Name: Rimozione dellocchio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dallinnervazione e lo sviluppo del sistema visivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Scopri la rimozione unilaterale dell'occhio nelle larve di zebrafish per studiare lo sviluppo del tectum ottico e la degenerazione assonale. Questo metodo consente di confrontare i lobi innervati e denervati nello stesso animale.

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Il finanziamento per questo lavoro è stato sostenuto principalmente da fondi di start-up dal Reed College a KLC, dai fondi Helen Stafford Research Fellowship a OLH e da una Reed College Science Research Fellowship a YK. Questo progetto è iniziato nel laboratorio di Steve Wilson come collaborazione con le risorse umane, che è stato supportato da un Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Ringraziamo Máté Varga, Steve Wilson e altri membri del laboratorio Wilson per le discussioni iniziali su questo progetto, e ringraziamo in particolare Florencia Cavodeassi e Kate Edwards, che sono state le prime a insegnare a KLC come montare embrioni in agarosio ed eseguire dissezioni cerebrali di zebrafish. Ringraziamo anche Greta Glover e Jay Ewing per l'aiuto nell'assemblaggio del nostro dispositivo di affilatura ad ago in tungsteno.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Le tecniche descritte in questo articolo illustrano uno dei tanti approcci per lo studio dello sviluppo del sistema visivo dei vertebrati nel pesce zebra. Altri ricercatori hanno pubblicato metodi per sezionare la retina embrionale ed eseguire analisi di espressione genica19 o visualizzare l'attività neuronale nel tectum ottico30. Questo documento fornisce un approccio per esplorare come l'input retinico differenziale può influenzare i comportamenti cellulari nel tectum ott...

L'obiettivo di questo metodo è quello di indagare come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico, il centro di elaborazione visiva nel cervello del pesce zebra. Rimuovendo un occhio e quindi confrontando i due lati del tectum ottico, è possibile osservare e normalizzare i cambiamenti tectali all'interno dello stesso campione, consentendo il confronto tra più campioni. I moderni approcci molecolari combinati con questa tecnica forniranno informazioni sui meccanismi alla base della crescita e dello sviluppo del sistema visivo, nonché della degenerazione e rigenerazione assonale.
I sistemi sensoriali - visivi, uditivi e somatosensoriali - raccolgono informazioni dagli organi esterni e trasmettono tali informazioni al sistema nervoso centrale, generando "mappe" del mondo esterno attraverso il mesencefalo 1,2. La visione è la modalità sensoriale dominante per quasi tutti i vertebrati, compresi molti pesci. La retina, il tessuto neurale dell'occhio, raccoglie informazioni con un circuito neuronale costituito principalmente da fotorecettori, cellule bipolari e cellule gangliari retiniche (RGC), i neuroni di proiezione della retina. Gli RGC hanno lunghi assoni che trovano la loro strada attraverso la superficie interna della retina fino alla testa del nervo ottico, dove si fascicolano e viaggiano insieme attraverso il cervello, terminando infine nel centro di elaborazione visiva nel mesencefalo dorsale. Questa struttura è chiamata tectum ottico nei pesci e in altri vertebrati non mammiferi ed è omologa al collicolo superiore nei mammiferi3.
Il tectum ottico è una struttura multistrato bilateralmente simmetrica nel mesencefalo dorsale. Nel pesce zebra e nella maggior parte degli altri pesci, ogni lobo del tectum ottico riceve input visivi esclusivamente dall'occhio controlaterale, in modo tale che il nervo ottico sinistro termina nel lobo tectale destro e il nervo ottico destro termina nel lobo tectale sinistro4 (Figura 1). Come la sua controparte mammifera, il collicolo superiore, il tectum ottico integra le informazioni visive con altri input sensoriali, tra cui l'audizione e la somatosensazione, controllando i cambiamenti nell'attenzione visiva e nei movimenti oculari come le saccadi 1,5,6. Tuttavia, a differenza del collicolo superiore dei mammiferi, il tectum ottico genera continuamente nuovi neuroni e glia da una nicchia di cellule staminali specializzate vicino ai bordi mediali e caudali dei lobi tettoli chiamati zona di proliferazione tectale7. Il mantenimento dei progenitori proliferativi nel tectum ottico e in altre regioni del sistema nervoso centrale contribuisce, in parte, alla notevole capacità rigenerativa documentata nel pesce zebra8.
Lavori precedenti che esaminano il cervello di pesci ciechi o con un occhio solo hanno rivelato che la dimensione del tectum ottico è direttamente proporzionale alla quantità di innervazione retinica che riceve 9,10,11. Nei pesci delle caverne adulti, i cui occhi degenerano nell'embriogenesi precoce, il tectum ottico è notevolmente più piccolo di quello dei pesci di superficie strettamente imparentati e vedenti9. La degenerazione dell'occhio di pesce delle caverne può essere bloccata sostituendo la lente endogena con una lente da un pesce di superficie durante l'embriogenesi. Quando questi pesci delle caverne con un occhio solo vengono allevati fino all'età adulta, il lobo tectale innervato contiene circa il 10% in più di cellule rispetto al lobo tectale non innervato9. Allo stesso modo, nei killifish larvali che sono stati incubati con trattamenti chimici per generare occhi di dimensioni diverse all'interno dello stesso individuo, il lato del tectum con più innervazione era più grande e conteneva più neuroni10. Le prove degli esperimenti di schiacciamento del nervo ottico nel pesce rosso adulto indicano che l'innervazione promuove la proliferazione, con la proliferazione delle cellule tettoniche che diminuisce quando l'innervazione è stata interrotta11.
Confermando ed estendendo questi studi classici, diversi rapporti recenti forniscono dati che suggeriscono che la proliferazione in risposta all'innervazione è modulata, almeno in parte, dalla via BDNF-TrkB12,13. Rimangono molte domande aperte sulla crescita e lo sviluppo del tectum ottico, incluso il modo in cui un sistema sensoriale in via di sviluppo affronta la degenerazione di lesioni e assoni, quali segnali cellulari e molecolari consentono l'input retinico per regolare la crescita del tectum ottico, quando questi meccanismi diventano attivi e se la proliferazione e la differenziazione legate all'innervazione consentono alla retina e al suo tessuto bersaglio di coordinare i tassi di crescita e garantire un'accurata mappatura retinotopica. Inoltre, ci sono domande molto più grandi sullo sviluppo dipendente dall'attività che possono essere affrontate interrogando il sistema visivo del pesce zebra con approcci chirurgici come quello descritto di seguito.
Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari con cui l'attività neurale, in particolare dall'input visivo, altera la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, l'approccio descritto confronta direttamente i lobi tettoli innervati e denervati (Figura 1) all'interno delle singole larve di zebrafish. Questo metodo consente la documentazione della degenerazione dell'assone RGC nel tectum ottico e la conferma che il numero di cellule mitotiche è correlato all'innervazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Figura 1: Schizzi di larve di zebrafish prima e dopo la rimozione unilaterale dell'occhio. (A) Disegno di 5 larve dpf viste al microscopio di dissezione. Ogni larva è incorporata in agarosio a basso punto di fusione e orientata lateralmente prima che un ago di tungsteno con una punta affilata e uncinata venga utilizzato per estrarre l'occhio rivolto verso l'alto (occhio sinistro in questo esempio). (B) Disegno della vista dorsale di una larva di 9 dpf risultante dall'intervento chirurgico raffigurato in A. Solo tre assoni RGC altamente schematizzati dall'occhio destro sono mostrati defascicolare e connettersi con i neuroni nel lobo tectale sinistro. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; dps = giorni dopo l'intervento; RGC = cellule gangliari retiniche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Attrezzature e forniture:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scatole di allevamento</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning grasso per alto vuoto</td><td>Sigma o fornitore equivalente</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer palloni (125 mL)</td><td></td><td></td><td>Per la produzione di Marc's Modified Ringers (MMR) con antibiotici per l'incubazione post-operatoria.</td></tr><tr><td>Pinze fini - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur DWK</td><td>Lifescience</td><td>63A53 e 63A53WT</td><td>Per il pipettaggio di embrioni e larve.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopia</td><td>VWR o fornitore equivalente</td><td>48311-703</td><td>I vetrini per microscopio in vetro standard possono essere ordinati da diversi fornitori di laboratori.</td></tr><tr><td>Vetreria, comprese le bottiglie graduate e i cilindri graduati</td><td>Per la produzione e la conservazione</td> di <td></td><td></td> soluzioni.</tr><tr><td>Resina epossidica in 2 parti</td><td>ACE Hardware o altro fornitore equivalente di Gorilla Glue o</td><td>equivalente Siringa da 0,85 once</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga (1,7 mL)</td><td>VWR o fornitore equivalente</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per perno nichelato (lunghezza 17 cm)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>26018-17</td><td>Per tenere il filo di tungsteno durante l'affilatura e l'esecuzione di interventi chirurgici/dissezioni.</td></tr><tr><td>Filtro da tè in rete di nylon o equivalente</td><td>Ali Express o equivalente</td><td></td><td>per la raccolta delle uova di zebrafish dopo la deposizione delle uova; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>Graffetta</td><td></td><td></td><td>per dispositivo di affilatura dell'ago in tungsteno.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri 100 mm</td><td>Fischer Scientific o fornitore equivalente</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 35 mm</td><td>Fischer Scientific o fornitore equivalente</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per pipette</td><td>SP Bel-Art o equivalente</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>Per dispositivo di affilatura dell'ago di tungsteno. Preparare una soluzione al 10% p/v di KOH nella cappa aggiungendo pellet all'acqua deionizzata.</td></tr><tr><td>Alimentazione (tensione variabile)</td><td></td><td></td> <td>Per dispositivo di affilatura dell'ago in tungsteno. Funzionerà qualsiasi alimentatore con tensione variabile (anche uno utilizzato per l'elettroforesi su gel).</td></tr><tr><td>Kit di elastomeri Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>Filo di tungsteno (diametro 0,125 mm)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>Affilare per rimuovere l'occhio e sezionare le larve.</td></tr><tr><td>Blocco termico a temperatura variabile</td><td>Il Lab Depot o un fornitore equivalente</td><td>BSH1001 o BSH1002</td><td>Impostato su 40-42 gradi C prima degli esperimenti.</td></tr><tr><td>Barattolo di vetro a bocca larga con coperchio (ad es. barattolo di marmellata o salsa pulito)</td><td></td><td></td><td>Per dispositivo di affilatura dell'ago in tungsteno.</td></tr><tr><td>Fili con cavi a coccodrillo per dispositivo</td><td></td><td></td><td>di affilatura dell'ago di tungsteno.</td></tr><tr><td>Microscopi:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> da dissezione <td>Qualsiasi tipo funzionerà, ma è preferibile avere una luce trasmessa regolabile su una base a specchio.</td></tr><tr><td>Si consiglia un</td><td></td><td></td><td>obiettivo a immersione in acqua High NA, 20-25x. Qui viene utilizzato il software di controllo del microscopio e di acquisizione delle immagini (NIS-Elements di Nikon), ma qualsiasi microscopio confocale funzionerà.</td></tr><tr><td>Reagenti per interventi chirurgici e dissezioni:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Per i ringer modificati di Marc (MMR) e il terreno embrionale (E3).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>Per suonerie modificate Marc (MMR).</td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Make 1% in terreno embrionale (E3) o Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>Per terreno embrionale (E3).</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>per suonerie modificate (MMR) di Marc.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Microscopia Elettronica Scienze</td><td>19210</td><td>Diluire 8% (p/v) con 2x PBS concentrato (diluito da 10x PBS).</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>Diluire 1:100 nelle suonerie modificate di Marc.</td></tr><tr><td>Compresse di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Diagnostic BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>Produrre 10 scorte in acqua deionizzata, sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Diluire a 1x la concentrazione di lavoro.</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>per i Ringer modificati (MMR) e il terreno embrionale (E3) di Marc.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Per i Ringer modificati di Marc (MMR) e il terreno embrionale (E3).</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Make 10 M e utilizzare per regolare il pH di MMR a 7,4.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>Ricetta:</td></tr> <tr><td>https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINEReagenti per immunoistochimica:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 taged Anticorpo secondario per rilevare le IgG di coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Utilizzare a diluizione 1:500 per wholemount immunoistochimica.</td></tr><tr><td>DAPI o ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 o T3605</td><td>Compongono soluzioni da 1 mg/mL in DMSO; diluizione 1:5.000 per la controcolorazione.</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Un componente del tampone immunobloccante.</td></tr><tr><td>Metanolo (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>La miscelazione di MeOH con soluzioni acquose come PBST è esotermica. Preparare le soluzioni MeOH/PBST con almeno diverse ore di anticipo o raffreddarle con ghiaccio prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>Un componente del tampone immunobloccante. Può essere aliquotato in volumi da 1-10 mL e conservato a -20 °C.</td></tr><tr><td>Anticorpo primario per rilevare il fosfoistone H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Utilizzare a diluizione 1:300 per l'immunoistochimica a montaggio intero.</td></tr><tr><td>Anticorpo primario per rilevare la proteina fluorescente rossa (RFP; rileva i derivati dsRed)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>Utilizzare a diluizione 1:500 per l'immunoistochimica a montaggio intero.</td></tr><tr><td>Proteinasi K (PK)</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>Preparare 10 mg/mL di soluzioni madre in PBS e utilizzare a 10 &micro; g/mL.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Utile per realizzare una soluzione stock al 20% (v/v) in PBS.</td></tr><tr><td>Software per l'analisi dei dati</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td></td><td>Freeware per l'analisi delle immagini; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>Freeware per l'analisi statistica e la visualizzazione dei dati; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Adobe Photoshop o GIMP</td><td></td><td></td><td>I software proprietari di elaborazione delle immagini (Adobe Photoshop e Illustrator) sono spesso utilizzati per comporre figure). Un'alternativa freeware è Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)<</td></tr><tr><td>strong>Zebrafish ceins. Questo studio ha utilizzato i ceppi AB, TU, Tg[atoh7:RFP].</td><td></td><td></td><td>Disponibile dal&nbsp; Centri di risorse internazionali Zebrafish negli Stati Uniti (https://zebrafish.org/home/guide.php) o in Europa (https://www.ezrc.kit.edu/). I ceppi transgenici specializzati che non sono ancora stati depositati in nessuno dei due centri di risorse possono essere richiesti ai singoli laboratori dopo la pubblicazione.</td></tr></tbody></table>

rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

I pesci zebra mostrano una notevole crescita per tutta la vita e capacità rigenerative. Ad esempio, nicchie di cellule staminali specializzate stabilite durante l'embriogenesi supportano la crescita continua dell'intero sistema visivo, sia nell'occhio che nel cervello. La crescita coordinata tra la retina e il tectum ottico garantisce un'accurata mappatura retinotopica quando vengono aggiunti nuovi neuroni negli occhi e nel cervello. Per capire se gli assoni retinici forniscono informazioni cruciali per la regolazione dei comportamenti delle cellule staminali e progenitrici del tectale come la sopravvivenza, la proliferazione e / o la differenziazione, è necessario essere in grado di confrontare i lobi tettoli innervati e denervati all'interno dello stesso animale e tra gli animali. 
La rimozione chirurgica di un occhio dal pesce zebra larvale vivente seguita dall'osservazione del tectum ottico raggiunge questo obiettivo. Il video di accompagnamento dimostra come anestetizzare le larve, affilare elettroliticamente gli aghi di tungsteno e usarli per rimuovere un occhio. Successivamente mostra come sezionare il cervello dalle larve fisse di zebrafish. Infine, il video fornisce una panoramica del protocollo per l'immunoistochimica e una dimostrazione di come montare embrioni colorati in agarosio a basso punto di fusione per la microscopia.

Per confermare se la rimozione dell'occhio fosse completa e valutare come cambia il tectum ottico, sono stati eseguiti interventi chirurgici nel ceppo Tg[atoh7:RFP], che etichetta tutti gli RGC con una RFP mirata alla membrana e, quindi, tutti gli assoni che proiettano dalla retina e formano il nervo ottico24. Sebbene l'uso di questo ceppo non sia assolutamente necessario, consente l'osservazione e la visualizzazione semplici dei termini del nervo ottico nel neuropil del tectum ottico. Sa...

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Quindi il mio laboratorio è interessato a capire come l'occhio e il cervello crescono insieme. Questa tecnica ci permette di studiare come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del cervello. La rimozione chirurgica di un occhio dal pesce zebra larvale vivente, seguita dall'osservazione del tectum ottico, ci consente di confrontare i lobi tettoli innervati e denervati all'interno dello stesso animale e tra gli animali.La combinazione di questa tecnica con i moderni approcci molecolari può fornire nuove informazioni sui meccanismi alla base dello sviluppo neurale, della rigenerazione e della degenerazione. Per iniziare, collegare i fili del catodo e dell'anodo all'alimentatore. Attaccare la clip di alligatore all'estremità del filo catodico a una graffetta parzialmente raddrizzata e inserire la graffetta nella soluzione di idrossido di potassio, attaccandola al lato del barattolo.Attaccare la clip a coccodrillo del filo anodico al collo del supporto dell'ago. Girare l'alimentazione a circa 20 volt e immergere il filo di tungsteno nella soluzione di idrossido di potassio, estraendo il filo dalla soluzione ad angolo per affilare elettroliticamente il filo in una punta fine. Controllare la punta dell'ago sotto il microscopio di dissezione per assicurarsi che sia abbastanza affilata.La punta dell'ago curva si verifica quando l'ago affilato viene piegato toccandolo delicatamente alla capsula di Petri. Il giorno dell'intervento chirurgico, utilizzare una pipetta di pascolo in vetro a foro largo per trasferire da 10 a 15 larve in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con E3 fresco. Aggiungi da tre a cinque gocce di anestetico alla larva. Per determinare se le larve sono adeguatamente anestetizzate, cerca la mancanza di risposta al tocco.Aggiungere altre due o tre gocce dell'anestetico se le larve sono ancora reattive al tatto dopo tre minuti e rivalutare. Per immobilizzare la larva per un intervento chirurgico, prendi una larva in una pipetta di pascolo di vetro a canna stretta con solo una piccola quantità di E3. Successivamente, assumere circa 200 microlitri di fuso 1% a basso punto di fusione o agarosio LMP nella pipetta contenente la larva e mescolare per garantire che la larva sia sospesa nell'agarosio LMP. Posizionare il coperchio di una capsula di Petri da 35 millimetri rivolta verso l'alto sotto il microscopio di dissezione, quindi spruzzare la larva e l'agarosio sul coperchio capovolto della capsula di Petri.Diffondi l'agarosio in modo che la larva sia al centro della goccia. Usando un ago di tungsteno opaco, manovrare rapidamente ma delicatamente la larva in modo che sia laterale con un occhio rivolto verso l'alto. Attendere diversi minuti affinché l'agarosio si fissi.Seguendo il bordo dell'orbita oculare, utilizzare la punta di un ago di tungsteno affilato elettroliticamente per perforare la pelle intorno all'occhio. Quindi far scorrere il bordo dell'ago sotto l'occhio dal lato temporale-ventrale dell'occhio. Utilizzare una pressione controllata per rilasciare l'occhio dalla presa.Continuare a premere l'occhio dorsalmente e anteriormente con il lato dell'ago, alla fine tagliando attraverso il nervo ottico e rilasciando l'occhio. In alternativa, è possibile utilizzare pinze chirurgiche molto fini per rimuovere l'occhio pizzicando il nervo ottico e spingendo l'occhio dal mediale al laterale. Dopo aver rimosso con successo gli occhi, coprire l'agarosio con la soluzione MMR, liberare ogni larva dall'agarosio spazzolando delicatamente un ago di tungsteno intorno alla testa e poi intorno al corpo, mentre si stabilizza la palpebra della capsula di Petri con una pinza.Dopo gli interventi chirurgici, posizionare la larva in soluzione MMR integrata con antibiotici fino al giorno seguente, quindi riportare la larva in E3 e allevarla fino al punto finale dell'esperimento. Dopo che le larve sono state anestetizzate terminalmente, fissarle con il 4% di paraformaldeide. Sospendere le larve fisse in goccioline PBS su una piastra di protezione del sigillo al microscopio di dissezione.Fissarli lateralmente posizionando due perni di tungsteno attraverso la notocorda con un perno posteriore all'area pigmentata che copre la regione AGM e un altro in linea con la fine dell'estensione del tuorlo. Rimuovere l'occhio con un ago di tungsteno affilato e una pinza fine. A volte è possibile colpire l'ago attraverso la mascella sul lato opposto e rimuovere l'altro occhio.Utilizzare l'ago di tungsteno per graffiare dal lato temporale a quello ventrale dell'orecchio. Nella stessa azione in movimento, portare l'ago posteriore alla mascella e tirare delicatamente anteriormente fino a quando l'orecchio e la mascella non vengono rimossi. Rimuovere l'altro occhio e orecchio colpendo l'ago attraverso la mascella.Usa la pinza per estrarre gli organi ventrali e il tuorlo rimanente. Infine, fare un'incisione superficiale nella pelle cranica dorsale vicino alla giunzione tra il cervello posteriore e il midollo spinale. Sollevare la pelle con la pinza e tirarla anteriormente e intorno al telencefalo.Rimuovere qualsiasi tessuto rimanente con una pinza. Staccare la larva e trasferirla in PBS in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Fissare una diapositiva camerata nel coperchio di una capsula di Petri da 100 millimetri con grasso sottovuoto.Trasferire la larva immunocolorata e lavorata su una piastra di pozzo o un vetrino di depressione per visualizzarli con un microscopio di dissezione. Montare la larva sulla diapositiva camerata in colonne di agarosio LMP all'1%. Usando un bicchiere oltre la pipetta, metti una larva sul vetrino camerato, depositando il minor PBS possibile.Coprire la larva con agarosio fuso e caldo 1% LMP usando la stessa pipetta. Pipettare l'Agarosio LMP in una colonna e quindi posizionare la larva nel modo più simmetrico possibile con la superficie dorsale visibile. Dopo la rimozione dell'occhio, è stata osservata una progressiva degenerazione degli assoni retinici nel neuropil ottico del tectum.Due giorni dopo l'intervento chirurgico, gli assoni etichettati RFP mostravano segni distintivi di rapida degenerazione walleriana, come la sfalsatura e la frammentazione. I puncta positivi alla RFP sono stati notati sia all'interno che all'esterno del neuropil sul lato destro del tectum come indicato dalle frecce. Entro quattro giorni dopo l'intervento chirurgico, gli assoni frammentati e i detriti assonali marcati RFP sono stati notevolmente ridotti nel lobo tectale destro, indicando una clearance relativamente rapida degli assoni morenti e degenerativi.Il cervello è stato esposto sezionando gli occhi, la mascella, le orecchie e la calotta cranica della pelle e dei tessuti connettivi. Idealmente, il cervello rimane intatto durante questa procedura. Tuttavia, parti del cervello anteriore, in particolare il bulbo olfattivo, sono state probabilmente danneggiate o completamente rimosse quando è stata rimossa la calotta cranica della pelle o della mascella.Inoltre, a volte la sporgenza laterale del tectum viene tagliata quando si perfora o si pizzica la pelle per estrarla dal cervello. Non esistono due campioni identici. Quindi devi essere in grado di apportare sottili adattamenti attraverso la rimozione degli occhi e la dissezione del cervello, se necessario.I pazienti e gli strumenti affilati sono essenziali per il successo. Questa tecnica può essere seguita da approcci cellulari e molecolari, come l'imaging di cellule vive in vivo o il sequenziamento dell'RNA per ottenere nuove conoscenze sui meccanismi molecolari e cellulari della crescita e dello sviluppo del tectum ottico.

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In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Lente sviluppo comporta interazioni con altri tessuti. Diversi mutanti occhio zebrafish sono caratterizzati da una dimensione lente anormalmente piccole. Qui mostriamo un esperimento di trapianto di lente per determinare se questo fenotipo è dovuto a cause intrinseche o le interazioni difettoso con tessuti che circondano l'obiettivo.

Lens trapianto in Zebrafish e la sua applicazione nell&#39;analisi dei Mutanti Eye

Il VisioTracker è un sistema automatizzato per l'analisi quantitativa di prestazioni visive dei pesci adulti e larve piccole basa sulla registrazione dei movimenti oculari. È dotato di un controllo completo sulle proprietà stimolo visivo e analisi in tempo reale, consentendo di alto-rendimento di ricerca in settori quali lo sviluppo del sistema visivo e la funzione, farmacologia, studi di circuiti neurali e l'integrazione senso-motoria.

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Fonte: Schramm, P. et al. Imaging in vivo di tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish sveglie e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle. J. Vis. Exp. (2021)Questo video dimostra l'imaging in vivo dei neuroni cerebellari nelle larve transgeniche di zebrafish, che esprimono proteine fluorescenti nei neuroni di Purkinje. Il processo prevede l'anestetizzazione delle larve, l'immobilizzazione in agarosio e la rimozione accurata della pelle pigmentata per migliorare la...

Imaging in vivo del cervello larvale di pesce zebra per la visualizzazione dei neuroni cerebellari

Presentiamo un metodo per l'analisi elettroretinografica (ERG) delle larve di zebrafish utilizzando tecniche di micromanipolazione ed elettroretinografia. Questo è un metodo semplice e diretto per saggiare la funzione visiva delle larve di zebrafish in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso è uno strumento eccellente per l'imaging dello sviluppo embrionale. Consente la registrazione di lunghi filmati time-lapse di embrioni vivi in condizioni quasi fisiologiche. Dimostriamo la sua applicazione per l'imaging dello sviluppo dell'occhio di zebrafish su ampie scale spazio-temporali e presentiamo una pipeline per la fusione e la deconvoluzione di set di dati multiview.

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all&#39;Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo che semplifica la misurazione della luce dell'elettroretinogramma evocato le risposte dallo zebrafish larvale. Un elettrodo di romanzo spugna a forma di cono-Punta può contribuire a rendere lo studio di sviluppo visivo in zebrafish larvale utilizzando l'elettroretinogramma ERG più facile raggiungere con risultati attendibili e costi inferiori.

Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Qui presentiamo un metodo per immaginare il cervello embrionale del pesce zebra in vivo fino agli stadi larvale e giovanile. Questa procedura microinvasiva, adattata da approcci elettrofisiologici, fornisce l'accesso ai dettagli cellulari e subcellulari del neurone maturo e può essere combinata con studi optogenetici e neurofarmacologici per caratterizzare la funzione cerebrale e l'intervento farmacologico.

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Qui, viene fornito un protocollo per l'imaging time-lapse della morfogenesi oculare utilizzando un microscopio lightsheet disponibile in commercio e una workstation di elaborazione delle immagini per analizzare i dati risultanti. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per l'anestesia embrionale, l'incorporamento nell'agarosio a bassa temperatura di fusione, la sospensione nella camera di imaging, l'impostazione dei parametri di imaging e infine l'analisi dei dati di imaging...

Visualizzazione della morfogenesi oculare mediante microscopia Lightsheet utilizzando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Scopri la rimozione unilaterale dell'occhio nelle larve di zebrafish per studiare lo sviluppo del tectum ottico e la degenerazione assonale. Questo metodo consente di confrontare i lobi innervati e denervati nello stesso animale.

Rimozione dellocchio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dallinnervazione e lo sviluppo del sistema visivo (Video) | JoVE Journal

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

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