Valutazione della risposta uditiva del tronco cerebrale nei cuccioli di pollo

Abbiamo usato tecniche standard di risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) e le abbiamo applicate ai polli da cova, un modello aviario precoce per la funzione uditiva. Il protocollo delinea in dettaglio le tecniche di preparazione degli animali e di acquisizione ABR, con passaggi che potrebbero tradursi in altri modelli aviari o roditori.

Questo protocollo combina una metodologia clinicamente rilevante con un modello di ricerca animale ben consolidato. Aiuterà a rispondere alle domande sullo sviluppo e il perfezionamento uditivo e sui cambiamenti funzionali nell'udito a seguito della manipolazione genetica. Questa tecnica non è invasiva, quindi non richiede alcun intervento chirurgico e potrebbe essere combinata con ulteriori esperimenti.

Inoltre, ci vuole solo circa un'ora per eseguire. Questo metodo potrebbe essere utilizzato su qualsiasi piccola specie di uccelli. Quindi la fisiologia comparativa è relativamente facile.

Il pollo ABR può anche valutare l'effetto sull'udito funzionale a seguito di manipolazione genetica. Inizia acquisendo uova di gallina livorno bianche fecondate. Quindi, incubare l'uovo a 38 gradi Celsius e umidità del 50% per 21 giorni prima della data di test desiderata.

Una volta che l'uovo è schiuso, pesare l'animale mettendolo delicatamente in una grande barca di pesatura. Dopo l'iniezione di anestesia, rimettere l'animale nell'incubatrice. Quindi controlla se il collo è zoppicante e pizzica la punta dell'animale usando una pinza.

Come passo successivo, determina il sesso del pollo usando le sue penne alari. Successivamente, applicare la crema depilatoria con un applicatore di punta di cotone sulla zona della testa e del collo, specialmente vicino all'apertura dell'orecchio per l'uccello. Ora usa salviette alcool isopropilico al 70% per pulire le piume, l'eventuale crema depilatoria rimanente e la pelle della testa e del collo.

Inoltre, sterilizzare gli elettrodi sottodermici e la sonda rettale utilizzando una salvietta alcool isopropilico al 70%. Posizionare l'animale in una camera di isolamento acustico e schermata elettricamente, assicurando che l'ambiente abbia un rumore elettrico e acustico minimo per le migliori registrazioni. Utilizzare una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea degli animali.

Ora inserisci la sonda rettale e fissa la testa dell'animale in posizione o appoggia il becco contro un oggetto per evitare movimenti indesiderati. Quindi assicurarsi che la camera di controllo della temperatura mantenga la temperatura dell'animale tra 37 e 41 gradi Celsius. Utilizzare tre elettrodi ad ago in acciaio inossidabile, cloruro d'argento come elettrodi di riferimento, attivi e comuni.

Posizionare ogni elettrodo sottodermicamente da due a tre millimetri nella testa, ma non abbastanza in profondità da penetrare nel cranio, quindi estrarre l'elettrodo dalla pelle, esponendo la punta. Per la registrazione a canale singolo, posizionare l'elettrodo attivo sopra il cranio sulla linea mediana fino al condotto uditivo. Posizionare l'elettrodo di riferimento dietro l'orecchio dove verrà erogato lo stimolo e posizionare l'elettrodo di terra dietro l'orecchio controlaterale nel collo.

Ora controlla l'impedenza dell'elettrodo. Assicurarsi che l'impedenza complessiva dell'elettrodo non superi i cinque kilo ohm. Inoltre, mantenere l'impedenza interelettrode al di sotto di tre chili ohm.

Per la registrazione ABR, a seconda dell'hardware e del software di acquisizione, assicurarsi di calibrare i livelli sonori corretti tra le frequenze di stimolo utilizzate. Ora sposta l'apparato del trasduttore sonoro verso l'orecchio attivo dell'animale e posizionalo in una profondità ridotta di due millimetri nel condotto uditivo. Infine, controlla l'animale durante i test.

Se i risultati appaiono anormali o assenti, riposizionare il trasduttore sonoro nel condotto uditivo. Innanzitutto, apri il software per acquisire le registrazioni ABR. Impostare i limiti superiore e inferiore di rifiuto dell'artefatto a circa 25 microvolt, in modo che l'animale, il movimento o il rumore durante una sweep escludano tale sweep dall'analisi.

Raccogli almeno 1024 sweep per ottenere una risposta media grande che può essere eseguita in due registrazioni di 512 sweep ciascuna. Ciò garantisce che la risposta sia evocata e ripetibile dallo stimolo. Nelle impostazioni dell'amplificatore del software, impostare il guadagno su 100.000, il filtro passa-basso su 3.000 Hertz e il filtro passa alto su 100 Hertz.

Impostare la frequenza di presentazione dello stimolo tra 10 e 20 stimoli al secondo e la durata dello stimolo del clic su 100 microsecondi. Quindi, impostare la frequenza di campionamento su 40 kilohertz, 25 microsecondi per i dati di risoluzione migliore e impostare la polarizzazione dello stimolo su alternata. Se si registrano 512 sweep, combinare due test separati per creare una media di sweep 1, 024 e continuare a registrare a intensità sempre più basse fino a quando il potenziale evocato non può più essere identificato.

Abbassare l'intensità dello stimolo con passi di cinque decibel di livello di pressione sonora per trovare l'intensità di stimolo più bassa che suscita una risposta evocata. Definisci la soglia ABR come l'intensità di stimolo più bassa che suscita una risposta evocata rilevabile. Dopo l'eutanasia e la decapitazione dell'animale e l'esperimento pulendo la piastra riscaldante, la sonda rettale e gli elettrodi di cloruro d'argento con salviette alcool isopropilico al 70%, assicurarsi che tutte le tracce acquisite siano state salvate.

Questa cifra rappresenta il clic ABR. La latenza di picco dell'onda I è aumentata di circa 0,3 millisecondi per ogni diminuzione di 20 decibel dell'intensità dello stimolo. Wave I ha anche presentato la più grande ampiezza di picco e la più bassa variabilità di latenza di picco di tutti i picchi di forma d'onda.

Il grafico mostra il tono scoppiato evocato ABR. La migliore risposta è stata vista a 1.000 Hertz. La figura dimostra che se la temperatura corporea non viene mantenuta, le funzioni di intensità della latenza dell'ABR sono altamente variabili e spesso imprecise.

La figura mostra che gli ABR registrati da piccoli di meno di tre ore, etichettati come P1, hanno latenze di picco significativamente prolungate e ampiezze di picco ridotte rispetto ai piccoli più vecchi, etichettati come P2. La figura confronta le tracce di clic del livello di pressione sonora di 75 decibel nello stesso animale con diversi posizionamenti degli elettrodi di riferimento. L'ampiezza del picco dell'onda II per il posizionamento del mastoide si è verificata un millisecondo dopo il picco dell'onda II per il posizionamento del collo. Questa differenza di tempo probabilmente riflette i siti di generazione neurale ABR rispetto al posizionamento dell'elettrodo.

Le risposte tra le due orecchie erano simili con piccoli cambiamenti nelle ampiezze di picco probabilmente dovuti al posizionamento degli auricolari. La latenza dell'orecchio sinistro e destro equivalente supporta la funzione altrettanto sana di entrambe le orecchie e degli emisferi del tronco cerebrale nel pollo da cova. Il corretto posizionamento del trasduttore sonoro può distinguere tra risultati buoni e nulli.

L'ABR di pollo dovrebbe essere robusto con un buon rapporto segnale-rumore. Tutte le domande affrontate dagli studi ABR in altre specie aviarie possono essere applicate al pollo. Inoltre, la ricerca di fisiologia molecolare nel pollo embrionale può incorporare questa metodologia in vivo.