Name: Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Impara a misurare il ferro non eme nei tessuti animali con un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina. Questo metodo semplice e versatile consente analisi ad alto rendimento per studiare il metabolismo del ferro.

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Questo lavoro è stato finanziato da Fondi Nazionali attraverso FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., nell'ambito del progetto UIDB/04293/2020.

I topi C57BL/6 sono stati acquistati commercialmente e i topi epcidina-null (Hamp1−/−) su uno sfondo C57BL/68 sono stati un gentile regalo di Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francia). Gli animali sono stati ospitati presso la struttura per animali i3S in specifiche condizioni prive di agenti patogeni, in un ambiente a temperatura e luce controllata, con libero accesso al chow e all'acqua dei roditori standard. La spigola europea (Dicentrarchus labrax) è stata acquistata da un allevamento ittico commerciale e ospitata presso l'impianto per animali ICBAS, in un ambiente a temperatura e luce controllata, e alimentata quotidianamente ad libitum con mangimi standard per spigole. Tutte le procedure che coinvolgono animali vertebrati sono state approvate dal Comitato etico per gli animali i3S e dall'autorità nazionale, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Le informazioni sui reagenti, le attrezzature e gli animali commerciali sono elencate nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione della soluzione
NOTA: Maneggiare e preparare tutti i reagenti e le soluzioni con bicchieri senza ferro o stoviglie usa e getta. Non lasciare che materiali metallici di laboratorio (ad esempio, spatole in acciaio inossidabile) entrino in contatto con qualsiasi reagente o soluzione, a causa del rischio di contaminazione da ferro. Assicurati che qualsiasi bicchiere riutilizzabile sia privo di ferro. Lavare i materiali con apposito detergente di laboratorio per 30-60 min, risciacquare con acqua deionizzata, immergere durante la notte in una soluzione di acido nitrico al 37% diluita 1:3 con acqua deionizzata, risciacquare nuovamente con acqua deionizzata e lasciare asciugare.
<ol><li>Miscela acida: aggiungere 10 g di acido tricloroacetico a 82,2 ml di acido cloridrico al 37% in una bottiglia di vetro, sciogliere accuratamente e regolare il volume finale a 100 ml con acqua deionizzata. Agitare prima dell'uso. In alternativa, utilizzare solo il 37% di acido cloridrico per la digestione dei tessuti. NOTA: La soluzione è stabile per almeno 2 mesi se conservata in flaconi di reagente di vetro marrone scuro. ATTENZIONE: l'acido cloridrico e l'acido tricloroacetico sono corrosivi e le forme concentrate rilasciano vapori acidi tossici. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti alle sostanze chimiche e occhiali antispruzzo chimico in ogni momento quando si maneggiano gli acidi. Evitare di respirarli e maneggiare sempre gli acidi sotto una cappa aspirante.</li>
	<li>Acetato di sodio saturo: aggiungere 228 g di acetato di sodio anidro a 400 ml di acqua deionizzata in una bottiglia di vetro e agitare durante la notte a temperatura ambiente. Lasciare riposare la soluzione e precipitare per un giorno. Se non si verifica alcuna precipitazione, continuare ad aggiungere piccole quantità di acetato di sodio. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro.</li>
	<li>Reagente cromogeno: Per preparare 1 mL di reagente cromogeno, aggiungere 1 mg di sale disodico acido disolfonico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL di acqua deionizzata e 10 μL di acido tioglicolico concentrato (100%) e sciogliere completamente. Portare il volume finale a 1 mL con acqua deionizzata. NOTA: Preparare tutto il reagente cromogeno necessario. La soluzione è stabile per 1 mese se protetta dalla luce.</li>
	<li>Reagente cromogeno di lavoro (WCR): aggiungere 1 volume del reagente cromogeno a 5 volumi di acetato di sodio saturo e 5 volumi di acqua deionizzata. NOTA: Questa soluzione deve essere preparata al momento del consumo.</li>
	<li>Soluzione standard di ferro madre: per preparare una soluzione di ferro da 20 mM, posizionare 111,5 mg di polvere di ferro carbonilico in un matraccio tarato da 250 ml contenente 5.480 μL di acido cloridrico al 37%. Lasciare sciogliere durante la notte a temperatura ambiente (o incubare a bagnomaria bollente). Quindi, portare la soluzione a un volume finale di 100 ml con acqua deionizzata. NOTA: La soluzione standard può essere conservata a tempo indeterminato se conservata in un recipiente ben sigillato.</li>
	<li>Working Iron Standard Solution (WISS): aggiungere 13,5 μL di acido cloridrico al 37% a 500 μL di acqua deionizzata. Aggiungere 10 μL della soluzione standard di ferro stock e portare il volume finale a 1 mL con acqua deionizzata (11.169 μg di Fe/mL, 200 μM; misurato da AAS). NOTA: La soluzione di lavoro deve essere preparata al momento del consumo.</li>
</ol>2. Essiccazione del campione
<ol><li>Tagliare un campione di tessuto del peso di 10-100 mg con una lama di bisturi. Pesarlo accuratamente in una bilancia analitica/di precisione su un piccolo pezzo di parafilm (Fresh Weight).</li>
	<li>Utilizzando una pinzetta di plastica, posizionare il pezzo di tessuto in una piastra a 24 pozzetti (non scivolata per consentire l'evaporazione dell'acqua) e lasciarlo asciugare su un incubatore standard a 65 °C per 48 ore.</li>
	<li>In alternativa, utilizzare un forno di digestione a microonde da laboratorio per asciugare campioni di tessuto. Usando una pinzetta di plastica, posizionare il pezzo di tessuto pesato in una tazza di Teflon senza ferro e asciugarlo nel microonde. Impostare i parametri operativi in base al manuale di istruzioni dello strumento. NOTA: Come riferimento, i parametri operativi per l'essiccazione dei campioni di fegato utilizzando il forno di digestione specifico (vedere Tabella dei materiali) sono mostrati nella Tabella 1.</li>
	<li>Utilizzando pinzette di plastica, posizionare ogni pezzo di tessuto essiccato su un piccolo pezzo di parafilm all'interno di una bilancia analitica/ di precisione e pesarlo accuratamente (Peso secco).</li>
</ol>3. Digestione acida del campione
<ol><li>Utilizzando pinzette di plastica, trasferire ogni pezzo di tessuto essiccato in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della miscela acida e chiudere il tubo del microcentrifuga. Preparare un bianco acido allo stesso modo, tranne per il fatto che il tessuto viene omesso. ATTENZIONE: La miscela acida è corrosiva e rilascia vapori tossici. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo chimico quando si maneggia la miscela acida. Evita di respirarlo e maneggialo sempre sotto una cappa aspirante.</li>
	<li>Digerire i tessuti incubando i tubi microcentrifuga in un incubatore a 65 °C per 20 ore.</li>
	<li>Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, trasferire 500 μL dell'estratto di acido chiaro (giallo) (surnatante) in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una micropipetta dotata di punte di plastica. Se non è possibile ottenere un surnatante chiaro, eseguire una breve centrifugazione. ATTENZIONE: Il surnatante è altamente acido. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo chimico quando si maneggiano i supernatanti. Maneggiateli sempre sotto una cappa aspirante. NOTA: A questo punto, gli estratti acidi possono essere immediatamente utilizzati per il saggio colorimetrico o congelati a -20 °C per un uso successivo. Scongelare completamente i campioni congelati a temperatura ambiente e vorticarli prima dell'uso.</li>
</ol>4. Sviluppo del colore
<ol><li>Preparare le reazioni cromogene come indicato nella Tabella 2 in tubi microcentrifuga da 1,5 mL o, per una maggiore produttività, direttamente nelle micropiastre di polistirene a fondo piatto, trasparenti e non trattate. Preparare tutte le reazioni (acido bianco, standard e campione) almeno in duplice copia.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
</ol>5. Lettura dell'assorbanza
<ol><li>Misurare l'assorbanza del campione in uno spettrofotometro o in un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 535 nm rispetto a un riferimento d'acqua deionizzato. Le piastre possono essere lette senza fili o con coperchio. Nella custodia con coperchio, rimuovere l'eventuale condensa formatasi a causa del rilascio di vapori acidi dal coperchio poco prima della misurazione per evitare possibili interferenze con la lettura dell'assorbanza. NOTA: l'assorbanza ottica del bianco acido letto contro l'acqua deionizzata (riferimento) deve essere inferiore a 0,015; l'assorbanza ottica dello standard e dei campioni deve essere compresa tra 0,100 e 1,000. Per i campioni con contenuto di ferro molto elevato o molto basso, potrebbe essere necessario regolare i volumi di estratto acido (surnatante) e diH2O (Tabella 2): se l'assorbanza è superiore a 1,0, utilizzare un volume di campione (surnatante) più piccolo; quando l'assorbanza è inferiore a 0,1, utilizzare un volume maggiore del surnatante. Il volume del campione (Vsmp) viene preso in considerazione quando si calcola il contenuto di ferro tissutale di ciascun campione (vedere il passaggio 6).</li>
</ol>6. Calcolo del contenuto di ferro tissutale
<ol><li>Calcola il contenuto di ferro del tessuto non eme con la seguente equazione: Ferro tissutale (μg/g di tessuto secco) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63469/63469eq01v2.jpg"> AT = assorbanza del campione di prova AB = assorbanza del bianco acido AS = assorbanza dello standard Fes = concentrazione di ferro di WISS (μg Fe/mL) W = peso del tessuto secco (g) Vsmp = volume del campione (volume variabile del surnatante nella Tabella 2 convertito in mL) Vf = volume finale della miscela acida dopo incubazione notturna a 65 °C (corrispondente al volume acido più il volume del tessuto secco in ml; se il peso del campione non differisce in modo significativo, assumere un volume costante ≈ 1 mL) Vstd = volume standard di ferro (volume di WISS nella tabella 2 convertito in mL) Vrv = volume di reazione finale (volume totale nella tabella 2 convertito in mL)</li>
</ol>

<ol><li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+carpet+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li>
<li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+and+anemia%3A+A+tight+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).</li>
<li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anemia+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li>
<li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+homeostasis%3A+Lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).</li>
<li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li>
<li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorrence%2C+JD+%22Methods+in+Haematology%22">Methods in Haematology</a>. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).</li>
<li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li>
<li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li>
<li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297(2010).</li>
<li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li>
<li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li>
<li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un adattamento del saggio colorimetrico basato sulla batofenantrolina originariamente descritto da Torrance e Bothwell5,6. Le fasi critiche del metodo sono l'essiccazione del campione di tessuto; denaturazione proteica e rilascio di ferro inorganico per idrolisi acida; riduzione del ferro ferrico (Fe3+) allo stato ferroso (Fe2+) in ...

Il ferro è un micronutriente essenziale, necessario per la funzione delle proteine coinvolte in processi biologici cruciali come il trasporto di ossigeno, la produzione di energia o la sintesi del DNA. È importante sottolineare che sia l'eccesso di ferro che la carenza di ferro sono altamente dannosi per la salute umana e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L'assorbimento anormale del ferro nella dieta, le diete carenti di ferro, le ripetute trasfusioni di sangue e l'infiammazione cronica sono cause comuni di disturbi associati al ferro che colpiscono miliardi di persone in tutto il mondo1,2,3.
Modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro sono stati strumentali per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell'omeostasi del ferro4. Nonostante i sostanziali progressi compiuti negli ultimi due decenni, molti aspetti chiave rimangono sfuggenti. Nei prossimi anni, la misurazione accurata dei livelli totali di ferro nei tessuti animali rimarrà un passo fondamentale per far progredire la ricerca nel campo della biologia del ferro.
La maggior parte dei laboratori quantifica il ferro tissutale con la spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) o un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Quest'ultimo si basa sul metodo originale descritto da Torrance e Bothwell oltre 50 anni fa5,6. Mentre una variante di questo metodo è stata successivamente sviluppata utilizzando la ferrozina come alternativa alla bathofenantrolina7, quest'ultimo rimane il reagente cromogenico più ampiamente citato in letteratura.
Il metodo di scelta dipende spesso dalle competenze e dall'infrastruttura disponibili. Mentre AAS e ICP-MS sono più sensibili, il saggio colorimetrico rimane ampiamente utilizzato perché presenta i seguenti importanti vantaggi: i) esclude il contributo di ferro eme derivato dall'emoglobina contenuta nei globuli rossi; ii) non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature altamente costose; e iii) il saggio originale basato su cuvette può essere adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. L'approccio colorimetrico presentato in questo lavoro viene abitualmente utilizzato per quantificare le alterazioni nei livelli di ferro non eme tissutale in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro, dai roditori ai pesci e alla mosca della frutta. Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e ben consolidato che la maggior parte dei laboratori dovrebbe trovare facile da implementare.

<table><tbody><tr><td>Piastra trasparente UV a 96 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Kern</td><td>ABJ 220-4M</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio anidro</td><td>Merck</td><td>106268</td><td></td></tr><tr><td>Bathophenanthroline sulfonato (acido dissolfonico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1375</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 topi (Mus musculus)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polvere di ferro carbonilico, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette monouso in polimetilmetacrilato (PMMA)</td><td>VWR</td><td>634-0678P</td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile a doppia distillazione</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre a fluorescenza</td><td>BioTek Instruments</td><td>FLx800</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Forno per digestione a microonde e tazze in teflon bianco</td><td>CEM</td><td>MDS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Acido nitrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>15687290</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Binder</td><td>ED115</td><td></td></tr><tr><td>Cibo per roditori</td><td>Harlan Laboratories</td><td>2014S</td><td>Teklad Global 14% Protein Roditore Mantenimento Dieta contenente 175 mg/kg di ferro</td></tr><tr><td>Branzino (Dicentrarchus labrax)</td><td>Sonrionansa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mangime per spigole</td><td>Skretting</td><td>L-2 Alterna 1P</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis a fascio singolo</td><td>Shimadzu</td><td>UV mini 1240</td><td></td></tr><tr><td>Acido tioglicolico</td><td>Merck</td><td>100700</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>Merck</td><td>100807</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Il ferro è un micronutriente essenziale. Sia il sovraccarico di ferro che la carenza sono altamente dannosi per l'uomo e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L'uso di modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro è stato determinante per far progredire la conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell'omeostasi del ferro. La misurazione dei livelli totali di ferro nei tessuti animali viene comunemente eseguita con la spettroscopia di assorbimento atomico o con un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Per molti anni, il saggio colorimetrico è stato utilizzato per la misurazione del contenuto di ferro non eme in una vasta gamma di tessuti animali. A differenza della spettroscopia di assorbimento atomico, esclude il contributo dell'eme ferro derivato dall'emoglobina contenuta nei globuli rossi. Inoltre, non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature molto costose e può quindi essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori. Infine, il test colorimetrico può essere basato su cuvette o adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. Il presente lavoro fornisce un protocollo ben consolidato che è adatto per la rilevazione di alterazioni nei livelli di ferro nei tessuti in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro.

Confronto tra cuvette e micropiastre a 96 pozzetti La misurazione del ferro non eme tissutale per reazione con un reagente batofenantrolina originariamente descritto da Torrance e Bothwell5,6 si basa sull'uso di uno spettrofotometro per la lettura dell'assorbanza. Quindi, i volumi impiegati nella reazione cromogena sono compatibili con le dimensioni di una normale cuvetta spettrofotometrica. Il presente lavoro descrive un adattamento del metod...

Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e consolidato che può essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori.

Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Qui abbiamo fornito un protocollo per misurare il contenuto non-Heme nei tessuti animali. Utilizzando un semplice saggio colorimetrico ben consolidato che può essere implementato facilmente nella maggior parte dei laboratori. Il test colorimetrico basato su bathofenantrolina non richiede competenze sofisticate o attrezzature molto costose e può essere adattato al formato micropiastra per una maggiore produttività del campione e un'efficacia dei costi.Questo protocollo è adatto per rilevare alterazioni nei livelli di ferro nei tessuti in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarichi di ferro o efficienza del ferro. Inizia tagliando un campione di tessuto del peso di 10-100 grammi con una lama di bisturi. Pesarlo accuratamente in una bilancia analitica su un piccolo pezzo di parafilm.Utilizzare pinzette di plastica per posizionare il pezzo di tessuto in una piastra a 24 pozzetti. Lasciare asciugare su un'incubatrice standard a 65 gradi Celsius per 48 ore. In alternativa, posizionare il pezzo di tessuto con una pinzetta a bastoncino in una tazza di Teflon senza ferro e asciugarlo nel forno di digestione a microonde di laboratorio.Posizionare ogni pezzo di tessuto essiccato su un piccolo pezzo di paraforma all'interno di una bilancia analitica e pesarlo accuratamente. Trasferire ogni pezzo di tessuto essiccato in un tubo micro centrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere un lit della miscela acida al tubo e chiuderlo.Preparare un bianco acido allo stesso modo, tranne per il fatto che il tessuto viene omesso qui. Incubare i tubi a 65 gradi Celsius per 20 ore per digerire il tessuto. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente utilizzare una micro pipetta dotata di punte di plastica per trasferire 500 microlitri dell'estratto di acido chiaro in un nuovo tubo micro centrifuga da 1,5 millilitri.Preparare le reazioni cromogene direttamente nelle micro piastre di polistirene trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti non trattate. Temperatura ambiente incubata per 15 minuti. Misurare l'assorbanza del campione in un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 535 nanometri rispetto a un riferimento di acqua deionizzata.La determinazione del ferro non eme mediante i saggi colorimetrici basati su cuvetta e micropiastre a 96 pozzetti sono mostrati qui. La correlazione tra i livelli di ferro non eme a base di cuvette e micropiastre in 55 campioni di tessuto di maschio nero di sei mesi, sei topi, tra cui fegato, milza, cuore, polmoni e midollo osseo sono mostrati qui. L'elevata correlazione tra le due metodologie indica che il metodo basato su micropiastre è una valida alternativa al metodo originale basato su cuvette.Infine, i livelli di ferro non eme sono stati quantificati con il metodo basato su micropiastre dopo la digestione acida di campioni derivati dagli stessi tessuti con una miscela di acido cloridrico e acido tricloroacetico o acido cloridrico da solo. L'alta correlazione mostra che l'acido tricloroacetico può essere emesso dalla digestione acida. L'immagine rappresentativa mostra i livelli di ferro non eme nel fegato, nella milza, nel cuore e nel pancreas di sei topi maschi neri di tipo selvatico e topi knockout di epcidina maschi su fondo genetico nero sei misurati con il test colorimetrico basato su Bathophenanthroline.L'interruzione dell'epcidina porta a un fenotipo di emocromatosi come la deposizione di ferro con grave accumulo di ferro epatico, pancreatico e cardiaco e deplezione di ferro splenico. I livelli epatici di ferro non eme nella spigola europea femminile giovanile a seguito di modulazione sperimentale del ferro sono mostrati qui. I livelli di ferro epatico sono aumentati in modo massiccio negli animali trattati con ferro.Mentre l'anemia ha causato una lieve riduzione delle riserve epatiche di ferro. Le immagini rappresentative mostrano i livelli di ferro non eme nella Drosophila di un mese misurati con un test colorimetrico basato su Bathophenanthroline. I risultati mostrano il contenuto di ferro non eme in ogni pool di 20 mosche o il contenuto di ferro stimato di ogni mosca.Considerando un peso medio di 0,64 milligrammi per mosca. Durante il tentativo di questa procedura ricordarsi di pulire a fondo tutta l'usura del vetro e non permettere ai materiali metallici di laboratorio di entrare in contatto con alcun reagente o soluzione a causa del rischio di contaminazione.

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In questo video, descriviamo un metodo colorimetrico per determinare il contenuto di ferro non eme nel tessuto epatico del topo. Il bafenantrolina sulfonato viene utilizzato come substrato cromogenico in presenza di un agente riducente, che converte il ferro ferrico in ferro ferroso chelabile.

Saggio colorimetrico basato su bafenantrolina sulfonato: un metodo semplice e rapido per la quantificazione del ferro non eme nel tessuto epatico di topo

Questo video dimostra una tecnica in vitro per valutare la biodisponibilità del ferro in fonti alimentari complesse. La tecnica combina la simulazione della digestione umana con l'assorbimento del ferro da parte delle cellule Caco-2 differenziate. La formazione intracellulare di ferritina agisce come marcatore per l'assorbimento cellulare del ferro.

Biodosaggio cellulare Caco-2: un metodo in vitro per misurare la biodisponibilità del ferro in fonti alimentari complesse

I livelli di eme intracellulare alterati sono associati a malattie comuni come il cancro. Pertanto, è necessario misurare i livelli di biosintesi dell'eme in diverse cellule. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un metodo rapido e sensibile per misurare e confrontare i livelli di sintesi dell'eme in diverse cellule.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

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Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Vi presentiamo un saggio per una facile quantificazione dei metalli introdotti nei campioni preparati utilizzando la cromatografia dell'affinità dei metalli immobilizzati. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol come indicatore di metallo colorimetrico e uno spettrofotometro UV-Vis come rivelatore.

Quantificazione della lisciviazione dei metalli nella cromatografia di affinità metallica immobilizzata

Questo metodo di speciazione di redox di ferro si basa sulla spettrometria di massa plasmatica accoppiata con elettroforesi capillare con impilamento del campione combinato con analisi breve in una sola esecuzione. Il metodo analizza rapidamente e fornisce bassi limiti di quantificazione per le specie di redox di ferro in una vasta gamma di tessuti e campioni di biofluidi.

Impostazione della spettrometria di massa al plasma accoppiata capillare (CE-ICP-MS) per la quantificazione delle specie di iron Redox (Fe(II), Fe(III))

Questo articolo dimostra come preparare e somministrare ferro isotopico non radioattivo legato alla transferrina per studi sul trasporto del ferro nella gravidanza del topo. Viene anche descritto l'approccio per quantificare il ferro isotopico nei compartimenti fetoplacentari.

Quantificazione del trasporto del ferro attraverso la placenta di topo in vivo utilizzando isotopi di ferro non radioattivi

Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità del ferro (Fe) rappresenta un approccio economico e versatile per valutare la biodisponibilità del Fe da alimenti, prodotti alimentari, integratori, pasti e persino regimi dietetici. Completamente validato per studi sull'uomo, rappresenta lo stato dell'arte per gli studi sulla biodisponibilità del Fe.

Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la misurazione della biodisponibilità del ferro negli alimenti

Descriviamo un test fluorescente in grado di confermare in modo rapido ed economico la capacità di nuovi composti di chelare il ferro. Il test misura la capacità dei composti di superare l'attività di legame del ferro della debole sonda fluorescente chelante del ferro Calceina, con conseguente aumento quantificabile della fluorescenza quando si verifica la chelazione.

Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro 

Questo protocollo presenta metodi per valutare la distribuzione e la quantità di deposizione di ferro nei tessuti, in particolare nel cervello. Il protocollo descrive in dettaglio le procedure per la preparazione del campione, la colorazione Perls/DAB, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati.

Valutazione della deposizione di ferro nel cervello di topi 5xFAD mediante colorazione Perls/DAB

Questo lavoro ha discusso il protocollo per la progettazione e lo sviluppo di un dispositivo POCT E-Eye-Enable per rilevare Fe, Cr, As e F in campioni ambientali, campioni biologici e alimenti e bevande. Sono stati testati quasi 2000 campioni e i risultati concordano con la tecnica gold standard.

TD-DFT Tecnica avanzata di rilevamento E-Eye guidata per la quantificazione in loco di Fe, Cr, F e As nei campioni ambientali, biologici e alimentari

Impara a misurare il ferro non eme nei tessuti animali con un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina. Questo metodo semplice e versatile consente analisi ad alto rendimento per studiare il metabolismo del ferro.

Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina

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