Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti
12 luglio 2022
Qui presentiamo un protocollo per ottenere fette uditive non coronali del tronco cerebrale dell'embrione di pollo per lo studio delle proprietà tonotopiche e delle traiettorie di sviluppo all'interno di una fetta del tronco cerebrale. Queste sezioni includono sezioni sagittali, orizzontali e orizzontali/trasversali che comprendono regioni tonotopiche più grandi all'interno di un singolo piano di fette rispetto alle sezioni coronali tradizionali.
Questo metodo acquisisce fette vive del tronco cerebrale uditivo del pollo che comprende un gradiente più ampio di regione di frequenza nella stessa fetta. Queste fette sono adatte per esperimenti elettrofisiologici e anatomici con un asse tonotopico più grande. Questa metodologia aiuterà a comprendere lo sviluppo di microcircuiti nel tronco cerebrale uditivo.
Mentre l'anatomia è specifica per il pollo, altre specie aviarie come quaglie e uccelli canori hanno un'anatomia simile. Per iniziare, sterilizzare le uova con etanolo al 70% e incubarle a 38 gradi Celsius e al 50% di umidità. Quindi, impostare la velocità di gorgogliamento per l'ACSF in modo tale che il pH sia compreso tra 7,2 e 7,4 con un'osmolalità compresa tra 300 e 310 milliosmolari per litro.
Quindi mescolare cinque grammi di agarosio in 100 millilitri di dACSF. Sciogliere completamente l'agarosio a bagnomaria o nel microonde fino a quando l'agarosio inizia a gorgogliare. Versare l'agarosio fuso in una piastra di Petri fino ad uno spessore di cinque millimetri e conservare a temperatura ambiente per indurire.
Dopo l'impostazione, sigillare la piastra di Petri e conservare a quattro gradi Celsius. Tagliare l'agarosio in blocchi cubicoli per l'uso al momento della dissezione. Innanzitutto, pulire l'area di dissezione utilizzando il 70% di etanolo.
Incollare il blocco di supporto o agarosio angolato sul vassoio vibratomo. Posizionare l'uovo sotto una luce intensa e individuare lo spazio pieno d'aria sul lato più grande o più rotondo dell'uovo, quindi rompere il guscio sullo spazio pieno d'aria ed esporre il sacco della membrana. Fai una leggera incisione nel sacco per esporre il becco.
Con un bisturi, tirare delicatamente il collo e la testa fuori dall'uovo. Dopo la decapitazione, pulire la testa con dACSF refrigerato. Tenere la testa ferma in dACSF refrigerato ed effettuare un'incisione rostrocaudale.
Inizia l'incisione dietro e tra gli occhi e segui la lunghezza del collo raccolto. Separare la pelle per esporre il cranio. Taglia il cranio dietro l'occhio in linea mediana verso la direzione laterale.
Ripetere l'operazione per entrambi gli emisferi. Tagliare la porzione rostrale del cranio posizionando la lama dietro gli occhi e facendo un taglio rapido. Quindi immergere la testa in un piatto di dACSF refrigerato.
Usando un paio di piccole forbici, fai incisioni da mezzina a laterale nella regione caudale del cranio per separare il cervello senza causare danni ai tessuti. Esporre delicatamente il tronco cerebrale e il cervelletto. Ritrarre l'area dorsale dell'intero cranio.
Rimuovere il tronco cerebrale ed esporlo spazzolando delicatamente con un pennello fine. Utilizzare una pinza curva per pulire il tronco cerebrale dal collegamento di tessuti e vasi sanguigni. Separare il tronco cerebrale dal cervelletto tagliando i peduncoli e rimuovendo accuratamente i vasi sanguigni.
Tagliare il tronco cerebrale di vasi sanguigni aggiuntivi. Innanzitutto, posiziona la lama della vibratoma lungo l'asse orizzontale. Per le fette coronali, incollare il tronco cerebrale su un vassoio di affettatura sul lato rostrale, mantenendo verticale l'asse rostrocaudale.
Per le fette sagittali, mantenere verticale l'asse mediale laterale. Per le fette orizzontali, incollare il lato ventrale mantenendo verticale l'asse ventrale dorsale. Per ottenere il piano orizzontale sagittale angolare acuto, incollare il lato ventrale del tronco cerebrale in modo tale che l'asse dorsale ventrale sia verticale sul blocco di agarosio della superficie ipotenusa.
Incollare la superficie opposta del blocco di agarosio di fronte al vassoio di affettatura e mantenere l'asse rostrocaudale parallelo al bordo della lama. In alternativa al taglio con vibratomo, immergere il tronco cerebrale isolato in agarosio a basso punto di fusione del 4% a 40 gradi Celsius in una capsula di Petri di 35 x 10 millimetri. Dopo che l'agarosio si è solidificato, tagliare il blocco di agarosio del cubicolo usando una lama di rasoio affilata.
Incollare il blocco di agarosio sul suo lato rostrale mantenendo verticale l'asse rostrocaudale del tronco cerebrale. Prendi fette coronali fino a quando non viene vista la regione NM. Rimuovere il blocco di agarosio dalla colla con una lama affilata.
Con un ago sottile, posizionare delicatamente 0,5 microlitri di colorante blu toluidina sul NM per individuare i nuclei. Rimontare questo blocco sul vassoio di affettatura per fette sagittali o orizzontali. Identificare i nuclei rispetto alla regione colorata e sezionare il tronco cerebrale.
Dopo il sezionamento, posizionare le fette raccolte sequenzialmente da 200 a 300 micron in una camera affettata contenente ACSF per equilibrare per un'ora a temperatura ambiente. Le sezioni coronali del tessuto del tronco encefalico da un embrione di pollo E19 a 21 rappresentano le regioni di isofrequenza relative dei nuclei uditivi del tronco cerebrale dalla regione uditiva con frequenza caratteristica più bassa a quella più alta. Le fibre nervose uditive afferenti e la biforcazione degli assoni NM erano visibili.
È stato osservato anche il nucleo angolare. Nelle sezioni rostrali, il nucleo olivario superiore si trova lungo la regione laterale ventrale della fetta coronale. Nelle sezioni sagittali, NM e nucleo laminaris o NL sono stati identificati dove le fibre nervose uditive sono entrate nel gruppo di neuroni.
Il nucleo olivario superiore è stato identificato nella regione rostrolaterale. Sono state osservate regioni uditive a bassa e alta frequenza caratteristica da NM e NL lungo l'asse rostrocaudale. La fetta più mediale mostrava i ciuffi assonali omolaterali e controlaterali e il punto finale della regione uditiva.
Nelle fette orizzontali, NM e NL sono stati identificati verso la linea mediana e i neuroni sono stati distribuiti lungo l'asse mediale laterale. Fette di tessuto del tronco cerebrale ad angolo acuto da un piano orizzontale hanno mostrato i nuclei uditivi del tronco cerebrale attraverso una grande diffusione diagonale. Le immagini ingrandite hanno mostrato l'asse tonotopico dei nuclei uditivi lungo l'asse rostromediale-caudolaterale.
Assicurarsi che l'intero processo venga eseguito in dACSF refrigerato con ghiaccio continuamente bollente con ossigeno di carboidrati. Questo protocollo viene utilizzato per i ricercatori che studiano le proprietà anatomiche e biofisiche dei microcircuiti del tronco cerebrale in via di sviluppo, in particolare la relazione tra i principali nuclei uditivi.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per ottenere sezioni del tronco encefalico uditive non coronali da embrioni di pollo, finalizzato all'analisi delle proprietà tonotopiche e delle traiettorie di sviluppo. L'approccio consente di esaminare regioni tonotopiche più ampie all'interno di una singola sezione del tronco encefalico rispetto ai metodi tradizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Elettrofisiologia
Sfondo
- Lo sviluppo del tronco encefalico uditivo è fondamentale per l'elaborazione delle frequenze sonore.
- Gli embrioni di pollo costituiscono un modello adeguato grazie alle loro caratteristiche anatomiche simili a quelle di altre specie di uccelli.
- I metodi tradizionali di sezione coronale limitano l'analisi dei modelli tonotopici.
- Questo protocollo mira a superare tali limitazioni e a migliorare la comprensione dei microcircuiti.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per ottenere sezioni che mantengano le caratteristiche in vivo del cervello uditivo.
- Facilitare lo studio delle traiettorie di sviluppo delle regioni coinvolte nell'elaborazione uditiva.
- Migliorare la comprensione delle proprietà anatomiche e biofisiche dei circuiti del cervello uditivo.
Metodi Utilizzati
- Acquisizione di fette vive del tronco encefalico mediante tecniche di sezionamento con vibratomo.
- Utilizzo di embrioni di pollo come modello biologico.
- Alcuni passaggi includono sterilizzazione, inclusione in agarosio e accurata dissezione dei tessuti del tronco encefalico.
- Le fette di tessuto del tronco encefalico vengono equilibrate in ACSF prima dell'esperimento.
- Attenzione a nuclei uditivi specifici e alla loro organizzazione tonotopica in fette tematiche.
Risultati principali
- Dimostrata la capacità di produrre sezioni che comprendono più regioni tonotopiche in un unico piano.
- Consentito l'osservazione di nuclei uditivi fondamentali, come il nucleo angolare e il nucleo olivare superiore.
- Messa in evidenza l'organizzazione delle fibre del nervo uditivo e il loro ruolo nella tonotopia.
Conclusioni
- Questo protocollo consente studi anatomici e funzionali dettagliati del tronco encefalico uditivo.
- Facilita la comprensione delle relazioni tra i diversi nuclei uditivi e i loro processi di sviluppo.
- Implicazioni per ulteriori ricerche sui meccanismi di sviluppo neurologico nelle specie aviarie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il mantenimento dei gradienti tonotopici in sezioni dell'encefalo uditivo di embrioni di pollo consente una valutazione più completa dello sviluppo dei microcircuiti e dell'organizzazione neuronale specifica per frequenza. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella validazione precoce di bersagli nello sviluppo neurologico e supporta la continuità traslazionale nella ricerca sul sistema uditivo. La capacità del metodo di mantenere gradienti di frequenza più ampi all'interno di una singola sezione lo rende uno strumento prezioso per la riduzione del rischio meccanicistico nei portafogli di ricerca e sviluppo incentrati sulla neurobiologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dell'organizzazione tonotopica e dello sviluppo dei microcircuiti in regioni di frequenza più ampie.
- Supporta la validazione funzionale delle strutture bersaglio preservando la diversità anatomica e biofisica all'interno di singole sezioni.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico consentendo l'analisi simultanea di nuclei uditivi multipli.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce sistemi tissutali validati per saggi elettrofisiologici e anatomici rivolti ai percorsi udittivi.
- Migliora la riproducibilità dei saggi standardizzando l'orientamento delle sezioni e la copertura tonotopica.
- Consente il confronto quantitativo delle proprietà neuronali lungo l'asse tonotopico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia nello sviluppo e nella funzione del sistema uditivo.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mantenendo gradienti simili a quelli in vivo.
- Riduce il rischio di traduzione clinica consentendo un'analisi dei microcircuiti più fisiologicamente rilevante.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di sezionamento si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo studi meccanicistici precoci, lo sviluppo di saggi e ricerche traslazionali sui circuiti del tronco encefalico uditivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'organizzazione tonotopica e sulla maturazione dei microcircuiti.
- Screening: Fornisce sezioni riproducibili che preservano i gradienti, idonee per saggi elettrofisiologici e anatomici successivi.
- Analisi: Fornisce output quantitativi per confrontare le proprietà neuronali tra diverse regioni di frequenza.
- Ricerca traslazionale: Mantiene fedeltà allo sviluppo e all'anatomia per l'allineamento con modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo standardizzato e adattabile alle diverse esigenze della ricerca neurosviluppativa.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nella validazione dei bersagli del sistema uditivo.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione della preparazione di fette del tronco encefalico.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione consentendo studi meccanicistici robusti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio dei bersagli e modelli neurosviluppali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di dissezione embrionale e di taglio al vibratomo.
- Necessita l'accesso a strumentazione specializzata per la preparazione e l'analisi di tessuti vivi.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo all'orientamento delle sezioni e all'identificazione dell'asse tonotopico.
- Adattabile ad altre specie di uccelli con anatomia del tronco encefalico uditivo simile.
- Dipende dal mantenimento di condizioni fisiologiche durante tutte le fasi di manipolazione e taglio del tessuto.
