isolato con una soluzione di dissezione a freddo in un becher o in una capsula di Petri per rimuovere il sangue rimanente dalla superficie del cervello. Posizionare il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto in una camera contenente una soluzione di dissezione a freddo per isolare le arteriole parenchimali.

Per isolare le arteriole parenchimali, fissare il cervello isolato con perni di acciaio in soluzione di dissezione a freddo in una capsula di Petri contenente più di 50 centimetri di rivestimento polimerico di silicio infuso con carbone. Tagliare un rettangolo di tessuto cerebrale da entrambi gli emisferi con forbici di dissezione affilate e allineate attorno all'MCA, assicurandosi che la parte superiore del segmento tissutale sia oltre il punto di ramificazione dal cerchio di Willis. Fissare il tessuto cerebrale nel piatto con l'MCA rivolto verso l'alto con perni in acciaio.

Fai con attenzione un'incisione poco profonda vicino ai perni e rimuovi la pia con una piccola pinza, sbucciando delicatamente da un'estremità verso l'altra. Fissare con cura la pia isolata con arteriole parenchimali ramificate da MCA nel piatto con gli spilli e sezionare attentamente le arteriole parenchimali. Tagliare eventuali rami distali rimanenti e assicurarsi che l'arteriola sia pulita senza tessuto attaccato.

Utilizzare questa arteriola intatta pulita per la digestione enzimatica. In alternativa, tagliare ogni arteriola in due pezzi per la digestione enzimatica per preparare i tubi endoteliali, se lo si desidera. Per la digestione parziale dei segmenti arteriolari, posizionare i segmenti arteriolari intatti in un millilitro di soluzione di dissociazione in un tubo di vetro da 10 millilitri contenente papaina, ditioeritritolo, collagenasi ed elastasi.

Incubare segmenti arteriolari a 34 gradi Celsius per 10-12 minuti. Per isolare il tubo endoteliale arteriolare, posizionare la pipetta di triturazione attaccata con l'iniettore della micro siringa nella soluzione di dissociazione nella camera e posizionarla vicino a un'estremità del segmento del recipiente digerito. Impostare una velocità compresa tra uno e tre nanolitri al secondo sul controller della pompa per una triturazione delicata.

Pur mantenendo l'ingrandimento da 100X a 200X, prelevare il segmento arteriolare nella pipetta e quindi iniettare per dissociare l'avventizia e le cellule muscolari lisce. Triturare il segmento del vaso fino a quando tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate e solo le cellule endoteliali rimangono come un tubo intatto. Con i micropolificatori, fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale sul coperchio di vetro nella camera con pipette di pinning in vetro borosilicato Per misurare il potenziale di membrana endoteliale, mentre si guarda attraverso l'obiettivo 4X, posizionare con attenzione la punta dell'elettrodo affilato appena sopra una cella del tubo endoteliale arteriolare nella soluzione salina fisiologica che scorre con un micro manipolatore.

Aumentare gradualmente l'ingrandimento a 400X e riposizionare la punta dell'elettrodo secondo necessità. Utilizzando il micropolatore, inserire delicatamente la punta di un elettrodo affilato in una delle celle del tubo endoteliale e iniziare a registrare VM utilizzando un elettrometro. Una volta che la VM a riposo endoteliale è stabile da meno 30 a meno 40 millivolt, applicare gli agenti farmacologici desiderati per obiettivo sperimentale.

Caricare il tubo endoteliale con il tracker di fluorescenza per la membrana plasmatica o l'organello desiderato a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti. Lavare le cellule con una soluzione salina fisiologica di superfusione fresca e visualizzare le cellule vive al microscopio alla lunghezza d'onda di eccitazione dei rispettivi coloranti. La funzione endoteliale è stata valutata misurando il calcio intracellulare e il potenziale di membrana in risposta a un agente farmacologico MTA, un potente agonista del recettore purinergico a 37 gradi Celsius.

Con l'applicazione di un MTA micromolare, la concentrazione intracellulare di calcio aumenta rapidamente con una concomitante iperpolarizzazione. Inoltre, l'endotelio intatto è stato incubato a 37 gradi Celsius con tracker fluorescenti per la visualizzazione per esaminare la morfologia cellulare. L'imaging delle cellule endoteliali vive ha mostrato la co-colorazione per la membrana plasmatica e i nuclei.

La membrana plasmatica è stata colorata insieme a una macchia fluorescente del reticolo endoplasmatico per cui le aree di apparente sovrapposizione di ER in prossimità della membrana plasmatica appaiono arancioni. Lo sperimentatore dovrebbe fare attenzione durante la dissezione e l'isolamento per evitare danni alle arteriole perché un'arteriola danneggiata non produrrà sicuramente un tubo endoteliale intatto. Seguendo la procedura, le cellule possono essere utilizzate per immunoistochimica fissa con anticorpi fluorescenti o colorazione di cellule vive di organelli e lipidi di membrana.

Questa tecnica genererà nuove informazioni per comprendere i meccanismi alla base del flusso sanguigno cerebrale a livello fondamentale per la fisiologia e selezionare le transizioni verso la patologia per la terapia.