Un modello di roditore indotto da TNBS per studiare il ruolo patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn
1 marzo 2022
Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello di colite simile al Crohn nei roditori. L'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS e l'allargamento meccanico è osservato nel segmento prossimale alla stenosi. Questi cambiamenti consentono di studiare lo stress meccanico nella colite.
Quindi, nel nostro protocollo, l'instillazione intra-colonica di TNBS porta all'infiammazione transmurale nel sito di instillazione e alla distensione meccanica nel segmento prossimale all'infiammazione. Quindi questo imita la malattia di Crohn stenotica. Poiché il segmento prossimale è meccanicamente disteso ma non mostra un'infiammazione visibile, uno studio comparativo del segmento prossimale e del sito di infiammazione aiuta a determinare se lo stress meccanico svolge un ruolo nella colite di Crohn.
Studi precedenti si concentrano solo sul sito di infiammazione. Il nostro protocollo che lavora su diversi siti del modello evidenzia un ruolo critico dello stress meccanico nella malattia di Crohn, in particolare nella malattia di Crohn stenotica. Per iniziare, posizionare i ratti sul tavolo dell'anestesia in posizione supina.
Per indurre la colite, inserire un catetere poliuretanico di grado medico, aperto, attraverso l'ano per circa sette-otto centimetri dal bordo anale e instillare delicatamente TNBS nel colon. Somministrare i ratti di controllo fittizi con 250 microlitri di soluzione salina. Per aiutare la distribuzione di TNBS o soluzione salina ed evitare fuoriuscite, mantenere i ratti in posizione supina con la testa rivolta verso il basso con un angolo di circa 30 gradi, con l'ano chiuso per due minuti.
Aprire l'addome del ratto usando forbici e pinze chirurgiche. Rimuovere con attenzione l'intero colon sopra il canale anale e trasferire immediatamente il colon in un tampone HBSS 1x ghiacciato. Raddrizzare i due punti nel buffer e misurare la lunghezza dei due punti utilizzando un righello.
Prendi un filo di nylon e giralo intorno al colon per misurare la circonferenza esterna dei segmenti del colon in controllo e dei ratti trattati con TNBS. Prendi tessuti a tutto spessore per l'istologia. Tagliare il colon lungo la tavola mesenterica e pulire accuratamente il colon con il tampone HBSS.
Valutare il colon per il punteggio di infiammazione macroscopica in base ai criteri predefiniti con modifiche minime. Raccogliere campioni di tessuto del colon da ratti trattati con TNBS nei siti P, I e D.Site P è la porzione da due a tre centimetri prima del margine orale del sito di infiammazione. Il sito I è il sito di infiammazione in cui viene instillato il TNBS, in genere da quattro a sei centimetri dalla fine del colon.
Infine, il sito D è la porzione da uno a due centimetri distale al margine aborale del sito di infiammazione. L'instillazione intra-colonica di TNBS nei ratti ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata di circa due centimetri di lunghezza con parete intestinale ispessita e lume ristretto nel sito di instillazione nel colon distale. Il sito di instillazione di TNBS è stato indicato come sito I.As risultato di infiammazione transmurale e stenosi, sia l'infiammazione che lo stress meccanico erano presenti nel sito I.La stenosi nel sito I ha portato a una marcata distensione del lume nel segmento prossimale al sito di instillazione di TNBS, indicato come sito P.La circonferenza del colon era significativamente aumentata nei siti P e I rispetto al colon di controllo fittizio.
Mentre meccanicamente disteso, il sito P non ha mostrato infiammazione visibile. Al contrario, il segmento del colon distale all'instillazione di TNBS indicato come sito D non presentava né infiammazione né distensione meccanica. Il punteggio macroscopico dell'infiammazione nel sito I nei ratti trattati con TNBS è stato notevolmente aumentato rispetto ai controlli fittizi nei siti P e D dei ratti colite.
I punteggi di infiammazione nei siti P e D non sono stati significativamente aumentati rispetto alla finzione. Quindi è importante studiare non solo il sito I ma i siti P e D nel modello, in quanto ciò aiuta a riconoscere il significato patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn. Per determinare ulteriormente se lo stress meccanico è un fattore patogeno nell'infiammazione intestinale, si può anche provare a rilasciare la distensione meccanica alimentando gli animali esclusivamente con una dieta liquida e vedere se questo aiuta con l'infiammazione e la funzione intestinale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello di colite simile al morbo di Crohn in roditori, con un focus sull'infiammazione transmurale e sullo stress meccanico. Permette di indagare le modifiche meccaniche nella colite, in particolare in condizioni stenotiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Gastroenterologia
- Malattia infiammatoria intestinale
Sfondo
- La malattia di Crohn è caratterizzata da un'infiammazione transmurale.
- Lo stress meccanico potrebbe svolgere un ruolo significativo nella progressione della malattia.
- Studi precedenti si sono concentrati principalmente sui siti infiammatori.
- Questo modello consente studi comparativi tra segmenti colpiti e non colpiti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello murino che imiti la malattia di Crohn stenotica.
- Indagare il ruolo dello stress meccanico nella colite.
- Confrontare le modifiche meccaniche in segmenti infiammati e non infiammati.
Metodi Utilizzati
- Instillazione intra-colonica di TNBS per indurre infiammazione.
- Valutazione della distensione meccanica nei segmenti prossimali.
- Analisi comparativa tra aree infiammate e non infiammate.
- Utilizzo di anestesia per la preparazione dei roditori.
Risultati principali
- L'infiammazione transmurale è stata indotta con successo nel sito TNBS.
- È stata osservata una distensione meccanica nel segmento prossimale.
- I risultati suggeriscono un ruolo fondamentale dello stress meccanico nella malattia di Crohn.
- Il modello evidenzia l'importanza dello studio di diversi siti anatomici.
Conclusioni
- Il modello sviluppato è efficace per lo studio della colite di tipo di Crohn.
- Lo stress meccanico potrebbe contribuire alla patologia della malattia.
- Studi futuri dovrebbero esplorare le implicazioni di questi risultati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere il ruolo indipendente dello stress meccanico nella patogenesi della malattia di Crohn è fondamentale per ridurre i rischi nella fase iniziale della scoperta e nella validazione degli obiettivi nello sviluppo di farmaci per le malattie infiammatorie intestinali. Il modello murino indotto da TNBS consente un'analisi precisa dei fattori determinanti meccanici rispetto a quelli infiammatori, sostenendo la previsione nei ricercati traslazionali e nella selezione del portafoglio per strategie antifibrotiche e anti-stenotiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette l'analisi dello stress meccanico come fattore patogeno indipendente nella malattia di Crohn.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi distinguendo i contributi meccanici da quelli infiammatori nella fibrosi e nella stenosi.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico per nuove ipotesi terapeutiche mirate al rimodellamento del tessuto.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema in vivo validato per la valutazione quantitativa dell'espressione genica, della risposta immunitaria e della fibrosi in condizioni meccaniche definite.
- Consente la misurazione riproducibile dell'infiammazione macroscopica e della distensione meccanica in diversi siti anatomici.
- Permette la standardizzazione dei saggi per la valutazione di composti diretti contro le vie di risposta allo stress meccanico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli preclinici a caratteristiche rilevanti della patologia di Crohn, inclusa l'infiammazione transmurale e la stenosi luminale.
- Consente una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di interventi antifibrotici e antistenotici.
- Offre opportunità di biomarcatori traslazionali correlando lo stress meccanico con l'espressione genica e il rimodellamento del tessuto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello collega la fase iniziale della scoperta e la validazione preclinica permettendo la verifica di ipotesi sullo stress meccanico nella malattia infiammatoria intestinale, sostenendo l'identificazione dei composti promettenti e le decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio.
- Biologia della scoperta: Analizza il significato patogenetico dello stress meccanico rispetto all'infiammazione nella malattia di Crohn.
- Screening: Fornisce letture quantitative e specifiche per sito relative a infiammazione, fibrosi e distensione meccanica.
- Analisi: Consente l'analisi comparativa dell'espressione genica e della risposta immunitaria in siti anatomici definiti.
- Ricerca traslazionale: Modella caratteristiche clinicamente rilevanti per la valutazione preclinica di strategie antifibrotiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per studi meccanicistici e screening di composti nella ricerca sulle malattie infiammatorie intestinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico nella malattia di Crohn.
- Valore operativo: Standardizza la valutazione in vivo dei fattori meccanici e infiammatori nei modelli di MII.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione per candidati farmaci antifibrotici e antistenotici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per il rischio di asset nella scoperta e nello sviluppo preclinico mirati al rimodellamento tissutale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle procedure chirurgiche su roditori e nella modellizzazione della colite.
- Richiede l'accesso a infrastrutture analitiche istologiche, molecolari e macroscopiche.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi per i protocolli di valutazione dell'infiammazione e di campionamento dei tessuti.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per altre ceppi di roditori o modelli pertinenti alla malattia infiammatoria intestinale.
- La quantificazione dello stress meccanico è limitata a siti anatomici definiti e potrebbe non rilevare effetti sistemici.
