Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti

Questo metodo acquisisce fette vive del tronco cerebrale uditivo del pollo che comprende un gradiente più ampio di regione di frequenza nella stessa fetta. Queste fette sono adatte per esperimenti elettrofisiologici e anatomici con un asse tonotopico più grande. Questa metodologia aiuterà a comprendere lo sviluppo di microcircuiti nel tronco cerebrale uditivo.

Mentre l’anatomia è specifica per il pollo, altre specie aviarie come quaglie e uccelli canori hanno un’anatomia simile. Per iniziare, sterilizzare le uova con etanolo al 70% e incubarle a 38 gradi Celsius e al 50% di umidità. Quindi, impostare la velocità di gorgogliamento per l’ACSF in modo tale che il pH sia compreso tra 7,2 e 7,4 con un’osmolalità compresa tra 300 e 310 milliosmolari per litro.

Quindi mescolare cinque grammi di agarosio in 100 millilitri di dACSF. Sciogliere completamente l’agarosio a bagnomaria o nel microonde fino a quando l’agarosio inizia a gorgogliare. Versare l’agarosio fuso in una piastra di Petri fino ad uno spessore di cinque millimetri e conservare a temperatura ambiente per indurire.

Dopo l’impostazione, sigillare la piastra di Petri e conservare a quattro gradi Celsius. Tagliare l’agarosio in blocchi cubicoli per l’uso al momento della dissezione. Innanzitutto, pulire l’area di dissezione utilizzando il 70% di etanolo.

Incollare il blocco di supporto o agarosio angolato sul vassoio vibratomo. Posizionare l’uovo sotto una luce intensa e individuare lo spazio pieno d’aria sul lato più grande o più rotondo dell’uovo, quindi rompere il guscio sullo spazio pieno d’aria ed esporre il sacco della membrana. Fai una leggera incisione nel sacco per esporre il becco.

Con un bisturi, tirare delicatamente il collo e la testa fuori dall’uovo. Dopo la decapitazione, pulire la testa con dACSF refrigerato. Tenere la testa ferma in dACSF refrigerato ed effettuare un’incisione rostrocaudale.

Inizia l’incisione dietro e tra gli occhi e segui la lunghezza del collo raccolto. Separare la pelle per esporre il cranio. Taglia il cranio dietro l’occhio in linea mediana verso la direzione laterale.

Ripetere l’operazione per entrambi gli emisferi. Tagliare la porzione rostrale del cranio posizionando la lama dietro gli occhi e facendo un taglio rapido. Quindi immergere la testa in un piatto di dACSF refrigerato.

Usando un paio di piccole forbici, fai incisioni da mezzina a laterale nella regione caudale del cranio per separare il cervello senza causare danni ai tessuti. Esporre delicatamente il tronco cerebrale e il cervelletto. Ritrarre l’area dorsale dell’intero cranio.

Rimuovere il tronco cerebrale ed esporlo spazzolando delicatamente con un pennello fine. Utilizzare una pinza curva per pulire il tronco cerebrale dal collegamento di tessuti e vasi sanguigni. Separare il tronco cerebrale dal cervelletto tagliando i peduncoli e rimuovendo accuratamente i vasi sanguigni.

Tagliare il tronco cerebrale di vasi sanguigni aggiuntivi. Innanzitutto, posiziona la lama della vibratoma lungo l’asse orizzontale. Per le fette coronali, incollare il tronco cerebrale su un vassoio di affettatura sul lato rostrale, mantenendo verticale l’asse rostrocaudale.

Per le fette sagittali, mantenere verticale l’asse mediale laterale. Per le fette orizzontali, incollare il lato ventrale mantenendo verticale l’asse ventrale dorsale. Per ottenere il piano orizzontale sagittale angolare acuto, incollare il lato ventrale del tronco cerebrale in modo tale che l’asse dorsale ventrale sia verticale sul blocco di agarosio della superficie ipotenusa.

Incollare la superficie opposta del blocco di agarosio di fronte al vassoio di affettatura e mantenere l’asse rostrocaudale parallelo al bordo della lama. In alternativa al taglio con vibratomo, immergere il tronco cerebrale isolato in agarosio a basso punto di fusione del 4% a 40 gradi Celsius in una capsula di Petri di 35 x 10 millimetri. Dopo che l’agarosio si è solidificato, tagliare il blocco di agarosio del cubicolo usando una lama di rasoio affilata.

Incollare il blocco di agarosio sul suo lato rostrale mantenendo verticale l’asse rostrocaudale del tronco cerebrale. Prendi fette coronali fino a quando non viene vista la regione NM. Rimuovere il blocco di agarosio dalla colla con una lama affilata.

Con un ago sottile, posizionare delicatamente 0,5 microlitri di colorante blu toluidina sul NM per individuare i nuclei. Rimontare questo blocco sul vassoio di affettatura per fette sagittali o orizzontali. Identificare i nuclei rispetto alla regione colorata e sezionare il tronco cerebrale.

Dopo il sezionamento, posizionare le fette raccolte sequenzialmente da 200 a 300 micron in una camera affettata contenente ACSF per equilibrare per un’ora a temperatura ambiente. Le sezioni coronali del tessuto del tronco encefalico da un embrione di pollo E19 a 21 rappresentano le regioni di isofrequenza relative dei nuclei uditivi del tronco cerebrale dalla regione uditiva con frequenza caratteristica più bassa a quella più alta. Le fibre nervose uditive afferenti e la biforcazione degli assoni NM erano visibili.

È stato osservato anche il nucleo angolare. Nelle sezioni rostrali, il nucleo olivario superiore si trova lungo la regione laterale ventrale della fetta coronale. Nelle sezioni sagittali, NM e nucleo laminaris o NL sono stati identificati dove le fibre nervose uditive sono entrate nel gruppo di neuroni.

Il nucleo olivario superiore è stato identificato nella regione rostrolaterale. Sono state osservate regioni uditive a bassa e alta frequenza caratteristica da NM e NL lungo l’asse rostrocaudale. La fetta più mediale mostrava i ciuffi assonali omolaterali e controlaterali e il punto finale della regione uditiva.

Nelle fette orizzontali, NM e NL sono stati identificati verso la linea mediana e i neuroni sono stati distribuiti lungo l’asse mediale laterale. Fette di tessuto del tronco cerebrale ad angolo acuto da un piano orizzontale hanno mostrato i nuclei uditivi del tronco cerebrale attraverso una grande diffusione diagonale. Le immagini ingrandite hanno mostrato l’asse tonotopico dei nuclei uditivi lungo l’asse rostromediale-caudolaterale.

Assicurarsi che l’intero processo venga eseguito in dACSF refrigerato con ghiaccio continuamente bollente con ossigeno di carboidrati. Questo protocollo viene utilizzato per i ricercatori che studiano le proprietà anatomiche e biofisiche dei microcircuiti del tronco cerebrale in via di sviluppo, in particolare la relazione tra i principali nuclei uditivi.