Name: Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Scopri la preparazione di colture primarie di astrociti e microglia da cortecce di ratto per studiare la segnalazione del calcio intracellulare nella sclerosi laterale amiotrofica. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale delle dinamiche cellulari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e dello Sviluppo Tecnologico Repubblica di Serbia Contratto n. 451-03-9/2021-14/ 200178, dal progetto FENS - NENS Education and Training Cluster "Corso Trilaterale sulla Glia nella Neuroinfiammazione" e dalla sovvenzione EC H2020 MSCA RISE #778405. Ringraziamo Marija Adžić e Mina Perić per aver fornito le immagini di immunoistochimica e Danijela Bataveljić per l'aiuto nella scrittura di articoli.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive UE sulla protezione degli animali per scopi scientifici e con il permesso della Commissione etica della Facoltà di Biologia, Università di Belgrado (numero di approvazione EK-BF-2016/08). Per quanto riguarda il materiale del paziente (sieri per IgG), è stato raccolto per l'esame clinico di routine con il consenso informato del paziente in conformità con il Codice etico dell'Associazione medica mondiale (Dichiarazione di Helsinki) per gli esperimenti che coinvolgono esseri umani. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico del Centro clinico della Serbia (n. 850/6).
1. Preparazione della coltura cellulare primaria
<ol><li>Isolamento del tessuto cerebrale NOTA: l'isolamento deve essere eseguito su ghiaccio, utilizzando soluzioni ghiacciate.<ol><li>Utilizzare cuccioli appena nati di 1-3 giorni per la coltura cellulare neonatale primaria33. NOTA: Per lo studio qui presentato, sono stati utilizzati Sprague Dawley hSOD1G93A e ratti non transgenici. Per la genotipizzazione, le code di ratto sono state utilizzate per la successiva estrazione del DNA e la PCR.</li>
		<li>Cospargere la testa del cucciolo con etanolo al 70% e decapitarlo immediatamente velocemente usando le forbici.</li>
		<li>Tagliare la pelle usando forbici ad angolo piccolo per esporre il cranio. Apri il cranio facendo un taglio dal forame magno verso le orbite . Quindi, esegui un taglio perpendicolare della linea mediana. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente soluzione salina tamponata fosfato (PBS). NOTA: Pulire gli strumenti tra i cuccioli per evitare la contaminazione incrociata tra cuccioli transgenici e non transgenici. L'isolamento delle cortecce dal resto del cervello dovrebbe essere fatto sotto uno stereomicroscopio.</li>
		<li>Usando la punta della pinza, strappare le connessioni tra i due emisferi. Quindi, separare gli emisferi con una pinza curva spingendo delicatamente un emisfero dal centro verso il lato.</li>
		<li>Rimuovere le meningi strappandole con cura con una pinza dritta e curva.</li>
		<li>Rimuovere l'ippocampo pizzicandolo con una pinza curva. Scartare l'ippocampo o usarlo per un'altra preparazione di coltura cellulare. NOTA: Ulteriori passaggi devono essere eseguiti sotto la cappa a flusso laminare per garantire condizioni sterili.</li>
	</ol></li>
	<li>Omogeneizzazione e dissociazione dei tessuti<ol><li>Trasferire una corteccia in un tubo da 15 mL riempito con 3 mL di PBS freddo. Pipet la sospensione su e giù con una punta da 1 ml, completando 10-15 colpi fino a quando la sospensione diventa omogenea. NOTA: Prestare molta attenzione a non produrre bolle in questo processo.</li>
		<li>Centrifugare a 500 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di PBS freddo pipettandolo su e giù con una punta da 1 ml. Ripetere la fase di centrifugazione. NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate da questo punto devono essere preriscaldate a 37 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di DMEM (Modified Eagle Medium) completo di Dulbecco integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e antibiotici (penicillina e streptomicina). Trasferire l'omogenato in una provetta da 2 ml.</li>
		<li>Passare l'omogenato attraverso aghi da 21 G e 23 G (tre volte ciascuno) per fare una sospensione di singole cellule. NOTA: Prestare molta attenzione a non produrre bolle in questo processo.</li>
	</ol></li>
	<li>Versare la sospensione cellulare preparata da una corteccia in una capsula di Petri di 60 mm di diametro o in un matraccio T25 (con la superficie pretrattata con un rivestimento polipeptidico per la crescita di cellule aderenti) contenente 3 ml di DMEM completo. Agitare leggermente la capsula di Petri in modo che la sospensione sia uniformemente distribuita.</li>
	<li>Far crescere le cellule nell'incubatore in atmosfera umidificata al 5% di CO2/95% di aria a 37 °C.</li>
	<li>Cambiare il mezzo 48 ore dopo l'isolamento e sostituire il mezzo ogni 3 giorni.</li>
	<li>Per promuovere la crescita degli astrociti, quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza, lavarle con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule gliali debolmente attaccate e le tracce di FBS nel mezzo.<ol><li>Tripsinizzare lo strato sottostante di astrociti aggiungendo 1 ml di soluzione di tripsina preriscaldata (0,25% tripsina, 0,02% EDTA in PBS, filtrata sterile).</li>
		<li>Posizionare il piatto nell'incubatrice a 37 °C per 2-5 min.</li>
		<li>Controlla le cellule al microscopio. Quando iniziano a staccarsi, aggiungere 4 ml di DMEM completo.</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 500 × g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo. Contare le cellule usando un emocitometro.</li>
		<li>Riplaccare le celle ad una densità di 104 cellule/cm2 in 5 ml di DMEM completo fresco.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Per ridurre al minimo la presenza di altri tipi di cellule gliali, dopo che gli astrociti hanno raggiunto il 50% di confluenza e prima di ogni sostituzione del mezzo, lavare le cellule con DMEM completo.<ol><li>Aspirare il mezzo surnatante con una pipetta da 1 mL e erogarlo delicatamente sullo strato di cellule più volte. Assicurarsi che l'intera superficie dello strato cellulare sia coperta durante questa fase di lavaggio.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza (di solito dopo 14 giorni), ripetere la tripsinizzazione e la raccolta di astrociti come descritto al punto 1.6.</li>
	<li>Seme 5 × 103 di astrociti su un coprislip circolare di vetro di 7 mm rivestito con poli-L-lisina (50 μg/ml). Usali in esperimenti dopo 48 ore.</li>
	<li>Per promuovere la microglia, dopo il passaggio 1.7, consentire alle cellule gliali di raggiungere uno strato confluente34. Quando le cellule microgliali appaiono sopra lo strato di astrociti (dopo 10-15 giorni, riconosciute dai loro corpi più piccoli e più ovali e dai processi più brevi), agitare la capsula di Petri su uno shaker orbitale per 2 ore a 220 giri / min.</li>
	<li>Disperdere e seminare cellule microgliali<ol><li>Lavare leggermente le cellule staccate e attaccate liberamente aspirando il mezzo surnatante con una punta di pipetta da 1 mL e erogarlo delicatamente sullo strato di cellule più volte. Assicurarsi di coprire l'intera superficie dello strato cellulare durante questa fase di lavaggio, raccogliere il mezzo con le celle staccate e trasferirlo in un tubo da 15 ml.</li>
		<li>Centrifugare a 500 × g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno.</li>
		<li>Far passare la sospensione cellulare attraverso un ago da 21 G per ottenere una sospensione a cellula singola. NOTA: La maggior parte dei metodi pubblicati utilizza tripsina o papaina per dissociare il tessuto; tuttavia, gli aghi 21 G hanno il vantaggio di prevenire la sovradigestione delle cellule, consentendo una dissociazione più delicata.</li>
		<li>Contare le cellule usando un emocitometro. Seme 5 × 103 cellule microgliali su un coprislip circolare di vetro di 7 mm rivestito con poli-L-lisina (50 μg/ml). Usali in esperimenti dopo 48 ore. NOTA: È difficile ottenere una coltura microgliale pura agitando, poiché le cellule precursori degli oligodendrociti e gli astrociti possono essere ancora presenti in numero variabile a seconda dell'esperienza dello sperimentatore. Il protocollo immunocitochimico utilizzato per stimare la presenza di diverse popolazioni cellulari in colture gliali è stato descritto altrove35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Immunocitochimica
<ol><li>Risciacquare le celle placcate su coprivetrini in PBS, 2 x 1 min.</li>
	<li>Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavare in PBS 3 x 5 min.</li>
	<li>Incubare in una soluzione bloccante contenente il 10% di siero normale d'asina (NDS)/l'1% di albumina sierica bovina (BSA)/lo 0,1% di Triton X-100 per 45 minuti a RT.<ol><li>Aggiungere 50 μL di una soluzione bloccante per coprislip di 10 mm di diametro.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare anticorpi primari in 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 nelle seguenti diluizioni: mouse anti-GFAP 1:300, capra anti-Iba1 1:500. Incubare le cellule con anticorpi primari durante la notte a +4 °C.</li>
	<li>Risciacquare in PBS, 3 x 10 min.</li>
	<li>Incubare con gli anticorpi secondari coniugati con un fluoroforo: asino anti-topo (eccitazione 488 nm [1:200)) o asino anti-capra (eccitato a 647 nm [1:200)). Incubare le cellule per 2 ore a RT al buio.</li>
	<li>Lavare in PBS, 7 x 5 min.</li>
	<li>Incubare le cellule con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1:4.000) per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Lavare in PBS 5 x 5 min.</li>
	<li>Montare i vetrini sui vetrini del microscopio utilizzando una soluzione di montaggio; Usane una goccia per ogni foglietto. NOTA: le diluizioni degli anticorpi possono variare a seconda del produttore. Gli utenti devono determinare le diluizioni ottimali per i loro esperimenti.</li>
</ol>3. Imaging video time-lapse
NOTA: Le soluzioni contenenti il colorante fluorescente devono essere protette dalla luce diretta. Prima di iniziare l'esperimento di imaging, assicurarsi che il vetrino di copertura non si muova quando si attiva la perfusione.
<ol><li>Preparazione di soluzioni e celle<ol><li>Preparare la soluzione extracellulare (ECS) per l'imaging: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio e 10 mM HEPES. Regolare il pH a 7,4. Assicurarsi che l'osmolarità sia 280-300 mOsm/kg e preparare ECS senza Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio, 10 mM HEPES e 0,1 mM EGTA.</li>
		<li>Preparare le soluzioni di prova: 100 μM di ATP disciolto in ECS, 1 μM Thg in ECS senza Ca2+ e 0,1 mg/mL di ALS IgG in ECS8.</li>
		<li>Trasferire un foglietto su un piatto con ECS per lavare il DMEM completo. Preparare la soluzione di caricamento del colorante diluendo 1 mM di soluzione madre di Fluo-4 AM con ECS fino alla concentrazione finale di 5 μM Fluo-4 AM.<ol><li>Posizionare il coprislip con le celle nella soluzione di caricamento del colorante per 30 minuti a RT al buio. Lavare le celle in ECS per 20 minuti.</li>
		</ol></li>
		<li>Se le celle non sono adeguatamente caricate (cioè se il livello basale di fluorescenza è troppo basso, <5% della gamma dinamica della telecamera con tempo di esposizione superiore a 400 ms), aumentare il tempo di caricamento fino a 45 minuti a 1 ora a 37 °C. In alternativa, miscelare la soluzione madre di Fluo-4 AM con un volume uguale di detergente al 20% (p/v) (Pluronico) in DMSO prima di diluire in ECS, ottenendo la concentrazione Pluronica finale ~0,02%. NOTA: Gli esempi sperimentali di questo studio sono stati eseguiti con IgG umane isolate da sieri sanguigni di pazienti affetti da SLA come descritto in precedenza 4,5,11. Ogni esperimento è stato eseguito con campioni di IgG di un singolo paziente.</li>
	</ol></li>
	<li>Immagini video NOTA: In questo protocollo, il sistema di imaging video è stato combinato con una lampada ad arco corto allo xeno, un sistema policromatore e un microscopio a epifluorescenza invertita dotato di acqua, glicerina e obiettivo ad immersione in olio. L'imaging timelapse è stato eseguito utilizzando un sistema di fotocamere digitali.<ol><li>Accendere i componenti della configurazione di imaging 15 minuti prima dell'esperimento per consentire al sistema di raggiungere la temperatura di lavoro.</li>
		<li>Introdurre il coprislip nella camera di registrazione con 1 mL di soluzione di lavoro (ECS o ECS senza Ca2+).</li>
		<li>Per scegliere il protocollo di imaging corretto, aprire il software di imaging e nel pannello Acquisizione, scegliere le coppie di filtri per Fluo4-AM con una lunghezza d'onda di eccitazione a 480 nm, uno specchio dicroico a 505 nm e una lunghezza d'onda di emissione a 535 nm. </li>
		<li>Scegli il campo visivo avendo cura di avere un numero consistente di celle durante tutto l'esperimento. Regolare il tempo di esposizione e il guadagno del rilevatore in modo appropriato, in modo tale che il segnale non sia saturo. Scegliere la modalità pseudocolore per l'acquisizione. Per istruzioni più dettagliate, fare riferimento al manuale fornito dal produttore.</li>
		<li>Regolare la frequenza di campionamento su 1 Hz (1 fotogramma al secondo).</li>
		<li>Iniziare l'imaging acquisendo il livello basale di fluorescenza per 3-5 minuti per la determinazione basale (F0). Garantire un flusso costante della soluzione di lavoro.</li>
		<li>Arrestare il flusso della soluzione di lavoro e passare alla soluzione di prova per il periodo di tempo desiderato (vedere anche le barre temporali negli esempi della Figura 2 e della Figura 3). Tra una soluzione di prova e l'altra, lavare le celle con un flusso costante della soluzione di lavoro per 3-5 minuti.</li>
		<li>Mantenere il volume della soluzione nella camera di registrazione a ~1 mL organizzando un'aspirazione costante dalla parte superiore della soluzione (vedere Figura 2E). NOTA: Per applicare il trattamento direttamente alle celle riprese, è stato posizionato un sistema di erogazione personalizzato costituito da una pipetta di vetro (diametro interno 0,8 mm) a ~350 μm di distanza e ~1 mm sopra le celle, con un angolo di 45° combinato con il sistema di scambio della soluzione contenente valvole a manicotto e un controller elettronico della valvola (vedere Figura 2E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>Definire un'area di interesse (ROI) corrispondente alla singola cella.<ol><li>Scegli il fotogramma con la più alta intensità di segnale (cioè dall'applicazione di ATP) e cerchia una cella utilizzando l'applicazione Polygonal Tool. Ripetere l'operazione per tutte le celle nel campo acquisito. Scegli cinque ROI in background utilizzando lo strumento Cerchio.</li>
		<li>Per misurare l'intensità media del segnale di una singola cella e lo sfondo per ogni intervallo di tempo, selezionare tutti i ROI e utilizzare il comando Multi Measure in ROI Manager in ImageJ o qualsiasi comando equivalente nel software commerciale (vedere la tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Esporta i valori medi di intensità del segnale dei ROI come foglio di calcolo.</li>
	<li>Calcola la media di cinque ROI di sfondo e sottrai lo sfondo medio di ciascun fotogramma dall'intensità media del ROI del fotogramma acquisito contemporaneamente.</li>
	<li>Per normalizzare i dati ottenuti al segnale di base, utilizzare l'equazione (1): ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1) dove F è l'intensità del segnale di ogni intervallo di tempo dopo la sottrazione dello sfondo e F0 è la fluorescenza Fluo-4 di base. NOTA: in questo studio è stato utilizzato un codice personalizzato.</li>
	<li>Per analizzare l'attività del calcio, determinare diversi parametri4: l'ampiezza del picco del calcio (ΔF/F 0), la variazione integrata (integrale temporale, superficie sotto la registrazione della risposta) del transitorio di calcio (ΔF/F 0 × s), tempo trascorso dal momento al picco dall'inizio della stimolazione al massimo del transitorio di calcio (s), tempo di aumento trascorso dall'inizio della stimolazione al valore di ΔF/F 0 che raggiunge il 50%-80% dell'ampiezza massima (s), mezza larghezza-larghezza completa di un transitorio a metà ampiezza massima (s), frequenza delle risposte se sono ripetitive (Hz).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo articolo presenta il metodo di coltura cellulare primaria come uno strumento veloce e "economico" per studiare diversi aspetti della fisiologia cellulare (pato) come la SLA nel modello di ratto hSOD1G93A . La tecnica è quindi adatta per studi a livello di singola cellula che possono essere estrapolati e ulteriormente studiati a un livello superiore di organizzazione (cioè in fette di tessuto o in un animale vivo). La coltura cellulare come tecnica, tuttavia, ha alcuni avvertimenti. È fondamentale esegui...

Le tecniche di coltura cellulare hanno dato origine a numerosi progressi in diversi campi della neurofisiologia cellulare in salute e malattia. In particolare, le colture cellulari primarie, appena isolate dal tessuto neuronale di un animale da laboratorio, consentono allo sperimentatore di studiare da vicino il comportamento di diverse cellule in diversi mezzi biochimici e configurazioni fisiologiche. L'utilizzo di diversi indicatori fisiologici fluorescenti come i coloranti sensibili al Ca2+ in combinazione con la microscopia video time-lapse fornisce una migliore comprensione dei processi biofisici e biochimici cellulari in tempo reale.
La SLA è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce i motoneuroni superiori e inferiori1. La malattia presenta una patogenesi complessa di tipo familiare ma soprattutto della forma sporadica (90% dei casi)2. È noto che i meccanismi autonomi non cellulari contribuiscono alla fisiopatologia della SLA, principalmente a causa del ruolo essenziale delle cellule gliali3. La SLA è anche ben caratterizzata come una malattia neuroinfiammatoria con coinvolgimento di fattori umorali e cellulari di infiammazione.
L'immunoglobulina G è ampiamente usata come marcatore molecolare nella SLA e in altre malattie neurodegenerative. Studiare il livello sierico di questo marcatore può indicare la presenza e lo stadio della neuroinfiammazione nella malattia 4,5,6, mentre la sua presenza nel liquido cerebrospinale può indicare una rottura della barriera ematoencefalica7. Le IgG sono state anche identificate come depositi nei motoneuroni del midollo spinale dei pazienti con SLA7. Tuttavia, questo approccio ha mostrato alcune incongruenze nella correlazione del livello di IgG con lo stadio e le caratteristiche della malattia6.
Le IgG isolate dai sieri dei pazienti affetti da SLA (SLA IgG) possono indurre una risposta al calcio negli astrociti naïve8 e il rilascio di glutammato nei neuroni, indicando un effetto eccitotossico, un segno distintivo della patologia della SLA9. Tuttavia, gli studi sul modello di ratto hSOD1G93A ALS (contenente copie multiple della mutazione umana SOD110) hanno mostrato un numero di marcatori di stress ossidativo in cellule neurogliali in coltura11, tessuti 12,13,14 o animali vivi 13. È interessante notare che gli astrociti coltivati dal modello di ratto SLA erano più inclini allo stress ossidativo indotto dal perossido rispetto agli astroglia dei compagni di cucciolata non transgenici11.
Le cellule microgliali in coltura sono influenzate dalla SLA IgG in modo meno evidente. Vale a dire, una linea cellulare microgliale BV-2 ha mostrato un aumento del segnale dai marcatori fluorescenti dello stress ossidativo in risposta all'applicazione di soli 4/11 campioni di pazienti IgG ALS15. È noto che le microglia partecipano a molte patologie neuroinfiammatorie, aggiungendo stress ossidativo e fase di progressione tardiva nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA16,17. Tuttavia, i dati con le IgG della SLA hanno indicato che queste cellule potrebbero non essere reattive come gli astrociti a questi fattori umorali dell'infiammazione della SLA. Diversi studi sono stati condotti con astrociti primari da modelli murini di SLA, non solo nei cuccioli ma anche in animali sintomatici, sia sul cervello che sul midollo spinale 18,19,20,21. Questo vale anche per le colture primarie microgliali, anche se in misura minore rispetto agli astrociti e per lo più dalle regioni del cervello allo stadio embrionale22,23,24.
Usiamo l'imaging video time-lapse di Ca2+ su cellule in coltura principalmente come mezzo per seguire i transitori intracellulari di questo ione come marker fisiologico di eccitotossicità. Pertanto, mediante la caratterizzazione biofisica di questi transitori (ampiezza, area sotto transitoria, tempo di salita, frequenza) il ricercatore può ottenere parametri diagnostici sperimentali da diversi modelli cellulari di neurodegenerazione. Questa tecnica offre quindi il vantaggio di una valutazione fisiologica quantitativa delle IgG come biomarcatori della malattia. Esiste un ampio corpus di letteratura sul ruolo delle IgG e del Ca2+ nell'induzione della SLA. La maggior parte di questi studi sono stati condotti inducendo la SLA iniettando IgG del paziente in animali da esperimento 25,26,27,28,29, che hanno poi mostrato elevazione intracellulare di Ca 2+ e deposizioni di IgG. Una linea di studi ha esplorato l'effetto delle IgG di SLA sulla sinapsi motoria in vitro30,31,32. Nel contesto di cui sopra, la tecnica qui presentata pone l'attenzione sulle cellule gliali come attori importanti nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA e quantifica la loro potenziale risposta eccitotossica alle IgG come fattori umorali della neuroinfiammazione. Questo approccio può avere un'applicazione più ampia nel testare altri fattori umorali come sieri interi, liquori o citochine in diversi sistemi di coltura cellulare e in modelli cellulari di infiammazione generale.
Questo articolo descrive come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare ulteriormente queste cellule per studiare la fisiopatologia della SLA con IgG derivate dai sieri dei pazienti. I protocolli sono dettagliati per il caricamento del colorante delle cellule in coltura (Figura 1) e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video time-lapse. Esempi di registrazioni video mostreranno come le cellule gliali reagiscono alle IgG della SLA rispetto all'ATP, quest'ultimo attivando i recettori purinergici della membrana. Viene mostrato per la prima volta un esempio di come gli astrociti isolati dal cervello del ratto hSOD1G93A ALS reagiscono con una risposta Ca 2+ più pronunciata alle IgG di SLA rispetto ai controlli non transgenici e come correlare questo processo alle differenze nel funzionamento del negozio Ca2+. Viene anche mostrato un esempio di imaging del calcio nelle cellule microgliali acutamente sfidate con SLA IgG, con solo una modesta risposta di calcio intracellulare.

<table><tbody><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>Sarstedt, Germania</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 2 mL</td><td>Sarstedt, Germania</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 21 G</td><td>Nipro, Giappone</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 23 G</td><td>Nipro, Giappone</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 mL</td><td>Nipro, Giappone</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto circolare da 6 mm</td><td>Menzel Glasser, Germania</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 60 mm</td><td>ThermoFisher Sientific, USA</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 Anticorpo IgG</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" evolve"-EM 512 Sistema di fotocamere digitali</td><td>Fotometria, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Software</td><td>Open source ai sensi della GNU General Public License</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri FITC</td><td>Chroma Technology Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-Iba1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, Francia</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di scambio di soluzioni ad alta velocità</td><td>ALA Scientific Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Software Matlab</td><td>Math Works, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-GFAP</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e Streptomicina</td><td>ThermoFisher Sientific, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio</td><td>Carlo Erba Reagenti, Spagna</td><td>471686</td><td></td></tr><tr><td>Shaker DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio eptaidrato bibasico</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, Regno Unito</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging ViiFluor</td><td>Visitron System Gmbh, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema policromatore VisiChrome</td><td>Visitron System Gmbh, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView configurazione ad alte prestazioni</td><td>Visitron System Gmbh, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampada ad arco corto allo xeno</td><td>Ushio, Giappone</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Questo protocollo dimostra come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare queste cellule allo scopo di studiare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) nel modello di ratto hSOD1G93A . In primo luogo, il protocollo mostra come isolare e coltivare astrociti e microglia da cortecce postnatali di ratto, e quindi come caratterizzare e testare queste colture per la purezza mediante immunocitochimica utilizzando il marcatore glial fibrillary acidic protein (GFAP) degli astrociti e il marcatore microgliale ionizzato della molecola adattatore legante il calcio 1 (Iba1). Nella fase successiva, vengono descritti i metodi per il caricamento del colorante (Fluo 4-AM sensibile al calcio) delle cellule coltivate e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video su cellule vive.
Gli esempi di registrazioni video consistono in: (1) casi di imaging Ca2+ di astrociti in coltura acutamente esposti all'immunoglobulina G (IgG) isolata da pazienti affetti da SLA, che mostrano una risposta caratteristica e specifica rispetto alla risposta all'ATP come dimostrato nello stesso esperimento. Gli esempi mostrano anche un aumento transitorio più pronunciato della concentrazione intracellulare di calcio evocato da ALS IgG negli astrociti hSOD1G93A rispetto ai controlli non transgenici; (2) Imaging Ca 2+ di astrociti in coltura durante un esaurimento delle riserve di calcio da parte di thapsigargin (Thg), un inibitore non competitivo del reticolo endoplasmatico Ca 2+ ATPasi, seguito da ingresso di calcio operato dal magazzino indotto dall'aggiunta di calcio nella soluzione di registrazione, che dimostra la differenza tra il funzionamento del magazzino Ca 2+ in hSOD1G93A e negli astrociti non transgenici; (3) L'imaging Ca 2+ della microglia in coltura mostra prevalentemente una mancanza di risposta alle IgG di SLA, mentre l'applicazione di ATP ha provocato un cambiamento di Ca2+. Questo documento sottolinea anche possibili avvertimenti e precauzioni riguardanti la densità cellulare critica e la purezza delle colture, scegliendo la corretta concentrazione del colorante Ca2+ e le tecniche di caricamento del colorante.

Caratterizzazione di diversi tipi di cellule gliali in coltura Di solito ci vogliono 15-21 giorni per produrre astrociti per gli esperimenti, mentre le cellule microgliali impiegano 10-15 giorni per crescere. L'immunocolorazione è stata eseguita per valutare la purezza cellulare della coltura. La Figura 1 mostra l'espressione della doppia marcatura del marcatore astrocitico GFAP e del marcatore microgliale Iba1 nelle rispettive colture.
L'imagi...

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Questo protocollo consente di rivelare il modello di segnalazione intercellulare del calcio che caratterizza la risposta di ciascun tipo di cellula in salute e in malattia. Questa tecnica consente una caratterizzazione biofisica rapida e dettagliata del comportamento cellulare complesso. Abbiamo in programma di utilizzare questa segnalazione di calcio indotta da IgG come impronta digitale per la medicina personalizzata delle malattie neuroinfiammatorie.Nel contesto della vita reale, non è facile vedere e seguire tutti i processi e gli eventi, specialmente quelli che accadono al microscopio. Quindi, i dati visivi sono importanti. Dopo aver decapitato i cuccioli da uno a tre giorni, esporre il cranio aprendo la pelle con piccole forbici angolate.Quindi aprire il cranio tagliando il forame magno verso le orbite e fare un taglio perpendicolare della linea mediana. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS. Usa la punta della pinza per strappare le connessioni tra entrambi gli emisferi e separa gli emisferi con una pinza curva spingendo delicatamente un emisfero dal centro verso il lato.Utilizzare una pinza dritta e curva per rimuovere le meningi strappandole con cura. Quindi rimuovere l'ippocampo pizzicandolo con una pinza curva e scartarlo, o usarlo per un'altra preparazione di coltura cellulare. Successivamente, trasferire la corteccia in un tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri di PBS freddo e omogeneizzare il tessuto pipettando su e giù da 10 a 15 volte con una punta da un millilitro.Centrifugare le cellule a 500 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in tre millilitri di PBS freddo mediante pipettaggio con una punta da un millilitro. Centrifugare ancora una volta e risospendere il pellet in due millilitri di DMEM completo integrato con FBS al 10% e antibiotici.Dopo aver trasferito l'omogenato in un tubo da due millilitri, passare l'omogenato attraverso aghi di calibro 21 e 23 per creare una sospensione di singole cellule. Versare la sospensione cellulare preparata da una corteccia in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente tre millilitri di DMEM completo e agitare leggermente la capsula di Petri, in modo che la sospensione sia uniformemente distribuita. Incubare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria a 37 gradi Celsius.Per promuovere la crescita degli astrociti, rimuovere i vecchi mezzi e lavare la cellula con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule gliali debolmente attaccate e le tracce di FBS una volta raggiunta la confluenza dal 70 all'80%. Quindi tripsinizzare lo strato sottostante di astrociti aggiungendo un millilitro di soluzione di tripsina preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius per due o cinque minuti. Utilizzare un microscopio per verificare se le cellule iniziano a staccarsi e aggiungere quattro millilitri di DMEM completo.Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 15 millilitri. Quindi centrifugare il tubo a 500 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo completo.Contare le cellule usando un emocitometro. Quindi, preparare il piatto di coltura e aggiungere il terreno di coltura. Riplaccare le celle a una densità da 10 alla quarta cella per centimetro quadrato in cinque millilitri di DMEM completo fresco e lavare le celle con DMEM completo prima di ogni sostituzione del supporto.Dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza, ripetere la tripsinizzazione e seminare cinque volte 10 al terzo astrocita su un vetrino circolare rivestito di poli-L-lisina di sette millimetri. Lasciarli attaccare per 10 minuti e aggiungere DMEM completo. Usali negli esperimenti dopo 48 ore.Dopo aver preparato le colture microgliali, per promuovere la microglia, lasciare che le cellule gliali diventino confluenti e la microglia apparirà sopra lo strato di astrociti dopo 10-15 giorni. Agitare la capsula di Petri su uno shaker orbitale per due ore a 220 giri/min. Ora, lavare leggermente le cellule staccate e attaccate liberamente aspirando il surnatante con una punta di pipetta da un millilitro.Erogare delicatamente il surnatante sullo strato di cellule più volte, assicurandosi di coprire l'intera superficie dello strato cellulare durante questa fase di lavaggio. Raccogliere il mezzo con le celle staccate e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare, risospendere e contare le cellule come dimostrato in precedenza.Seminare cinque volte 10 alla terza microglia su un sottoveste circolare di vetro rivestito di poli-L-lisina di sette millimetri. Lasciarli attaccare per 10 minuti e aggiungere DMEM completo. Usali negli esperimenti dopo 48 ore.Per lavare il DMEM completo, trasferire un vetrino di copertura su un piatto con soluzione extracellulare. Preparare la soluzione di caricamento del colorante diluendo un millimolare Fluo-4 AM con soluzione extracellulare per ottenere la concentrazione finale di cinque micromolari. Posizionare il vetrino di copertura con le celle nella soluzione di caricamento del colorante per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e lavare le cellule in soluzione extracellulare per 20 minuti.Posizionare il foglietto di copertura nella camera di registrazione con un millilitro di soluzione di lavoro. Scegli il campo visivo con un numero consistente di celle durante l'esperimento. Avviare l'imaging e determinare la linea di base acquisendo il livello basale di fluorescenza per tre-cinque minuti.Quindi interrompere il flusso della soluzione di lavoro e passare alla soluzione di test per il periodo di tempo desiderato. Tra una soluzione di prova e l'altra, lavare le celle con un flusso costante della soluzione di lavoro per tre-cinque minuti. Mantenere il volume della soluzione nella camera di registrazione a un millilitro organizzando un'aspirazione costante dalla parte superiore della soluzione.Scegliete il fotogramma con intensità di segnale più alta e circondate una cella utilizzando l'applicazione dello strumento Poligonale. Dopo aver circondato tutte le celle nel campo acquisito, scegli cinque aree di interesse in background usando lo strumento Cerchio. Quindi misurare l'intensità media del segnale di una singola cella e lo sfondo per ciascun intervallo di tempo.Selezionare tutte le regioni di interesse e utilizzare il comando Multimisura in ROI Manager in ImageJ o qualsiasi comando equivalente nel software commerciale. Dopo aver importato i dati nel software MATLAB, fai la media di cinque ROI in background e sottrai lo sfondo medio di ciascun fotogramma dall'intensità ROI media dei fotogrammi acquisiti contemporaneamente. Successivamente, analizza l'attività del calcio determinando l'ampiezza del picco di calcio, il cambiamento integrato del transitorio di calcio, il tempo al picco, il tempo di salita, la mezza larghezza e la frequenza.GFAP è usato per visualizzare gli astrociti e Iba1 per visualizzare la microglia. Gli astrociti hSOD1G93A rispondono all'immunoglobulina G SLA con una maggiore ampiezza del transitorio di calcio, un cambiamento integrato complessivo più considerevole e un tempo di picco più breve rispetto agli astrociti non transgenici. La risposta alla SLA immunoglobulina G è distinguibile dalla risposta all'ATP.Gli astrociti hSOD1G93A avevano un livello più elevato di ioni calcio nelle scorte, come rivelato dall'esaurimento delle scorte, indicando un sovraccarico di questo ione. Le microglia sono state coltivate e l'intensità media della fluorescenza è stata estratta nel tempo. Le tracce di calcio di tre cellule rappresentavano che solo una cellula rispondeva all'immunoglobulina G della SLA, mentre tutte le cellule rispondevano all'ATP.Le immagini pseudo-a colori rappresentavano l'intensità della fluorescenza e la linea di base in risposta a SLA, IgG e ATP. Le celle devono essere adeguatamente caricate e i parametri del sistema di imaging devono essere opportunamente regolati, in modo che il segnale non venga separato durante l'esperimento. Insieme all'emissione di calcio, è possibile eseguire il bloccaggio dei cerotti.Pertanto, è possibile ottenere un quadro più completo della correlazione tra le diverse correnti ioniche di membrana e l'emissione di calcio. La comprensione dell'omeostasi intracellulare del calcio è di fondamentale importanza per l'esplorazione di diverse risposte a stimoli naturali, stressanti ed esterni.

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Qui forniamo un protocollo per la coltura di neuroni corticali di ratto in presenza di uno strato alimentatore gliali. I neuroni coltivati ​​stabilire la polarità e di creare le sinapsi, e può essere separato dalla glia per l'utilizzo in diverse applicazioni, quali elettrofisiologia, imaging del calcio, saggi di sopravvivenza cellulare, immunocitochimica, e RNA / DNA / isolamento delle proteine.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per...

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Il video dimostra una tecnica per la coltura di astrociti primari dalla corteccia del ratto. La corteccia viene dissociata meccanicamente per ottenere una sospensione omogenea di cellule gliali, che viene poi placcata su piastre rivestite di polipeptidi per promuovere la proliferazione selettiva degli astrociti. Successivamente, gli astrociti vengono dissociati enzimaticamente dalle piastre e trasferiti in terreni freschi, consentendo la coltura di astrociti puri.

Generare una coltura primaria di astrociti dal cervello di un cucciolo di ratto

Questo video mostra un metodo per isolare e coltivare microglia da cervelli di ratto. Comporta la separazione della microglia da altre cellule neuronali e non neuronali utilizzando piastre rivestite con un anticorpo monoclonale specifico per la microglia.

Isolamento e coltura di microglia da cervelli di ratto utilizzando terreni privi di siero

Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Gli astrociti fenotipicamente wild-type e le cellule staminali neurali raccolte da topi ingegnerizzati con alleli oncogenici condizionali e trasformati tramite ricombinazione virale Cre-mediata possono essere utilizzati per modellare la patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo mediante iniezione ortotopica di cellule trasformate in cervelli di compagni di cucciolata singenici e immunocompetenti.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.

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Creazione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale

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Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Scopri la preparazione di colture primarie di astrociti e microglia da cortecce di ratto per studiare la segnalazione del calcio intracellulare nella sclerosi laterale amiotrofica. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale delle dinamiche cellulari.

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

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