Name: Decifrare il meccanismo molecolare dellassemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Scopri la tecnica DNA curtain per studiare l'assemblaggio degli istoni e le dinamiche della cromatina in tempo reale. Questo metodo ad alta portata supera i limiti degli esperimenti in massa.

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Gli autori apprezzano il gentile supporto per Abo1 e Cy5-H3-H4 da parte del professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., e Juwon Jang, Ph.D., a KAIST, Corea del Sud. Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione della National Research Foundation (NRF-2020R1A2B5B01001792), dal fondo di ricerca intramurale (1.210115.01) dell'Istituto nazionale di scienza e tecnologia di Ulsan e dall'Istituto per la scienza di base (IBS-R022-D1).

1. Preparazione della cella di flusso
<ol><li>Preparare un vetrino di silice fusa pulito contenente modelli di nano-trincee seguendo il rapporto25 pubblicato in precedenza.<ol><li>Praticare due fori di 1 mm di diametro in un vetrino di silice fusa pulito (Figura 1A) utilizzando una punta diamantata (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Depositare 250 nm di alluminio (Al) di spessore sul vetrino utilizzando DC sputter32 (vedi Tabella dei materiali) con 10 mTorr di gas argon.</li>
		<li>Centrifugare uno strato di 310 nm di poli(metacrilato di metile) (PMMA) al 4% 950K (vedi tabella dei materiali) a 4.000 giri/min per 1 minuto e cuocere su una piastra calda a 180 °C per 3 minuti.</li>
		<li>Disegnare i modelli di nano-trincee sullo strato di PMMA tra i due fori utilizzando la litografia a fascio di elettroni (ebeam)33 con corrente di 0,724 nA a 80 kV. NOTA: L'architettura e le dimensioni dei modelli di nano-trincee sono mostrate nella Figura 1A.</li>
		<li>Rimuovere il PMMA esposto a ebeam immergendo i vetrini nella soluzione di sviluppo (rapporto 1:3 di metilisobutilchetone e isopropanolo, vedere la tabella dei materiali) per 2 minuti.</li>
		<li>Incisione di strati di alluminio con incisione ionica reattiva al plasma accoppiata induttivamente (ICP-RIE) utilizzando gas di cloro (Cl2) e tricloruro di boro (BCl3). NOTA: Questi due gas possono rimuovere l'Al dalle aree esposte all'ebeam.</li>
		<li>Scavare nano-trincee sui vetrini utilizzando gas di tetrafluoruro di zolfo (SF4), tetrafluorometano (CF4) e ossigeno (O2 ) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Rimuovere lo strato di alluminio rimanente immergendo i vetrini in mordenzante di alluminio (sviluppatore AZ 300 MIF, vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti.</li>
		<li>Dopo la fabbricazione, sciacquare i vetrini con acqua deionizzata e sonicare in acetone per 30 minuti utilizzando un sonicatore a bagno.</li>
		<li>Pulire i vetrini in soluzione Hellmanex III al 2% (vedere Tabella dei materiali) per almeno 1 giorno con agitazione magnetica.</li>
		<li>Sonicare i vetrini in acetone per 30 minuti e NaOH 1 M per 30 minuti in successione.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini con acqua deionizzata e asciugarli con un gas azoto (N2).</li>
	</ol></li>
	<li>Metti un foglio di carta pulito (5 mm x 35 mm) al centro del nastro biadesivo. Attacca il nastro adesivo sopra la diapositiva per coprire i due fori e i nano-pattern con la carta.</li>
	<li>Eseguire l'asportazione della carta utilizzando una lama pulita (Figura 1A).</li>
	<li>Mettere un vetrino coprioggetti sopra il nastro biadesivo e strofinare il vetrino coprioggetto utilizzando la punta di una pipetta per formare una camera microfluidica (Figura 1A).</li>
	<li>Posizionare la cella di flusso assemblata tra due vetrini da microscopio e agganciarli.</li>
	<li>Cuocere la cella di flusso in forno sottovuoto a 120 °C per 45 min.</li>
	<li>Collegare il connettore del fluido (Nanoport) per le analisi basate su chip (vedere la tabella dei materiali) a ciascun foro aperto utilizzando una pistola per colla a caldo e collegare le due linee di tubi Luer lock.</li>
	<li>Collegare una siringa Luer lock contenente 3 mL di acqua deionizzata e lavare la camera.</li>
	<li>Lavare la camera con 3 mL di tampone lipidico (20 mM di Tris-HCl, pH 8,0 e 100 mM di NaCl) tramite la connessione goccia a goccia. NOTA: La connessione drop-by-drop collega tutte le siringhe alla cella di flusso per evitare l'iniezione di bolle d'aria nella camera.</li>
	<li>Iniettare 1 mL di lipide biotinilato 0,04x in tampone lipidico nella camera in due colpi con 5 minuti di incubazione per iniezione. NOTA: La preparazione di 1x stock lipidico biotinilato è descritta in un rapporto precedentemente pubblicato34.</li>
	<li>Lavare la camera con 3 mL di tampone lipidico e incubare per 20 minuti affinché il doppio strato lipidico venga fatto maturare sulla superficie del vetrino.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone BSA (40 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM di NaCl, 2 mM di MgCl2 e 0,2 mg/mL di BSA) e incubare per 5 minuti per passivare la superficie del vetrino. NOTA: Questo passaggio può ridurre il legame aspecifico delle proteine alla superficie del vetrino.</li>
	<li>Iniettare 0,025 mg/mL di streptavidina in 1 mL di tampone BSA con due colpi e 10 minuti di incubazione per iniezione.</li>
	<li>Lavare via la streptavidina residua con 3 mL di tampone BSA.</li>
	<li>Iniettare ~300 pM (30 μL) di DNA fagico lambda biotinilato in 1 mL di tampone BSA nella camera con due colpi e 10 minuti di incubazione per iniezione. NOTA: La preparazione del DNA lambda biotinilato è descritta in un rapporto pubblicato in precedenza34.</li>
</ol>2. Collegare la cella di flusso al sistema microfluidico e caricarla sul microscopio
<ol><li>Preparare il tampone di imaging Abo1 (50 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM di NaCl, 1 mM di DTT, 1 mM di ATP, 2 mM di MgCl2, 1,6% di glucosio e 0,1x di gloxy, vedere la tabella dei materiali). NOTA: Gloxy è un sistema di eliminazione dell'ossigeno che riduce il fotosbiancamento dei coloranti fluorescenti. La preparazione di brodo gloxy 100x con glucosio ossidasi e catalasi è descritta nella referenza35.</li>
	<li>Collegare una siringa contenente 10 mL di tampone di imaging a una pompa a siringa e rimuovere le bolle in tutte le linee di tubi del sistema microfluidico.</li>
	<li>Accoppiare la cella di flusso preparata con il sistema microfluidico tramite connessione drop-to-drop per evitare l'iniezione di bolle nella cella di flusso (Figura 1B).</li>
	<li>Assemblare la cella a flusso e i supporti della cella a flusso e montare il gruppo su un microscopio TIRF personalizzato (Figura 1C). ATTENZIONE: Quando la cella di flusso viene posta sotto il microscopio, impostare con cura l'altezza della lente dell'obiettivo. La cella di flusso non deve toccare la lente dell'obiettivo. Ciò può danneggiare l'obiettivo.</li>
	<li>Indice di caduta corrispondente all'olio al centro della cella di flusso e posizionare un prisma a colomba su misura (vedere la tabella dei materiali) sulla goccia d'olio.</li>
</ol>3. Assemblaggio degli istoni da parte di Abo1 utilizzando la cortina del DNA
<ol><li>Miscelare 5 nM di Abo1 e 12,5 nM di dimero istonico H3-H4 marcato con Cy5 (Cy5-H3-H4) (vedere la tabella dei materiali) in 150 μL di tampone di imaging. Tutte le proteine sono state preparate seguendo il rapporto17 precedentemente pubblicato.</li>
	<li>Incubare la miscela con ghiaccio per 15 min. NOTA: Per evitare il fotosbiancamento di Cy5, l'incubazione deve essere effettuata al buio.</li>
	<li>Iniettare ~20 pM (2 μL) di colorante YOYO-1 nel tampone di imaging attraverso un loop di campionamento da 100 μL per colorare le molecole di DNA lambda.</li>
	<li>Eseguire il software di imaging (vedere la tabella dei materiali) e accendere il laser a 488 nm per verificare se le cortine di DNA sono ben formate. NOTA: Se le cortine di DNA sono ben formate, le molecole di DNA, che sono colorate con YOYO-1, sono mostrate come linee allineate a una barriera in presenza di flusso. Le linee tese indietreggiano e si diffondono lontano dalla barriera quando il flusso viene disattivato.</li>
	<li>Iniettare 2 mL di tampone ad alto contenuto salino (200 mM di NaCl e 40 mM di MgCl2) per eliminare il colorante YOYO-1 dal DNA.</li>
	<li>Dopo aver rimosso il colorante YOYO-1, iniettare il campione proteico pre-incubato.</li>
	<li>Quando le proteine raggiungono la cortina di DNA, spegnere la pompa della siringa, chiudere la valvola di intercettazione e incubare per 15 minuti per il caricamento degli istoni da parte di Abo1.</li>
	<li>Lavare via l'Abo1 non legato e le proteine istoniche per 5 minuti.</li>
	<li>Aprire la valvola di intercettazione e riprendere l'iniezione del flusso.</li>
	<li>Accendere il laser a 637 nm e visualizzare l'immagine delle proteine fluorescenti mentre il flusso tampone è attivo.</li>
	<li>Disattivare temporaneamente il flusso tampone per verificare se le proteine istoniche sono caricate sul DNA (Figura 2C).</li>
	<li>Raccogliere le immagini della cortina di DNA con un programma di acquisizione di immagini (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Quando il flusso tampone si interrompe transitoriamente, il DNA si ritira dal campo evanescente di riflessione interna totale e le proteine marcate in modo fluorescente legate al DNA scompaiono.</li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>Trasforma le immagini scattate dal programma di acquisizione immagini in formato TIFF come sequenze di immagini. NOTA: Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando l'immagine J (NIH) come descritto nel riferimento20.</li>
	<li>Scegli una singola molecola di DNA dalle sequenze di immagini e disegna un chimografo. NOTA: Il kymografo può mostrare la variazione dell'intensità di fluorescenza di ciascuna proteina istonica legata a una singola molecola di DNA in funzione del tempo.</li>
	<li>Creare il profilo di intensità della fluorescenza dal kymografo e adattarlo a più funzioni gaussiane.</li>
	<li>Raccogliere le coordinate centrali dei picchi dal profilo di intensità della fluorescenza. In questa fase è possibile ottenere l'intensità minima della fluorescenza istonica.</li>
	<li>Dividere tutte le intensità di picco raccolte dai profili per l'intensità minima. Il numero di dimeri H3-H4 legati al DNA è stimato in questa fase.</li>
	<li>Eseguire i passaggi 4.2-4.5 per altre molecole di DNA.</li>
	<li>Creare un istogramma per la distribuzione di associazione dei dimeri H3-H4 con dimensioni del contenitore di 1 kbp. Il numero di molecole analizzate è di almeno 300.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come tecnica di imaging a singola molecola, la cortina di DNA è stata ampiamente utilizzata per sondare le reazioni metaboliche del DNA43. La cortina del DNA è un sistema ibrido che concatena fluidità lipidica, microfluidica e TIRFM. A differenza di altre tecniche a singola molecola, la tenda del DNA consente la visualizzazione in tempo reale ad alto rendimento delle interazioni proteina-DNA. Pertanto, la tecnica della cortina del DNA è adatta per sondare il meccanismo alla base delle interazioni ...

Il DNA eucariotico è impacchettato in una struttura di ordine superiore nota come cromatina 1,2. Il nucleosoma è l'unità fondamentale della cromatina, che consiste di circa 147 bp di DNA avvolto attorno agli istoni del nucleo ottamerico 3,4. La cromatina svolge un ruolo fondamentale nelle cellule eucariotiche; ad esempio, la struttura compatta protegge il DNA da fattori endogeni e minacce esogene5. La struttura della cromatina cambia dinamicamente in base alla fase del ciclo cellulare e agli stimoli ambientali, e questi cambiamenti controllano l'accesso alle proteine durante le transazioni del DNA come la replicazione, la trascrizione e la riparazione6. La dinamica della cromatina è importante anche per la stabilità genomica e l'informazione epigenetica.
La cromatina è regolata dinamicamente da vari fattori, tra cui le modificazioni della coda degli istoni e gli organizzatori della cromatina come i rimodellatori della cromatina, le proteine del gruppo polycomb e gli chaperoni istonici7. Gli chaperoni istonici coordinano l'assemblaggio e il disassemblaggio dei nucleosomi tramite deposizione o distacco degli istoni del nucleo 8,9. I difetti negli chaperoni istonici inducono instabilità del genoma e causano disturbi dello sviluppo e cancro 9,10. Vari chaperoni istonici non necessitano di un consumo di energia chimica come l'idrolisi dell'ATP per assemblare o disassemblare i nucleosomi 9,11,12,13. Recentemente, i ricercatori hanno riferito che le ATPasi AAA+ (ATPasi associate a diverse attività cellulari) contenenti bromodominio svolgono un ruolo nella dinamica della cromatina come chaperoniistonici 14,15,16,17. L'ATAD2 umano (proteina 2 contenente il dominio AAA della famiglia ATPasi) promuove l'accessibilità della cromatina per migliorare l'espressione genica18. Come co-regolatore trascrizionale, ATAD2 regola la cromatina dei fattori trascrizionali oncogenici14 e la sovraespressione di ATAD2 è correlata a una prognosi sfavorevole in molti tipi di cancro19. Yta7, l'omologo di Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) di ATAD2, diminuisce la densità nucleosomica nella cromatina15. Al contrario, Abo1, l'omologo di Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) di ATAD2, aumenta la densità del nucleosoma16. Utilizzando una tecnica di imaging unica a singola molecola, la cortina di DNA, se Abo1 contribuisce all'assemblaggio o al disassemblaggio del nucleosoma viene affrontata17,20.
Tradizionalmente, le proprietà biochimiche delle biomolecole sono state esaminate mediante esperimenti di massa come il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) o la co-immunoprecipitazione (co-IP), in cui viene sondato un gran numero di molecole e le loro proprietà medie sono caratterizzate21,22. Negli esperimenti di massa, i sottostati molecolari sono velati dall'effetto della media d'insieme e l'indagine sulle interazioni biomolecolari è limitata. Al contrario, le tecniche a singola molecola aggirano i limiti degli esperimenti di massa e consentono la caratterizzazione dettagliata delle interazioni biomolecolari. In particolare, le tecniche di imaging a singola molecola sono state ampiamente utilizzate per studiare le interazioni DNA-proteina e proteina-proteina23. Una di queste tecniche è la tenda del DNA, una tecnica di imaging unica a singola molecola basata sulla microfluidica e sulla microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM)24,25. In una cortina di DNA, centinaia di singole molecole di DNA sono ancorate al doppio strato lipidico, che consente il movimento bidimensionale delle molecole di DNA grazie alla fluidità lipidica. Quando viene applicato il flusso idrodinamico, le molecole di DNA si muovono lungo il flusso sul doppio strato e rimangono bloccate in corrispondenza di una barriera di diffusione, dove vengono allineate e allungate. Mentre il DNA viene colorato con agenti intercalanti, vengono iniettate proteine marcate in modo fluorescente e TIRFM viene utilizzato per visualizzare le interazioni proteina-DNA in tempo reale a livello di singola molecola23. La piattaforma a cortina di DNA facilita l'osservazione dei movimenti delle proteine come la diffusione, la traslocazione e la collisione 26,27,28. Inoltre, la cortina del DNA può essere utilizzata per la mappatura di proteine su DNA con posizioni, orientamenti e topologie definite o applicata allo studio della separazione di fase di proteine e acidi nucleici 29,30,31.
In questo lavoro, la tecnica del DNA curtain viene utilizzata per fornire prove della funzione degli chaperoni attraverso la visualizzazione diretta di proteine specifiche. Inoltre, poiché DNA curtain è una piattaforma ad alto rendimento, facilita una quantità di raccolta dati sufficiente per l'affidabilità statistica. Qui, viene descritto in dettaglio come condurre il test della tenda del DNA per studiare il ruolo molecolare di S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1.

<table><tbody><tr><td>Siringa luer-lock da 1 mL</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>1' x 3' vetro per vetrini silca fusa</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>1 pollice x 3 pollici rettangolare e 1 mm di spessore</td></tr><tr><td>10 mL siringa luer-lock</td><td>BecktonDickinson</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Questo è un componente del lipide biotinilato stock</td></tr><tr><td>18:1 Tappo biotinilico PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>Questo è un componente del lipide biotinilato stock</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>Questo è un componente del lipide biotinilato stock 3</td></tr><tr><td>mL siringa luer-lock</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>valvola di iniezione del campione a 6 vie</td><td>IDEX</td><td>MX serie II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>All-resist</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato sale disodico idrato (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Alluminio (Al)</td><td>TASCO, Corea del Sud</td><td>LT50AI414</td><td>Diametro 4 pollici, spessore 1/4 di pollice</td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Amicon Ultra, MWCO 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF sviluppatore</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>Utilizzato per la rimozione</td></tr><tr><td>dell'alluminio Lama</td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 mm x 6 m</td></tr><tr><td>Tricloruro di boro (BCl3)</td> <td>UNIONGAS</td><td></td><td>Purezza: >99,99%</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>Questo è un componente di 100x gloxy stock</td></tr><tr><td>Cloro (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Purezza: >99,99%</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo trasparente</td><td>3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DC sputter</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>Utilizzato per la deposizione di alluminio su una slitta</td></tr><tr><td>Punta diamantata</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>Utilizzato per praticare fori in una slitta di silice sfumata</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Prisma a colomba</td><td>Korea Electro-Optics Co., Ltd.</td><td>1906-106</td><td>Prisma a colomba in silice fusa su misura con rivestimento antiriflesso</td></tr><tr><td>Trapano</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>Utilizzato per praticare fori in un vetrino di silice sfumata</td></tr><tr><td>Litografia dei fagioli elettronici</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilene-diammina-tetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi a tenuta di mano</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>È collegato con "PFA Tubing Natural" per formare tubi luer-lock</td></tr><tr><td>Dado maschio senza flangia</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>È collegato con "PFA Tubing Natural" per formare tubi luer-lock</td></tr><tr><td>Liofilizzatore, HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>Utilizzato per la liofilizzazione di proteine liquide</td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td>Questo è un componente di 100x gloxy stock</td></tr><tr><td>Guanidinium cloridrato</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton Company</td><td>80065</td><td>Questa siringa viene utilizzata per l'iniezione di campioni</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>Utilizzato per FPLC (esclusione dimensionale)</td></tr><tr><td>Agitatore a piastra calda</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma</td><td>H1759</td><td>Utilizzato per Tris-HCl</td></tr><tr><td>Olio corrispondente all'indice</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Incisione ionica reattiva al plasma accoppiata induttivamente</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GC6586-100g</td><td>Utilizzato per l'induzione dell'attività della &beta;-galattosidasi</td></tr><tr><td>Lambda phage DNA</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>Terreni per la crescita cellulare di E.coli</td></tr><tr><td>Adattatore Luer 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>Questo collega luer-lock siringa e tubo</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Fisher bioreagenti</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Metil isobutililchetone (MIBK)</td><td>KAYAKU MATERIALI</td><td></td> AVANZATI <td>Utilizzato per lo sviluppo di soluzioni</td></tr><tr><td>Microscopio (Eclipse Ti2)</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Microscopio a fluorescenza invertita</td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 mm (n. 1)</td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>Vetrino bordo smerigliato 45 gradi, liscio 26 x 76 mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>Tipo di immersione: acqua, ingrandimento: 60x, correzione: 18, distanza di lavoro: 0,29 (0,31-0,28)</td></tr><tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS E. coli chimicamente competente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>Cellula competente per la sovraespressione delle proteine</td></tr><tr><td>Ossigeno (O2)</td><td>NOBLEGAS, Corea</td><td></td> del Sud <td>Purezza: >99,99%</td></tr><tr><td>Tubo PFA naturale</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>È collegato con "raccordi a tenuta di dita" per formare tubi luer-lock</td></tr><tr><td>Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF)</td><td>Roche</td><td>11359061001</td><td>Inibitore</td></tr> <tr><td>della proteasiSephacryl S-200 Alta risoluzione</td><td>Cytiva</td><td>17-0584-01</td><td>Utilizzato per FPLC (esclusione dimensionale)</td></tr><tr><td>Valvola di intercettazione</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por tubo a membrana molecolare, MWCO 6-8 kDa</td><td>Spectrum laboratories</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>Tetralfluoruro di zolfo (SF4)</td><td>NOBLEGAS, Corea</td><td></td> del Sud <td>Purezza: >99,99%</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>Tetrafluorometano (CF4)</td><td>NOBLEGAS, Corea</td><td></td> del Sud<td>Purezza: >99,99%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Utilizzato per Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>TOSOH</td><td>14715</td><td>Utilizzato per FPLC (scambio ionico)</td></tr> <tr><td>Assemblaggio Unione</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>Questo collega i tubi</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Forno a vuoto</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>Questo colorante di intercalazione è diluito in DMSO&</td></tr><tr><td>beta;-mercaptoetanolo (BME)</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del dna

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

La cromatina è una struttura di ordine superiore che impacchetta il DNA eucariotico. La cromatina subisce alterazioni dinamiche in funzione della fase del ciclo cellulare e in risposta a stimoli ambientali. Questi cambiamenti sono essenziali per l'integrità genomica, la regolazione epigenetica e le reazioni metaboliche del DNA come la replicazione, la trascrizione e la riparazione. L'assemblaggio della cromatina è cruciale per la dinamica della cromatina ed è catalizzato dagli chaperoni istonici. Nonostante studi approfonditi, i meccanismi con cui gli chaperoni istonici consentono l'assemblaggio della cromatina rimangono sfuggenti. Inoltre, le caratteristiche globali dei nucleosomi organizzati da chaperoni istonici sono poco comprese. Per affrontare questi problemi, questo lavoro descrive una tecnica unica di imaging a singola molecola chiamata DNA curtain, che facilita lo studio dei dettagli molecolari dell'assemblaggio del nucleosoma da parte degli chaperoni istonici. La tenda del DNA è una tecnica ibrida che combina la fluidità lipidica, la microfluidica e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) per fornire una piattaforma universale per l'imaging in tempo reale di diverse interazioni proteina-DNA. Utilizzando la cortina del DNA, viene studiata la funzione chaperone dell'istone di Abo1, l'ATPasi AAA+ contenente bromodominio di Schizosaccharomyces pombe , e viene rivelato il meccanismo molecolare alla base dell'assemblaggio istonico di Abo1. La tenda del DNA fornisce un approccio unico per lo studio della dinamica della cromatina.

Questo lavoro descrive la procedura per la preparazione delle cellule a flusso per il test a cortina di DNA (Figura 1A). Il test della tenda del DNA ha facilitato lo studio dell'assemblaggio del dimero dell'istone H3-H4 sul DNA da parte di Abo1. In primo luogo, la formazione della cortina di DNA è stata controllata colorando le molecole di DNA con YOYO-1, un colorante intercalante. Le linee verdi sono state mostrate in array paralleli, indicando che YOYO-1 si è intercalato in molecole di DNA...

DNA curtain, una tecnica di imaging ad alto rendimento di una singola molecola, fornisce una piattaforma per la visualizzazione in tempo reale di diverse interazioni proteina-DNA. Il presente protocollo utilizza la tecnica della cortina del DNA per studiare il ruolo biologico e il meccanismo molecolare di Abo1, una ATPasi AAA+ contenente bromodominio pombe di Schizosaccharomyces .

Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Questo protocollo mostra come la tecnica del DNA curtain sia utilizzata per studiare la dinamica della cromatina, in particolare studiando la funzione molecolare degli chaperoni istonici. La tenda del DNA della tecnica di imaging a singola molecola ad alto rendimento supera i limiti degli esperimenti di massa e facilita l'imaging in tempo reale, consentendo la caratterizzazione dettagliata delle interazioni delle biomolecole. Metti una carta pulita di dimensioni 5 x 35 millimetri al centro del nastro biadesivo.Attacca il nastro adesivo sopra la diapositiva per coprire i due fori e i nano motivi con la carta. Quindi asportare la carta utilizzando una lama pulita. Metti un vetrino coprioggetto sopra il nastro biadesivo e strofina il vetrino coprioggetto usando la punta di una pipetta per formare una camera microfluidica.Posizionare la cella di flusso assemblata tra due vetrini per microscopio e agganciarli. Cuocere la cella di flusso in un forno sottovuoto a 120 gradi Celsius per 45 minuti. Collegare il connettore del fluido per l'analisi basata su chip a ciascun foro aperto utilizzando una pistola per colla a caldo.E collegare le due linee di tubi di blocco dell'esca. Collegare una siringa lure lock contenente tre millilitri di acqua deionizzata e lavare la camera. Lavare nuovamente la camera con tre millilitri di tampone lipidico tramite connessione goccia a goccia.Iniettare un millilitro di lipide biotinilato 0,04x in tampone lipidico, nella camera, in due colpi, con un'incubazione di cinque minuti per iniezione. Iniettare 0,025 milligrammi per millilitro di streptavidina in un millilitro di BSA, con due colpi e un'incubazione di 10 minuti per iniezione. Iniettare circa 30 picomolari di DNA di fago lambda biotinilato in un millilitro di tampone BSA, nella camera con due colpi e incubazioni di 10 minuti per iniezione.Collegare una siringa contenente 10 millilitri di tampone di imaging a una pompa a siringa e rimuovere le bolle in tutte le linee di tubi del sistema microfluidico. Accoppiare la cella di flusso preparata con il sistema microfluidico tramite connessione drop-to-drop per evitare l'iniezione di bolle nella cella di flusso. Assemblare la cella di flusso e i supporti della cella di flusso e montare il gruppo su un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale costruito su misura.Iniettare 200 microlitri di colorante YOYO-1 nel tampone di imaging attraverso 100 microlitri di loop del campione per colorare le molecole di DNA Lambda. Esegui il software di imaging e accendi il laser a 488 nanometri per verificare se le cortine di DNA sono ben formate. Dopo aver rimosso il colorante YOYO-1, iniettare il campione proteico pre-incubato.Quando le proteine raggiungono la cortina di DNA, spegnere la pompa della siringa, chiudere la valvola di intercettazione e incubare per 15 minuti per il caricamento degli istoni da parte di Abo1. Lavare via l'Abo1 non legato e le proteine istoniche per cinque minuti. Disattivare temporaneamente il flusso tampone per verificare se le proteine istoniche sono caricate sul DNA.La formazione della cortina di DNA è stata controllata colorando le molecole di DNA con un colorante interpolante. Le linee verdi mostrate in array paralleli indicavano che YOYO1 intercalato nelle molecole di DNA erano ben allineate e allungate a una barriera di diffusione sotto flusso idrodinamico. Quando i dimeri Cy5-H3-H4 sono stati iniettati nella cortina di DNA in assenza di Abo1, Cy5-H3-H4 non si è legato al DNA, indicando una mancanza di legame spontaneo dei dimeri H3-H4 al DNA.Quando Cy5-H3-H4 è stato iniettato con Abo1, sono stati osservati punti fluorescenti rossi sulle molecole di DNA, suggerendo che Abo1 carica dimeri H3-H4 sul DNA. I segnali fluorescenti sono scomparsi in assenza di flusso tampone e sono riapparsi quando il flusso è stato ripreso, suggerendo che i dimeri H3-H4 si legano al DNA. Il legame dei dimeri H3-H4 al DNA è stato confermato anche dal chimografo, in cui i segnali di fluorescenza scomparivano ogni volta che il flusso veniva interrotto.Pochi punti fluorescenti sono apparsi nella cortina del DNA, sia in assenza di nucleotidi che in presenza di ADP, indicando che i dimeri H3-H4 raramente si legano al DNA, sia nello stato Apo che in presenza di ADP. L'analisi quantitativa mostra che il numero di dimeri H3-H4 legati al DNA aumenta in presenza di ATP. I risultati suggeriscono che l'idrolisi dell'ATP è essenziale per il caricamento di H3-H4 sul DNA da parte di Abo1.Evitare l'iniezione di bolle nella cella di flusso è la cosa più critica per tutte le fasi. Quindi, in questo protocollo, enfatizziamo le connessioni drop-by-drop. Il test della tenda del DNA può essere esteso alle tende del DNA a doppio legame con doppi nano-pattern.Inoltre, possiamo creare un altro tipo di cortina di DNA con filamenti di DNA, RNA o actina a singolo filamento. La tenda del DNA consente la visualizzazione del movimento delle proteine sul DNA e facilita lo studio del meccanismo di ricerca del bersaglio. La cortina del DNA può essere estesa per studiare il metabolismo del DNA, compresa la replicazione e la trascrizione.

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L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Il pacchetto software 3DNA è un popolare e versatile strumento di bioinformatica con capacità di analizzare, costruire, e visualizzare le strutture di acidi nucleici tridimensionali. Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per un sottoinsieme di nuove e popolari funzionalità disponibili in 3DNA, applicabili ad entrambe le singole strutture e insiemi di strutture correlate.

Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

Questo video descrive un metodo per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su molecole di DNA in loci specifici utilizzando l'imaging a singola molecola. Questi condensati si formano a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, che consentono il reclutamento della RNA polimerasi II e una migliore trascrizione genica.

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Un metodo viene presentato per la ricostituzione del modello nucleosomal array di istoni fondamentali ricombinanti e tandem ripetute di DNA posizionamento dei nucleosomi. Abbiamo anche descrivono come gli esperimenti di velocità di sedimentazione nel ultracentrifuga analitica e microscopia a forza atomica (AFM) vengono utilizzati per monitorare il grado di saturazione matrice nucleosomal dopo la ricostituzione.

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Il danno mirato al DNA può essere ottenuto legando un agente dannoso al DNA a un oligonucleotide (TFO) che forma un triplex. Utilizzando TFO modificati, l'associazione proteica specifica per il danno al DNA e la modifica della topologia del DNA possono essere studiate nelle cellule umane utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina modificata e saggi di superavvolgimento del DNA qui descritti.

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Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

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Qui, descriviamo l'uso del metodo di imaging a singola molecola, DNA Curtains, per studiare il meccanismo biofisico dell'assemblaggio dei condensati EWS-FLI1 sul DNA.

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Scopri la tecnica DNA curtain per studiare l'assemblaggio degli istoni e le dinamiche della cromatina in tempo reale. Questo metodo ad alta portata supera i limiti degli esperimenti in massa.

Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

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