Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

Questo protocollo mostra come la tecnica del DNA curtain sia utilizzata per studiare la dinamica della cromatina, in particolare studiando la funzione molecolare degli chaperoni istonici. La tenda del DNA della tecnica di imaging a singola molecola ad alto rendimento supera i limiti degli esperimenti di massa e facilita l'imaging in tempo reale, consentendo la caratterizzazione dettagliata delle interazioni delle biomolecole. Metti una carta pulita di dimensioni 5 x 35 millimetri al centro del nastro biadesivo.

Attacca il nastro adesivo sopra la diapositiva per coprire i due fori e i nano motivi con la carta. Quindi asportare la carta utilizzando una lama pulita. Metti un vetrino coprioggetto sopra il nastro biadesivo e strofina il vetrino coprioggetto usando la punta di una pipetta per formare una camera microfluidica.

Posizionare la cella di flusso assemblata tra due vetrini per microscopio e agganciarli. Cuocere la cella di flusso in un forno sottovuoto a 120 gradi Celsius per 45 minuti. Collegare il connettore del fluido per l'analisi basata su chip a ciascun foro aperto utilizzando una pistola per colla a caldo.

E collegare le due linee di tubi di blocco dell'esca. Collegare una siringa lure lock contenente tre millilitri di acqua deionizzata e lavare la camera. Lavare nuovamente la camera con tre millilitri di tampone lipidico tramite connessione goccia a goccia.

Iniettare un millilitro di lipide biotinilato 0,04x in tampone lipidico, nella camera, in due colpi, con un'incubazione di cinque minuti per iniezione. Iniettare 0,025 milligrammi per millilitro di streptavidina in un millilitro di BSA, con due colpi e un'incubazione di 10 minuti per iniezione. Iniettare circa 30 picomolari di DNA di fago lambda biotinilato in un millilitro di tampone BSA, nella camera con due colpi e incubazioni di 10 minuti per iniezione.

Collegare una siringa contenente 10 millilitri di tampone di imaging a una pompa a siringa e rimuovere le bolle in tutte le linee di tubi del sistema microfluidico. Accoppiare la cella di flusso preparata con il sistema microfluidico tramite connessione drop-to-drop per evitare l'iniezione di bolle nella cella di flusso. Assemblare la cella di flusso e i supporti della cella di flusso e montare il gruppo su un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale costruito su misura.

Iniettare 200 microlitri di colorante YOYO-1 nel tampone di imaging attraverso 100 microlitri di loop del campione per colorare le molecole di DNA Lambda. Esegui il software di imaging e accendi il laser a 488 nanometri per verificare se le cortine di DNA sono ben formate. Dopo aver rimosso il colorante YOYO-1, iniettare il campione proteico pre-incubato.

Quando le proteine raggiungono la cortina di DNA, spegnere la pompa della siringa, chiudere la valvola di intercettazione e incubare per 15 minuti per il caricamento degli istoni da parte di Abo1. Lavare via l'Abo1 non legato e le proteine istoniche per cinque minuti. Disattivare temporaneamente il flusso tampone per verificare se le proteine istoniche sono caricate sul DNA.

La formazione della cortina di DNA è stata controllata colorando le molecole di DNA con un colorante interpolante. Le linee verdi mostrate in array paralleli indicavano che YOYO1 intercalato nelle molecole di DNA erano ben allineate e allungate a una barriera di diffusione sotto flusso idrodinamico. Quando i dimeri Cy5-H3-H4 sono stati iniettati nella cortina di DNA in assenza di Abo1, Cy5-H3-H4 non si è legato al DNA, indicando una mancanza di legame spontaneo dei dimeri H3-H4 al DNA.

Quando Cy5-H3-H4 è stato iniettato con Abo1, sono stati osservati punti fluorescenti rossi sulle molecole di DNA, suggerendo che Abo1 carica dimeri H3-H4 sul DNA. I segnali fluorescenti sono scomparsi in assenza di flusso tampone e sono riapparsi quando il flusso è stato ripreso, suggerendo che i dimeri H3-H4 si legano al DNA. Il legame dei dimeri H3-H4 al DNA è stato confermato anche dal chimografo, in cui i segnali di fluorescenza scomparivano ogni volta che il flusso veniva interrotto.

Pochi punti fluorescenti sono apparsi nella cortina del DNA, sia in assenza di nucleotidi che in presenza di ADP, indicando che i dimeri H3-H4 raramente si legano al DNA, sia nello stato Apo che in presenza di ADP. L'analisi quantitativa mostra che il numero di dimeri H3-H4 legati al DNA aumenta in presenza di ATP. I risultati suggeriscono che l'idrolisi dell'ATP è essenziale per il caricamento di H3-H4 sul DNA da parte di Abo1.

Evitare l'iniezione di bolle nella cella di flusso è la cosa più critica per tutte le fasi. Quindi, in questo protocollo, enfatizziamo le connessioni drop-by-drop. Il test della tenda del DNA può essere esteso alle tende del DNA a doppio legame con doppi nano-pattern.

Inoltre, possiamo creare un altro tipo di cortina di DNA con filamenti di DNA, RNA o actina a singolo filamento. La tenda del DNA consente la visualizzazione del movimento delle proteine sul DNA e facilita lo studio del meccanismo di ricerca del bersaglio. La cortina del DNA può essere estesa per studiare il metabolismo del DNA, compresa la replicazione e la trascrizione.