Name: Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Impara un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero. Questo metodo utilizza colture cellulari standard e misurazione dell'attività luciferasi per studiare l'interazione tra microRNA e proteine leganti RNA.

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Gli autori sono grati a E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) per le cellule HeLa-Cre e i plasmidi pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Ringraziamo Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot per il loro supporto.

Una panoramica del protocollo qui descritto è illustrata nella Figura 1.
1. Costruzione plasmidica
<ol><li>pCAGGS-Cre: Questo plasmide è stato fornito dal Dr. E. Makeyev21.</li>
	<li>pRD-miR-17-92:<ol><li>Amplificare pre-miR-17-92 mediante PCR utilizzando 0,5 μM di ciascun primer specifico (Table of Materials), 150 ng di cDNA, 1 mM dNTPs, 1x tampone Taq PCR e 5 U di Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà. Eseguire una reazione PCR di controllo senza modello (utilizzare acqua anziché cDNA) per verificare la contaminazione del DNA.</li>
		<li>Collegare il prodotto PCR in pRD-RIPE (gentilmente fornito dal Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 all'interno dell'introne tra i siti di restrizione EcoRI ed EcoRV usando DNA ligasi, creando pRD-miR-17-92. Confermare l'integrità della sequenza mediante sequenziamento Sanger.</li>
	</ol></li>
	<li>pmiRGLO-RAP-IB<ol><li>Progettare primer avanti e indietro affiancati da siti di restrizione XhoI / XbaI e con un sito di restrizione NotI all'interno. Mescolare quantità equimolari di primer avanti e indietro e incubare la miscela a 90 °C per 5 minuti, quindi trasferire a 37 °C per 15 minuti. Come controlli, utilizzate primer con sequenze di destinazione codificate (Table of Materials).</li>
		<li>Fendere i frammenti ricotti usando enzimi di restrizione XhoI/XbaI e ligarli a valle della sequenza luc2 in pmiR-GLO, generando costrutti reporter pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) e pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Confermare la legatura con la scissione NotI. NOTA: Assicurarsi che le sporgenze create dopo la ricottura del primer siano complementari al vettore dopo la reazione di scissione.</li>
	</ol></li>
	<li>pFLAG-HuR<ol><li>Per generare un plasmide che sovraesprime HuR, amplificare la sequenza HuR con primer specifici. Mescolare 300 ng di cDNA, 0,5 μM di ciascun primer specifico, 1 mM di miscela dNTPs, 1x tampone PCR e 5 U di Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà.</li>
		<li>Collegare il prodotto PCR in pGEM-T e confermare l'integrità della sequenza di DNA mediante sequenziamento Sanger. Rimuovere il frammento HuR da pGEM-T e subclonarlo nel vettore di espressione dei mammiferi pFLAG-CMV-3 per generare il vettore pFLAG-HuR.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coltura cellulare
NOTA: La linea cellulare HeLa-Cre è stata un dono del Dr. E. Makeyev21, e la cellula di cancro papillare della tiroide (BCPAP) è stata gentilmente fornita dal Dr. Massimo Santoro (Università "Federico II", Napoli, Italia). Le cellule HeLa, le cellule tumorali papillari della tiroide (BCPAP) e HEK-293T sono state utilizzate per sovraesprimere HuR.
<ol><li>Mantenere le cellule in DMEM/alto contenuto di glucosio integrato con siero bovino fetale al 10%, 1 mM di piruvato di sodio, 200 mM di L-glutammina e 1x penicillina-streptomicina (100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina) in piastre di Petri da 100 mm, se non diversamente indicato. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato in atmosfera controllata (5% CO2).</li>
	<li>Incubare cellule aderenti con tripsina/EDTA (miscela di soluzione allo 0,5%) a 37 °C per 3-5 minuti. Lasciateli staccare dalla piastra (il periodo di incubazione può variare a seconda del tipo di cellula).</li>
	<li>Eseguire le trasfezioni con un reagente di trasfezione a base lipidica seguendo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che le colture cellulari siano circa il 70% confluenti. Utilizzare quantità simili di DNA per tutte le combinazioni di trasfezione, come descritto di seguito, aggiungendo i DNA appropriati. Eseguire esperimenti di trasfezione in repliche.<ol><li>Mescolare 200 ng di DNA e 1,25 μL di reagente di trasfezione in 100 μL del terreno di coltura. Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle. Incubare le cellule con le miscele di trasfezione per 4 h a 37 °C. Quindi, sostituire il mezzo con terreno contenente il 10% di FBS e incubare per altre 24 ore prima di aggiungere gli antibiotici per la selezione.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sovraespressione di HuR
<ol><li>Transfettare pFLAG-HuR e svuotare pFLAG in HeLa. Selezionare le cellule aumentando la concentrazione di geneticina (G418) (1 μg/mL) da 100 μg/mL a 1000 μg/mL, generando linee cellulari stabili.</li>
	<li>Confermare la sovraespressione con PCR quantitativa utilizzando primer specifici per l'mRNA HuR, come descritto nella fase 7.</li>
</ol>4. Isolamento totale dell'RNA
<ol><li>Utilizzare celle appena raccolte. Tripsinizzare colture cellulari confluenti al 70% (per questo test sono state utilizzate cellule HeLa-Cre), come descritto al punto 2.2.</li>
	<li>Raccogliere il pellet cellulare mediante centrifugazione per 5 minuti a 500 x g a 4 °C e lavarlo con 1x PBS (soluzione salina tamponata fosfato); Ripetere la centrifugazione.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 1x PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 500 x g a 4 °C.</li>
	<li>Pesare il pellet a secco e regolare di conseguenza i volumi e le dimensioni dei tubi. 1 mg di cellule produce circa 1 μg di RNA totale.</li>
	<li>In una cappa, aggiungere 500-1.000 μL di fenolo/cloroformio al pellet cellulare (idealmente 750 μL per 0,25 g di cellule) e omogeneizzarlo mediante pipettaggio su e giù e mescolando con il vortice.</li>
	<li>Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente (da 20 °C a 25 °C) per consentire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 200 μL di cloroformio per 1 mL di fenolo:cloroformio utilizzato. Tappare saldamente le provette del campione.</li>
	<li>Mescolare vigorosamente per 15 s (a mano o brevemente vortexing a velocità inferiore) e incubare a temperatura ambiente (da 20 °C a 25 °C) per 2 minuti a 3 minuti.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Verificare la presenza di una fase fenolo-cloroformio rosso inferiore, una fase intermedia e una fase acquosa superiore incolore. L'RNA rimane nella fase acquosa superiore. In una cappa, raccogliere la fase acquosa, evitando di contattare la fase intermedia, e trasferire in un tubo fresco.</li>
	<li>Precipitare l'RNA mescolando la fase acquosa con 400 μL di isopropanolo di grado molecolare (rapporto 1:1 con fenolo/cloroformio utilizzato) e 2 μL di glicogeno in ogni tubo (aiuterà a visualizzare la presenza del pellet).</li>
	<li>Mescolare energicamente a mano o omogeneizzare con la punta per ~10 s. Incubare per 15 minuti o per una notte a -20 °C.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 12.000 x g per 20 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Lavare il pellet di RNA aggiungendo 3 volumi di etanolo al 100% (circa 1 ml, diluito con acqua DEPC) e mescolare il campione per vortice fino a quando il pellet viene rilasciato e galleggia dal fondo.</li>
	<li>Centrifugare a 7.500 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Lavare il pellet di RNA 1x aggiungendo 1 ml di etanolo al 75% e mescolare il campione a vortice fino a quando il pellet viene rilasciato e galleggia dal fondo. Ripetere la centrifugazione come descritto al punto 4.17.</li>
	<li>Eseguire un'ulteriore centrifugazione di 5 s per raccogliere il liquido residuo dal lato del tubo e rimuovere qualsiasi liquido residuo con una pipetta senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Asciugare brevemente all'aria il pellet di RNA aprendo il tappo del tubo a temperatura ambiente per 3-5 minuti e sciogliere il pellet di RNA in 20-50 μL di acqua trattata con DEPC priva di RNasi. Incubare l'RNA per 10 minuti a 55-60 °C per facilitare la risospensione del pellet.</li>
</ol>5. Determinazione della concentrazione totale e della qualità dell'RNA
<ol><li>Determinare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. Ottenere dati spettrali completi prima di utilizzare i campioni nelle applicazioni a valle.</li>
	<li>Controllare la qualità dell'RNA risolvendo 800-1000 ng su un gel di agarosio all'1,5% utilizzando tampone TBE 0,5X (45 mM Tris base, 45 mM acido borico, 1 mM EDTA). L'RNA totale si separa in due bande che si riferiscono agli rRNA 28S e 18S.<ol><li>Produrre tutti i reagenti e lavare tutte le attrezzature utilizzate per far funzionare il gel con acqua trattata con DEPC. L'acqua trattata con DEPC viene preparata nella cappa aggiungendo 1 ml di dietilpirocarbonato a 1000 ml di acqua ultrapura. Incubare per ~2 h a temperatura ambiente o a 37 °C e in autoclave. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 10 mesi. NOTA: L'elettroforesi degli RNA totali dei mammiferi porta alla separazione degli rRNA 28S e 18S con un rapporto di circa 2:1. Le bande devono essere intatte e visibili come due bande taglienti. L'RNA degradato si tradurrà in bande sfocate.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Trascrizione inversa
<ol><li>Impostare la reazione di trascrizione inversa utilizzando 1 μg di RNA totale.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione inversa (RT) utilizzando l'enzima trascrittasi inversa (vedi Tabella dei materiali) e primer decamer casuali da 50 ng/μL.<ol><li>Mescolare RNA, primer casuali e 1 mM dNTP mix (10 mM) in 10 μL. Incubare a 65 °C per 5 minuti e su ghiaccio per 1 min. Aggiungere i seguenti reagenti: 1x tampone RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U di inibitore della RNasi e 200 U di trascrittasi inversa.</li>
		<li>Incubare per 10 minuti a 25 °C e per 1 ora a 50 °C (le temperature possono variare se vengono utilizzati enzimi diversi). Terminare la reazione incubando a 85 °C per 5 min. I cDNA possono essere conservati a -20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>7. PCR quantitativa
<ol><li>Per assemblare la reazione in un volume finale di 15 μL, mescolare 3 μL di cDNA (100 ng/μL), 3,2 pmol di ciascun primer, 6 μL di master mix contenente i dNTP e l'enzima e 2,8 μL di acqua ultrapura. NOTA: Utilizzare primer per geni costitutivi endogeni come controlli (geni housekeeping) per normalizzare i livelli di espressione di mRNA e miRNA HuR. β-actina e snRNA U6 (RNU6B) sono opzioni disponibili per la normalizzazione di mRNA e miRNA, rispettivamente, ma anche altri geni potrebbero essere adatti a seconda dei casi.</li>
	<li>Quantificare i livelli di espressione utilizzando il metodo delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.</li>
</ol>8. Il saggio del reporter
<ol><li>Cellule utilizzate per il test<ol><li>Trasfettare i plasmidi nelle cellule HeLa-Cre come segue. Transfettare con pTK-Renilla (40 ng), quindi pRD-miR-17-92, generando HeLa-Cre-miR-17-92 e selezionando con 1 μg/mL di puromicina.</li>
		<li>Transfettare HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla con pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR o pmiRGLO-strapazzato-3ʹ-UTR, separatamente. Selezionare utilizzando penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 μg / ml). Queste trasfezioni generano Luc-RAP-1-B e Luc-scrambled.</li>
		<li>Trasfettare le celle con pFLAG-HuR o pFLAG vuoto (passo 3).</li>
		<li>Procedere alla coltura cellulare, come descritto al punto 2.2., con HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-strapazzato, HeLa-Cre miR-17-92-HuR e HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc fino a circa l'80% della confluenza. Indurre con 1 μL di doxiciclina (1 μg/ml) per 30 minuti a 37 °C. Inoltre, mantenere tutte le cellule senza doxiciclina come controlli, per lo stesso periodo. NOTA: La concentrazione finale di doxiciclina dipende dalla linea cellulare scelta. Un eccesso di doxiciclina può essere tossico per le cellule di mammifero.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio luminescente<ol><li>Per quantificare e confrontare diverse intensità di luminescenza, utilizzare il kit di analisi del reporter Dual-luciferasi. Scongelare le soluzioni di analisi della luciferasi e lasciarle a temperatura ambiente prima di iniziare il test.</li>
		<li>Preparare la miscela Stop e Glo (tubi con cappuccio blu) miscelando 200 μL del substrato in 10 ml di Luciferase Assay Buffer II. Preparare la miscela LAR II (tubi con cappuccio verde) mescolando 10 mL di Luciferase Assay Buffer II nel flaconcino ambrato di Luciferase Assay Substrate II e agitare bene.</li>
		<li>Trasferire le soluzioni in provette da centrifuga da 15 mL precedentemente identificate e protette dalla luce. NOTA: In alternativa, le soluzioni possono essere preventivamente preparate in aliquote da 1-2 ml e congelate a -80 °C al riparo dalla luce in un foglio di alluminio.</li>
		<li>Eseguire le letture della luminescenza utilizzando un'apparecchiatura come Synergy; misurare la luciferasi espressa come unità di luce relativa (RLU).</li>
		<li>Esporta i risultati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi statistiche.</li>
		<li>Eseguire la normalizzazione dell'attività della lucciola-luciferasi da parte del controllo Renilla (luciferasi / Renilla) e tracciarla come unità di luce relativa (RLU) in un grafico. Ripetere questa operazione per i gruppi con e senza induzione della doxiciclina.</li>
		<li>Calcolare la media e l'errore standard della media (SEM). Esegui un t-test di Student o ANOVA bidirezionale seguito dal post-test di Tukey per consentire il confronto di gruppo. Queste analisi sono disponibili in un pacchetto come GraphPad Prism. Le differenze a valori p < 0,05 sono considerate significative.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+HuR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of HuR function.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELAVL1+regulates+alternative+splicing+of+eIF4E+transporter+to+promote+postnatal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutics+targeting+the+mRNA-binding+protein+HuR+using+3DNA+nanocarriers+suppresses+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth.</a> Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).</li>
<li>Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR+regulates+cyclin+A+and+cyclin+B1+mRNA+stability+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation.</a> The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).</li>
<li>Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-16+modulates+HuR+regulation+of+cyclin+E1+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Lo splicing pre-mRNA è un processo importante per la regolazione dell'espressione genica e il suo controllo può innescare forti effetti sulle modificazioni fenotipiche cellulari22,23. Più del 70% dei miRNA sono trascritti da introni nell'uomo, e abbiamo ipotizzato che la loro elaborazione e maturazione potrebbe essere facilitata dallo splicing delle proteine regolatrici24,25. Abbiamo sviluppato un metodo ...

Lo splicing dell'mRNA precursore è un processo importante per la regolazione dell'espressione genica negli eucarioti1. La rimozione degli introni e l'unione degli esoni nell'RNA maturo è catalizzata dallo spliceosoma, un complesso ribonucleoproteico di 2 megadalton composto da 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 e U6) insieme a più di 100 proteine 2,3. La reazione di splicing avviene co-trascrizionalmente e lo spliceosoma viene assemblato ad ogni nuovo introne guidato dal riconoscimento dei siti di giunzione conservati ai confini dell'esone-introne e all'interno dell'introne4. Introni diversi potrebbero avere velocità di splicing diverse nonostante la notevole conservazione del complesso dello spliceosoma e dei suoi componenti. Oltre alle differenze nella conservazione del sito di splicing, le sequenze regolatorie distribuite su introni ed esoni possono guidare le proteine leganti l'RNA (RBP) e stimolare o reprimere lo splicing 5,6. HuR è un RBP espresso ubiquitariamente ed è un fattore importante per controllare la stabilità dell'mRNA7. I risultati precedenti del nostro gruppo hanno mostrato che HuR può legarsi agli introni contenenti miRNA, indicando che questa proteina potrebbe essere un fattore importante per facilitare l'elaborazione e la maturazione dei miRNA, portando anche alla generazione di isoforme di splicing alternative 6,8,9.
Molti microRNA (miRNA) sono codificati da sequenze introniche. Mentre alcuni fanno parte dell'introne, altri sono noti come "mirtron" e sono formati dall'intero introne10,11. I miRNA sono brevi RNA non codificanti, che vanno da 18 a 24 nucleotidi di lunghezza12. La loro sequenza matura mostra una complementarità parziale o totale con le sequenze bersaglio negli mRNA, influenzando quindi i tassi di traduzione e/o di decadimento dell'mRNA. Le combinazioni di miRNA e bersagli guidano la cellula verso risultati diversi. Diversi miRNA possono guidare le cellule verso fenotipi pro- o anti-tumorali13. I miRNA oncogeni di solito prendono di mira gli mRNA che innescano una caratteristica soppressiva, portando ad un aumento della proliferazione cellulare, della migrazione e dell'invasione14. D'altra parte, i miRNA soppressivi del tumore potrebbero colpire mRNA oncogeni o mRNA correlati all'aumento della proliferazione cellulare.
Anche l'elaborazione e la maturazione dei miRNA dipendono dalla loro origine. La maggior parte dei miRNA intronici vengono elaborati con la partecipazione del microprocessore, formato dalla ribonucleasi Drosha e dai cofattori proteici12. I mirtroni vengono elaborati con l'attività dello spliceosoma indipendentemente da Drosha15. Considerando l'alta frequenza di miRNA presenti all'interno degli introni, abbiamo ipotizzato che le proteine leganti l'RNA coinvolte nello splicing potrebbero anche facilitare l'elaborazione e la maturazione di questi miRNA. In particolare, l'hnRNP RBP A2/B1 è già stato associato al microprocessore e alla biogenesi16 del miRNA. 
Abbiamo precedentemente riportato che diverse proteine leganti l'RNA, come hnRNPs e HuR, sono associate a miRNA intronici dalla spettrometria di massa17. L'associazione di HuR (ELAVL1) con i miRNA del cluster intronico miR-17-92 è stata confermata utilizzando l'immunoprecipitazione e l'analisi in silico 9. miR-17-92 è un cluster di miRNA intronico composto da sei miRNA con aumentata espressione in diversi tumori18,19. Questo cluster è anche noto come "oncomiR-1" ed è composto da miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b e miR-92 a. miR-19 a e miR-19b sono tra i miRNA più oncogeni di questo cluster 19. L'aumentata espressione di HuR stimola la sintesi di miR-19a e miR-19b 9. Poiché le regioni introniche che fiancheggiano questo cluster sono associate a HuR, abbiamo sviluppato un metodo per indagare se questa proteina potesse regolare l'espressione e la maturazione di miR-19a e miR-19b. Una previsione importante della nostra ipotesi era che, come proteina regolatrice, HuR potrebbe facilitare la biogenesi dei miRNA, portando ad alterazioni fenotipiche. Una possibilità era che i miRNA fossero processati dalla stimolazione di HuR ma non fossero maturi e funzionali e, quindi, gli effetti della proteina non avrebbero avuto un impatto diretto sul fenotipo. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio di splicing reporter per indagare se un RBP come HuR potrebbe influenzare la biogenesi e la maturazione di un miRNA intronico. Confermando l'elaborazione e la maturazione dei miRNA, il nostro test mostra l'interazione con la sequenza target e la generazione di un miRNA maturo e funzionale. Nel nostro test, abbiamo accoppiato l'espressione di un cluster di miRNA intronico con un plasmide di luciferasi per verificare il legame del bersaglio dei miRNA nelle cellule in coltura.

<table><tbody><tr><td>Recombinant DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-Cre (Cre- plasmide codificante)</td><td></td><td></td><td>Un gentile dono di E. Makeyev da Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pFLAG-HuR</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>pmiRGLO-RAP-IB</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>pmiRGLO-scrambled</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>pRD-miR-17-92</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>donatore</td><td></td><td></td> pRD-RIPE <td>Un gentile dono da E. Makeyev da Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>pTK-Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-B-actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>anti-HuR</td><td>mAb per segnalazione cellulare</td><td>&nbsp; 12582</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680CW Capra anti-topo IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Capra anti-coniglio IgG</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Experimental Models: Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Cre</td><td></td><td></td><td>Un gentile regalo da E. Makeyev da Khandelia et al., 2011</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-luc</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>HeLa-Cre miR17-92-scrambled</td><td></td><td></td><td>Generato durante questo lavoro</td></tr><tr><td>Chemicals e peptidi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ad alto glucosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>BioBasic</td><td>MB719150</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di dosaggio della luciferasi Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0271</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0301</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E859-EG</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pFLAG-CMV&trade;-3 Vettore di espressione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6783</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimerasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10966-030</td><td></td></tr><tr><td>pmiR-GLO</td><td>Promega</td><td>E1330</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNAsi OUT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>752899</td><td></td></tr><tr><td>Kit SuperScript IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091050</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol-LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>tripsina/EDTA 10X</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Promega</td><td>R616A</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forward RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse RAP-1B pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT</td><td></td></tr><tr><td>reverse scrambled pmiRGLO</td><td>Exxtend</td><td>CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC</td><td></td></tr><tr><td>forward HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR pFLAG</td><td>Exxtend</td><td>GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE</td><td>Exxtend</td><td>ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>CTCGCTTCGGCAGCACATATAC</td><td></td></tr><tr><td>reverse snRNA U6 (RNU6B)</td><td>Exxtend</td><td>GGAACCTTCACGAATTTGCGTG</td><td></td></tr><tr><td>forward B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ACCTTCTACAATGAGCTGCG</td><td></td></tr><tr><td>reverse B-Actin qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CCTGGATAGCAACGTACATGG</td><td></td></tr><tr><td>forward HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>ATCCTCTGGCAGATGTTTGG</td><td></td></tr><tr><td>reverse HuR qPCR</td><td>Exxtend</td><td>CATCGCGGCTTCTTCATAGT</td><td></td></tr><tr><td>forward pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>GTGCTCGACGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG</td><td></td></tr><tr><td>reverse pre-miR-1792 qPCR</td><td>Exxtend</td><td>TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG</td><td></td></tr><tr><td>Software e algoritmi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8 per Mac OS X</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td>https://www.graphpad.com</tr><tr><td>ImageJ</td><td>Istituti Nazionali di Sanità</td><td>http://imagej.nih.gov/ij</td><td></td></tr></tbody></table>

un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microrna intronici in cellule di mammifero

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

I microRNA (miRNA) sono molecole di RNA corte che sono diffuse negli eucarioti. La maggior parte dei miRNA sono trascritti da introni e la loro maturazione coinvolge diverse proteine leganti l'RNA nel nucleo. I miRNA maturi mediano frequentemente il silenziamento genico, e questo è diventato uno strumento importante per comprendere gli eventi post-trascrizionali. Oltre a ciò, può essere esplorato come una metodologia promettente per le terapie geniche. Tuttavia, attualmente mancano metodi diretti per valutare l'espressione dei miRNA nelle colture cellulari di mammifero. Qui, descriviamo un metodo efficiente e semplice che aiuta a determinare la biogenesi e la maturazione dei miRNA attraverso la conferma della sua interazione con le sequenze bersaglio. Inoltre, questo sistema consente la separazione della maturazione dei miRNA esogeni dalla sua attività endogena utilizzando un promotore inducibile dalla doxiciclina in grado di controllare la trascrizione primaria dei miRNA (pri-miRNA) con alta efficienza e basso costo. Questo strumento consente anche la modulazione con proteine leganti l'RNA in un plasmide separato. Oltre al suo uso con una varietà di miRNA diversi e i loro rispettivi bersagli, può essere adattato a diverse linee cellulari, a condizione che queste siano suscettibili di trasfezione.

La nostra ipotesi iniziale era che HuR potesse facilitare la biogenesi dei miRNA intronici legandosi alla sua sequenza pre-miRNA. Pertanto, la connessione tra l'espressione di HuR e la biogenesi del cluster miR-17-92 potrebbe indicare un nuovo meccanismo che governa la maturazione di questi miRNA. La sovraespressione di HuR dopo trasfezione di pFLAG-HuR è stata confermata in tre diverse linee cellulari: HeLa, BCPAP e HEK-293T (Figura 2). Come controlli, sono state utilizzate cellule...

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Il nostro protocollo affronta gli effetti delle proteine leganti l'RNA regolatorie sulla biogenesi e maturazione dei microRNA, direttamente da colture cellulari. Il metodo che descriviamo può essere eseguito con comuni reagenti di coltura cellulare ed è relativamente veloce. Questo metodo può essere importante per studiare gli effetti fenotipici dei microRNA e dei loro bersagli in diversi tipi di cellule eucariotiche.Possono essere utilizzate cellule normali o simili alla malattia. È importante scegliere linee cellulari suscettibili di trasfezione, eseguire adeguati controlli di trasfezione e induzione al fine di osservare i cambiamenti di affinità target attraverso l'attività della luciferasi. Per iniziare, mantenere le cellule in DMEM, integratore di glucosio elevato in piastre di Petri da 100 millimetri e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato e ad atmosfera controllata con il 5% di anidride carbonica.Per staccare le cellule aderenti, incubarlo con una soluzione di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Per eseguire le trasfezioni, mescolare 200 nanogrammi di DNA e 1,25 microlitri di reagente di trasfezione in 100 microlitri del terr

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Qui si descrive un metodo che utilizza la potenza di microiniezione accoppiato con...

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica e hanno dimostrato di giocare un ruolo in numerosi processi biologici. Per capire meglio miRNA-UTR interazioni, abbiamo creato un genoma collezione di 3 giornalisti UTR luciferasi in coppia con un nuovo gene luciferasi e dosaggio reagenti, il sistema LightSwitch.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

In questo video, dimostriamo che in presenza di un inibitore del fosfodiestere, il ciclo cellulare dell'ovocita viene arrestato alla profase-I, durante la quale gli mRNA trascritti vengono conservati in assenza di traduzione. Dopo il rilascio dell'inibitore, la maturazione degli ovociti riprende e le cellule entrano in metafase. Il segnale dell'mRNA reporter fuso con il gene bersaglio nella metafase-I indica l'attivazione del meccanismo traduzionale e l'espressione proteica.

Il saggio reporter in vitro di un singolo ovocita: una tecnica per studiare la regolazione della traduzione dell'mRNA bersaglio durante la maturazione degli ovociti in vitro

Il test del reporter genetico è uno strumento consolidato e potente per sezionare la relazione tra le sequenze di DNA e le loro attività di regolazione genica. L'accoppiamento di elementi regolatori candidati a geni reporter che trasportano tag di sequenza identificativi consente una massiccia parallelizzazione di questi saggi.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Qui proponiamo una strategia per studiare l'effetto di un fattore di trascrizione di interesse sul trascrittoma del microRNA utilizzando dati pubblicamente disponibili, risorse computazionali e dati ad alto rendimento da array di microRNA dopo aver trasfettato cellule con una piccola forcina (sh)RNA mirata a un fattore di trascrizione di interesse.

Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

Questo protocollo utilizza una reazione a catena di polimerasi in tempo reale basata su sonda (PCR), un saggio SRB (sulforhodamine B), una clonazione di 3 regioni non tradotte (3' UTR) e un analisi luciferasi per verificare i geni bersaglio di un miRNA di interesse e per comprendere le funzioni dei miRNA.

Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

Questo protocollo descrive un saggio di reporter per studiare la regolazione della traduzione dell'mRNA in singoli ovociti durante la maturazione in vitro.

Definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno durante la maturazione in vitro utilizzando un saggio single oocyte reporter

Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5'-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell'inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.

Un test cellulare basato su reporter per il monitoraggio dell'efficienza di giunzione

Impara un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero. Questo metodo utilizza colture cellulari standard e misurazione dell'attività luciferasi per studiare l'interazione tra microRNA e proteine leganti RNA.

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

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