Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione
April 5th, 2022
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.
Questo protocollo aiuta a isolare la microglia dalle lesioni demielinizzanti microdissecate del cervello del topo adulto per studiare le caratteristiche microgliali in vivo. Questa tecnica consente di risparmiare tempo e ha requisiti inferiori sia per gli sperimentatori che per le attrezzature. Questo metodo aiuta a isolare le microglia dal cervello dell'animale, in particolare quei tessuti microdissezionati in vari stati patologici.
Inizia microdissezionando le lesioni etichettate con colorante neutro attorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio. Centrifugare il tessuto sezionato a 300 volte g per 30 secondi per raccogliere il campione sul fondo del tubo. Preriscaldare la miscela enzimatica uno e la miscela enzimatica da due a 37 gradi Celsius in un'incubatrice.
Quindi, aggiungere 1.950 microlitri di miscela enzimatica preriscaldata uno a un campione e digerire in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere 30 microlitri di enzima preriscaldamento mescolare due e mescolare delicatamente. Dopo la digestione, aggiungere quattro millilitri di PBS freddo al tubo e agitare delicatamente.
Centrifugare i campioni di tessuto a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante lentamente e completamente. Risospesciare delicatamente il pellet cellulare con 1.550 microlitri di PBS freddo. Aggiungere 450 microlitri della soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolarli bene.
Utilizzare una pipetta da 1.000 microliti per sovrapporre la miscela molto lentamente e delicatamente con due millilitri di PBS freddo. Centrifugare la miscela e quindi cercare i tre strati. Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aspirare completamente i due strati superiori e riempire il tubo fino a cinque millilitri con tampone di carico a freddo.
Capovolgere delicatamente il tubo tre volte. Successivamente, dopo la centrifugazione e l'aspirazione del surnatante, risospesere il pellet di cella con 90 microlitri di buffer di carico e aggiungere 10 microlitri di perline CD11b. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro del tampone di carico e lavare le cellule convogliando delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1.000 microliti. Centrifugare le cellule a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate. Risospesciare le celle in 500 microlitri del buffer di carico e posizionare la colonna MS con il suo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico.
Risciacquare la colonna con 500 microlitri del buffer di carico per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica basata sul protocollo del produttore. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna MS ed eliminare il flusso passante contenente le celle senza etichetta. Aggiungere 500 microlitri del buffer di carico per lavare la colonna e rimuoverla dal separatore.
Posizionare la colonna su un tubo di centrifuga da 15 millilitri e aggiungere un millilitro del buffer di carico nella colonna. Infine, spingere lo stantuffo sul fondo della colonna per scovare le celle etichettate magneticamente. Una rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso di microglia isolate da lesioni demielinizzanti di topi adulti prima e dopo lo smistamento cellulare attivato magneticamente è mostrata qui.
Le immagini grafiche rappresentano l'altezza di dispersione in avanti e l'altezza di dispersione laterale per la selezione delle celle, l'area di dispersione in avanti e l'altezza di dispersione in avanti per la selezione di celle singole e CD11b-FITC e CD45-APC per la selezione delle cellule mieloidi e delle microglia. La proporzione di microglia è aumentata significativamente dopo la selezione cellulare attivata magneticamente. L'immagine grafica rappresenta la strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso per singole cellule vive e morte dopo lo smistamento cellulare attivato magneticamente.
Qui, la 7-aminoactinomicina D e l'altezza di dispersione laterale sono state utilizzate per selezionare le cellule viventi. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di microdissettare con precisione le lesioni demielinizzanti sotto uno stereomicroscopio basato sui segni rossi neutri.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria dalle lesioni di demielinizzazione nel cervello di topi adulti. Utilizzando la separazione cellulare attivata magneticamente su colonna, il metodo facilita lo studio delle caratteristiche microgliali in vivo ottimizzando al contempo i tempi e i requisiti di risorse.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Neuropatologia
Sfondo
- La microglia svolge ruoli critici nella neuroinfiammazione e nelle malattie del sistema nervoso centrale.
- Comprendere la loro funzione nelle condizioni demielinizzanti è essenziale per capire i meccanismi delle malattie.
- Sono necessarie tecniche di isolamento efficaci per studiare la microglia caratterizzata da specifici stati patologici.
- Il metodo presentato si concentra sul miglioramento dell'efficienza nell'isolare queste cellule.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per l'isolamento della microglia dalle aree bersaglio del cervello.
- Facilitare lo studio del comportamento microgliale e dei loro ruoli nel contesto delle malattie demielinizzanti.
- Ottimizzare l'uso delle risorse durante il processo di isolamento.
Metodi utilizzati
- Microdissezione del tessuto da lesioni di demielinizzazione sotto uno stereomicroscopio.
- Utilizzo della separazione cellulare attivata magneticamente su colonna per l'isolamento della microglia.
- Le fasi includono la digestione del tessuto, la centrifugazione e la resuspendione delicata per un'efficiente isolamento delle cellule.
- Le fasi chiave coinvolgono la preparazione degli enzimi, multiple sequenze di centrifugazione e una manipolazione attenta dei campioni microgliali.
Principali risultati
- Il protocollo migliora significativamente la proporzione di microglia isolata.
- L'analisi di citofluorimetria ha dimostrato l'ordinata selezione delle cellule mieloidi e l'identificazione specifica della microglia.
- È stata eseguita la colorazione live-dead delle cellule per valutare la vitalità cellulare e confermare la selezione di successo.
- Il metodo consente una comprensione più completa delle risposte microgliali in condizioni demielinizzanti.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo efficace per isolare la microglia, facilitando la futura ricerca sul loro ruolo nelle malattie neurologiche.
- La tecnica di isolamento contribuisce ad avanzare la conoscenza del comportamento microgliale in vivo, rendendola applicabile a vari modelli di malattia.
- Questo protocollo può migliorare gli studi mirati a interventi terapeutici che prendono di mira la funzione microgliale nelle malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
