Name: Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Impara la ricostruzione tridimensionale dei siti di contatto tra organelli negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale. Questo metodo accessibile offre eccellente risoluzione X/Y per studiare le interazioni cellulari.

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Ringraziamo Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro e Ania Straatman-Iwanowska per l'assistenza tecnica esperta. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Stefan e Ian J. White per le discussioni utili. J.J.B. è supportato da finanziamenti MRC al MrC Laboratory of Molecular Cell Biology presso uCL, codice di assegnazione MC_U12266B. C.J.S. è supportato dal finanziamento MRC al MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit presso uCL, codice di assegnazione MC_UU_00012/6. P.G. è finanziato dal Consiglio europeo della ricerca, codice di sovvenzione ERC-2013-StG-337057.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

In questo protocollo è descritta una tecnica vEM accessibile per visualizzare la struttura e le interazioni degli organelli in 3D. La morfologia dei contatti interorganelle negli epatociti è presentata come un caso di studio qui. Tuttavia, questo approccio è stato applicato anche per studiare una varietà di altri campioni e aree di ricerca, tra cui le interazioni cellula-endotelio di Schwann nei nervi periferici45, la biogenesi del corpo di Weibel Palade nelle cellule endoteliali...

Dalla loro invenzione nel 1930, i microscopi elettronici hanno permesso ai ricercatori di visualizzare i componenti strutturali di cellule e tessuti 1,2. La maggior parte delle indagini ha fornito informazioni 2D, poiché la costruzione di modelli 3D richiede una scrupolosa raccolta di sezioni seriali, fotografia manuale, elaborazione negativa, tracciamento manuale e la creazione e l'assemblaggio di modelli 3D da lastre di vetro, plastica o polistirolo 3,4. Quasi 70 anni dopo, ci sono stati notevoli progressi in numerosi aspetti del processo, dalle prestazioni del microscopio, alla raccolta di sezioni seriali, all'imaging digitale automatizzato, al sofisticato software e hardware per la ricostruzione, la visualizzazione e l'analisi 3D ad approcci alternativi per quello che ora è collettivamente chiamato volume EM (vEM). Queste tecniche vEM sono generalmente considerate per fornire informazioni ultrastrutturali 3D a risoluzioni nanometriche su scale micron e comprendono la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e le più recenti tecniche di microscopia elettronica a scansione (SEM); vedi recensioni 5,6,7,8.
Ad esempio, il fascio ionico focalizzato SEM (FIB-SEM) utilizza un fascio ionico focalizzato all'interno di un SEM per fresare la superficie del blocco tra scansioni sequenziali seM della superficie del blocco, consentendo la fresatura / imaging automatizzato ripetuto di un campione e la creazione di un set di dati 3D per la ricostruzione 9,10. Al contrario, il blocco seriale FACCIA SEM (SBF-SEM) utilizza un ultramicrotomo all'interno del SEM per rimuovere materiale dalla faccia del blocco prima dell'imaging 11,12, mentre la tomografia array è un processo non distruttivo che richiede la raccolta di sezioni seriali, su coverslip, wafer o nastro, prima di impostare un flusso di lavoro automatizzato di imaging della regione di interesse nelle sezioni sequenziali nel SEM per generare il set di dati 3D13 . Simile alla tomografia ad array, la sezione seriale TEM (ssTEM) richiede che le sezioni fisiche siano raccolte prima dell'imaging; tuttavia, queste sezioni sono raccolte su griglie TEM e fotografate in un TEM 14,15,16. ssTEM può essere esteso eseguendo la tomografia tilt 17,18,19. La tomografia inclinabile seriale fornisce la migliore risoluzione in x, y e z e, sebbene sia stata utilizzata per ricostruire intere celle20, è ragionevolmente impegnativa. Questo protocollo si concentra sugli aspetti pratici di ssTEM come la tecnica vEM più accessibile disponibile per molti laboratori EM che potrebbero non avere attualmente accesso a strumenti specializzati di sezionamento o vEM, ma trarrebbero vantaggio dalla generazione di dati vEM 3D.
L'ultramicrotomia seriale per la ricostruzione 3D è stata precedentemente considerata impegnativa. Era difficile tagliare nastri dritti di spessore di sezione uniforme, essere in grado di disporre e raccogliere nastri delle dimensioni corrette, nell'ordine corretto, su griglie con supporto sufficiente, ma senza barre della griglia che oscuravano le regioni di interesse e, soprattutto, senza perdere sezioni, poiché una serie incompleta potrebbe impedire la ricostruzione 3D completa21. Tuttavia, i miglioramenti agli ultramicrotomi commerciali, i coltelli da taglio e rifilatura diamantati 22,23, le pellicole di supporto elettrone lucente sulle griglie 21,24 e gli adesivi per aiutare l'adesione della sezione e la conservazione del nastro13,21 sono solo alcuni dei progressi incrementali nel corso degli anni che hanno reso la tecnica più di routine in molti laboratori. Una volta raccolte le sezioni seriali, l'imaging seriale in TEM è semplice e può fornire immagini EM con dimensioni px subnanometriche in x e y, consentendo l'interrogazione ad alta risoluzione delle strutture subcellulari, un potenziale requisito per molte domande di ricerca. Il caso di studio qui presentato dimostra l'uso di ssTEM e ricostruzione 3D nello studio dei contatti reticolo endoplasmatico (ER)-organello negli epatociti epatici, dove i contatti ER-organello sono stati osservati per la prima volta25,26.
Pur essendo contiguo con l'involucro nucleare, l'ER ha anche stretti contatti con numerosi altri organelli cellulari, tra cui lisosomi, mitocondri, goccioline lipidiche e la membrana plasmatica27. I contatti ER-organello sono stati implicati nel metabolismo lipidico28, nella segnalazione fosfoinositide e calcio29, nella regolazione dell'autofagia e nella risposta allo stress30,31. I contatti ER-organello e altri contatti interorganelle sono strutture altamente dinamiche che rispondono alle esigenze metaboliche cellulari e ai segnali extracellulari. È stato dimostrato che variano morfologicamente nelle loro dimensioni e forma e nelle distanze tra le membrane degli organelli32,33. Si ritiene che queste differenze ultrastrutturali riflettano probabilmente le loro diverse composizioni proteiche / lipidiche e la funzione34,35. Tuttavia, è ancora un compito impegnativo definire i contatti interorganelle e analizzarli36. Pertanto, è necessario un protocollo affidabile ma semplice per esaminare e caratterizzare i contatti interorganelle per ulteriori indagini.
Poiché i contatti ER-organello possono variare da 10 a 30 nm nella separazione membrana-membrana, il gold standard per l'identificazione è stato storicamente TEM. Il TEM a sezione sottile ha rivelato la localizzazione di sottodomini specifici per le proteine ER residenti a contatti di membrana distinti37. Tradizionalmente, questo ha rivelato contatti ER-organello con risoluzione nm, ma spesso ha presentato solo una visione 2D di queste interazioni. Tuttavia, gli approcci vEM rivelano la presentazione ultrastrutturale e il contesto di questi siti di contatto in 3D, consentendo la ricostruzione completa dei contatti e una classificazione più accurata dei contatti (punto vs. tubolare vs. simile a cisternale) e la quantificazione38,39. Oltre ad essere il primo tipo di cellula in cui sono stati osservati contatti ER-organello25,26, gli epatociti hanno un ampio sistema di altri contatti interorganelli che svolgono ruoli vitali nella loro architettura e fisiologia28,40. Tuttavia, manca ancora un'accurata caratterizzazione morfologica dell'ER-organello e di altri contatti interorganelli negli epatociti. Di conseguenza, il modo in cui i contatti interorganelle si formano e rimodellano durante la rigenerazione e la riparazione è di particolare rilevanza per la biologia degli epatociti e la funzionalità epatica.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtro per siringa</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Vassoi in alluminio</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/Dodecenil Anidride succinica</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Epon ingrediente</td></tr><tr><td>Coltello diamantato</td><td>DiaTOME</td><td>ultra 45 gradi;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimetilamminometil) fenolo</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Epon ingrediente</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://imagej.net/ Fiji TrakEM2 plugin</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>Formaldeide 36% soluzione</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Griglia a fessura rivestita</td><td>Fatto in casa</td><td></td><td>Alternativa: EMS diasum (FF2010-Cu)</td></tr><tr><td>Flacone in vetro con asta applicatore</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>Fiale in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gluteraldeide al 25%</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/Anidride metilnadica</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>Ingrediente Epon</td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio 2% soluzione</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo riutilizzabile</td><td>Blue Tack</td> Reynolds Citrato <td></td><td></td></tr> di <tr><td>piombo</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>Colorazione per sezioni</td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0250</td><td>a fare 0,1 M Caco tampone</td></tr><tr><td>Super Colla</td><td>RS Componenti</td><td>918-6872</td><td>Colla cianoacrilata, Passaggio 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 Resina</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>Epon ingrediente</td></tr><tr><td>Acido tannico</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica bicomponente</td><td>RS Componenti</td><td>132-605</td><td>Alternativa: Passaggio 2.13</td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo vibrante</td><td>Leica</td><td></td><td>100 &micro; m fette spesse, taglio 0,16 mm/s con ampiezza di 1 mm.</td></tr><tr><td>Weldwood Cemento a contatto originale</td><td>DAP</td><td>107</td><td>Adesivo a contatto: Passaggio 3.1.4</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

La microscopia elettronica a trasmissione è stata a lungo considerata il gold standard per la visualizzazione dell'ultrastruttura cellulare. Tuttavia, l'analisi è spesso limitata a due dimensioni, ostacolando la capacità di descrivere completamente l'ultrastruttura tridimensionale (3D) e la relazione funzionale tra gli organelli. La microscopia elettronica volumetrica (vEM) descrive una raccolta di tecniche che consentono l'interrogazione dell'ultrastruttura cellulare in 3D a mesoscala, microscala e risoluzioni su scala nanometrica. 
Questo protocollo fornisce un metodo accessibile e robusto per acquisire dati vEM utilizzando la trasmissione a sezione seriale EM (TEM) e copre gli aspetti tecnici dell'elaborazione dei campioni fino alla ricostruzione 3D digitale in un unico flusso di lavoro semplice. Per dimostrare l'utilità di questa tecnica, viene presentata la relazione ultrastrutturale 3D tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri e i loro siti di contatto negli epatociti epatici. I contatti interorganelle svolgono ruoli vitali nel trasferimento di ioni, lipidi, sostanze nutritive e altre piccole molecole tra gli organelli. Tuttavia, nonostante la loro scoperta iniziale negli epatociti, c'è ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche fisiche, dinamiche e funzioni. 
I contatti interorganelle possono mostrare una gamma di morfologie, che variano nella vicinanza dei due organelli l'uno all'altro (in genere ~ 10-30 nm) e l'estensione del sito di contatto (dai contatti puntati ai contatti 3D più grandi simili a cisternali). L'esame dei contatti stretti richiede l'imaging ad alta risoluzione e la sezione seriale TEM è adatta per visualizzare l'ultrastrutturale 3D dei contatti interorganelle durante la differenziazione degli epatociti, nonché le alterazioni dell'architettura degli epatociti associate a malattie metaboliche.

Per questa tecnica, le regioni di interesse vengono selezionate in base all'obiettivo della ricerca biologica e identificate prima del taglio e del sezionamento del tessuto incorporato. Allo stesso modo, la dimensione della faccia del blocco può essere dettata dalla domanda di ricerca; in questo caso, il campione è stato tagliato per lasciare una faccia di blocco di circa 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Ciò ha permesso di creare due griglie di 9 sezioni seriali per griglia, fornendo 18 sezioni...

Un protocollo semplice e completo per acquisire dettagli tridimensionali dei siti di contatto della membrana tra organelli negli epatociti dal fegato o cellule in altri tessuti.

Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Questo protocollo consente la ricostruzione 3D degli organelli in modo semplice e robusto, pur essendo accessibile ai laboratori che attualmente non dispongono di microscopi elettronici di volume specialistici. Questa tecnica è estremamente flessibile, fornendo un'eccellente risoluzione X / Y, pur essendo in grado di ri-visualizzare i campioni se necessario. È anche compatibile con la tomografia inclinabile quando è richiesta una risoluzione Z molto elevata.Questa tecnica consente interrogazioni della morfologia degli organelli in contesto inter-organello. Pertanto, può essere esteso per esaminare eventuali condizioni patologiche con difetti degli organelli. Questo approccio può fornire informazioni sulle interazioni degli organelli e sugli eventi di traffico cellulare.Questo metodo può essere applicato anche ad altri tessuti, modelli organoidi e sistemi di coltura cellulare, oltre agli epatociti. Gli utenti per la prima volta possono trovare il sezionamento seriale e riprendere impegnativo senza perdita. Si raccomanda di essere abili nel regolare sezionamento ultrasottile prima di applicare questo protocollo a un campione prezioso.Iniziare tagliando con cura il tessuto incorporato nella resina usando una lama di rasoio con il campione bloccato nell'adattatore di rifilatura. Trasferire l'arca campione insieme al mandrino e al campione nel braccio del campione del microtomo e posizionare l'arca campione in modo che l'intervallo di viaggio dell'arca vada dall'alto verso il basso. Posizionare e bloccare il coltello diamantato nel portacoltelli, assicurandosi che l'angolo di taglio del coltello sia impostato in modo appropriato.Blocca saldamente il portacoltelli nel palco. Spegnere il downlighting del palco, accendere l'uplighting del palco, spostare con cautela il coltello verso il campione, regolando continuamente l'angolo laterale del coltello, l'inclinazione del campione e la rotazione del campione regolando le relative manopole fino a quando la faccia del blocco non è allineata al bordo del coltello. Impostare la parte superiore e inferiore della finestra di taglio del braccio del campione e lasciare il campione appena sotto il bordo del coltello.Riempire la barca del coltello con acqua pulita e a doppio distillato e assicurarsi che la superficie dell'acqua sia a livello del bordo del coltello e leggermente concava. Quindi, inizia a tagliare le sezioni. Interrompere il taglio subito dopo che il campione ha superato il bordo del coltello.Utilizzare una griglia di slot vuota per stimare il numero di sezioni da raccogliere su ciascuna griglia. Usando una ciglia in ogni mano, rompere delicatamente il nastro in nastri più piccoli che possono adattarsi alla lunghezza della griglia della fessura. Prendi nota mentalmente delle loro posizioni relative all'interno del campione.Usando un'asta di applicazione di vetro, passa una goccia di cloroformio sulle sezioni per appiattirle. Prelevare la prima griglia di fessure vuote con la prima pinza numerata e immergerla delicatamente nel Triton X-100 e poi due volte nell'acqua distillata. Utilizzare un pezzo di carta da filtro per rimuovere l'acqua in eccesso dal bordo della pinza.Usando la pinza, abbassare delicatamente circa 2/3 della griglia a fessura rivestita di formvar nell'acqua della barca del coltello. Assicurarsi che il lato del formvar sia rivolto verso il basso e che il lungo bordo destro della fessura sia sulla superficie dell'acqua e parallelo al bordo dell'acqua. Muovere delicatamente la griglia nell'acqua verso i nastri in modo che al momento del tratto di ritorno, le sezioni si spostino verso la griglia.Continua a farlo in waft sempre più piccoli, fino a quando il bordo destro del nastro si allinea con il bordo destro dello slot. Quindi, con l'ultimo waft, porta delicatamente la griglia verso l'alto per raccogliere le sezioni nella griglia della fessura. Posizionare diversi pellet di idrossido di sodio sotto il coperchio di una capsula di Petri per fornire un ambiente privo di anidride carbonica.Quindi, pipettare con cura gocce di 40 microlitri del citrato di piombo di Reynold sul parafilm, una goccia per ogni griglia. Capovolgere ogni griglia sulla goccia di citrato di piombo e lasciare protetto dal coperchio della capsula di Petri per 7-10 minuti. Mentre le griglie si colorano, posizionare cinque gocce di acqua distillata di circa 300 microlitri per ogni griglia sul parafilm.Alla fine dell'incubazione del citrato di piombo, trasferire ogni griglia in una goccia di acqua distillata per lavare per un minuto senza respirare direttamente sulle griglie. Ripeti l'operazione altre quattro volte. Usa una pinza incrociata numerata per raccogliere la prima griglia.Toccare il bordo della griglia per filtrare la carta per allontanare la maggior parte dell'acqua e lasciare asciugare nella pinza per almeno 20 minuti. Ripeti questa operazione per ogni griglia. A basso ingrandimento, osservare l'ordine, la posizione e la posizione delle sezioni seriali.Passare alla sezione centrale della serie sulla griglia. Sfoglia l'esempio e identifica un'area di interesse. Quindi, osservare il campione all'ingrandimento desiderato.Prendi in considerazione la possibilità di raccogliere la serie con un ingrandimento leggermente inferiore, poiché le sezioni spesso non sono perfettamente allineate e le immagini potrebbero dover essere ritagliate in seguito. Quindi, scatta immagini di riferimento a ingrandimenti inferiori. Ciò contribuirà ad apprezzare il contesto della regione di interesse, la sua posizione approssimativa a diversi ingrandimenti in relazione ai confini della sezione e le caratteristiche del punto di riferimento all'interno del campione.Usali per segnalare la regione di interesse in altre sezioni. Per il riferimento allo schermo, utilizzare stucco adesivo riutilizzabile, adesivi o un pezzo di carta per lavagna luminosa fissato sullo schermo per posizionare marcatori temporanei sullo schermo. Ciò consentirà di re-immaginare di routine le stesse caratteristiche della regione di interesse al centro dell'immagine in tutto il set di dati.Aprire lo stack di immagini, specificare le misurazioni voxel e selezionare la scheda Segmentazione per avviare la segmentazione. Fate clic su Nuovo nel pannello dell'editor di segmentazione per definire nuovi oggetti nell'elenco dei materiali. Fare clic con il pulsante destro del mouse per modificare il colore dell'oggetto e fare doppio clic per rinominare l'oggetto.Per la segmentazione manuale, scegliete lo strumento di segmentazione sotto l'elenco dei materiali e selezionate lo strumento pennello predefinito per evidenziare i pixel. L'immagine al microscopio elettronico di due epatociti opposti è mostrata qui. L'imaging ad ingrandimento più elevato consente l'osservazione dei dettagli morfologici dei diversi organelli con risoluzione nanometrica.L'immagine rappresentativa mostra la versione segmentata dello stesso tomogramma, la traccia del reticolo endoplasmatico, i mitocondri e i contatti intermembrana tra l'ER e i mitocondri di spazi diversi sono mostrati qui. L'immagine rappresentativa mostra un'orto-fetta inclinata sovrapposta a tracce di segmentazione e la sua posizione relativa all'interno dell'intero mitocondrio. La ricostruzione 3D degli organelli segmentati e dei contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici a diverse angolazioni sono mostrati qui.Poiché questo protocollo è compatibile con la tomografia inclinabile quando è necessaria una risoluzione Z molto elevata, aiuta a risolvere strutture piccole o contorte. Questa tecnica è perfetta per la valutazione iniziale della relazione spaziale tra diversi organelli e, quindi, particolarmente utile nel campo progressivo dei contatti di membrana all'omeostasi di membrana.

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Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale (Video) | JoVE Journal

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