Name: Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Scopri l'isolamento di microglia primarie da lesioni di demielinizzazione nel cervello di topo adulto mediante smistamento cellulare magnetico. Questo metodo ottimizza tempi e risorse per studiare le caratteristiche microgliali in vivo.

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Lo studio è stato sostenuto dalla Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina.
1. Materiali
<ol><li>Preparare le soluzioni seguenti prima di iniziare il protocollo.<ol>
<li>Preparare il tampone di carico aggiungendo siero bovino fetale (FBS, 2%) alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
		<li>Aggiungere colorante rosso neutro (NR) (finale 1%) al PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare le seguenti soluzioni utilizzando il kit di dissociazione del cervello adulto disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).<ol>
<li>Per preparare la miscela enzimatica 1, pipettare 1,9 mL di Tampone Z e 50 μL di Enzima P in un tubo centrifuga da 15 mL.</li>
		<li>Per preparare la miscela enzimatica 2, pipettare 20 μL di Tampone Y e 10 μL di Enzima A in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Preparare la soluzione di rimozione dei detriti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Perfusione e dissezione dei topi
<ol><li>Iniettare per via intraperitoneale (i.p.) nel topo 500 μL di colorante NR all'1% in PBS 2-3 ore prima dell'anestesia. NOTA: L'iniezione intraperitoneale di NR in modelli murini demielinizzanti aiuta a discernere le lesioni (Figura 1).</li>
	<li>Anestetizzare il topo con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) e assicurarsi che il topo sia anestetizzato con successo esaminando le risposte al dolore.</li>
	<li>Aprire la cavità toracica del topo ed esporre il cuore.</li>
	<li>Tagliare con cura un piccolo angolo dell'atrio destro e perfondere intracardialmente il mouse con 20-30 ml di PBS freddo dal ventricolo sinistro.</li>
	<li>Decapitare il topo in anestesia.</li>
	<li>Apri il cranio del topo e libera con cura il cervello dal cranio.</li>
	<li>Trasferire il cervello alla muffa della fetta di cervello del topo e tagliare il cervello in fette di 0,1 cm.</li>
	<li>Rimuovere le fette di cervello e metterle in PBS freddo in una capsula di Petri (60/15 mm). Microdissettare le lesioni marcate dal colorante NR intorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio usando una pinza microchirurgica. NOTA: Assicurarsi che il tessuto sezionato sia il più completo possibile per facilitare il successivo trasferimento; il progresso totale della dissezione dovrebbe essere completato in 2 ore.</li>
	<li>Trasferire il tessuto sezionato in tubi centrifughi da 15 ml contenenti la quantità appropriata di tampone di carico a freddo. NOTA: Raggruppare il tessuto del corpo calloso da 2-3 topi insieme in una provetta come un campione.</li>
</ol>3. Dissociazione dei tessuti
<ol><li>Centrifugare il tessuto sezionato a 300 ×g per 30 s (dopo aver raggiunto questa velocità) per raccogliere il campione sul fondo del tubo.</li>
	<li>Preriscaldare la miscela enzimatica 1 e la miscela enzimatica da 2 a 37 °C in un incubatore.</li>
	<li>Aggiungere 1.950 μL di miscela enzimatica preriscaldata da 1 a un campione e digerire in un incubatore a 37 °C per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 30 μL di miscela enzimatica preriscaldata 2 e mescolare delicatamente.</li>
	<li>Digerire in un incubatore a 37 °C per 15 minuti e mescolare delicatamente ogni 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 4 ml di PBS freddo al tubo dopo la digestione e agitare delicatamente.</li>
	<li>Posizionare filtri da 70 μm su tubi centrifuga da 50 mL e preincidere i filtri con 500 μL di PBS freddo. Filtrare il tessuto dissociato facendo passare i campioni di tessuto digerito attraverso i filtri e trasferire la sospensione filtrata nel tubo della centrifuga da 50 ml in un tubo della centrifuga da 15 ml. NOTA: saltare questo passaggio se la quantità di tessuto è troppo piccola.</li>
	<li>Centrifugare i campioni di tessuto filtrato a 300 ×g per 10 min a 4 °C e aspirare il surnatante lentamente e completamente. NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio ad eccezione della digestione enzimatica.</li>
</ol>4. Rimozione dei detriti
<ol><li>Risospendare delicatamente il pellet cellulare con 1.550 μL di PBS freddo.</li>
	<li>Aggiungere 450 μL di soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolare bene.</li>
	<li>Sovrapporre la miscela di cui sopra molto lentamente e delicatamente con 2 x 1 mL di PBS freddo usando una pipetta da 1.000 μL. NOTA: Inclinare il tubo della centrifuga di 45 ° e aggiungere lentamente PBS lungo la parete del tubo con la pipetta.</li>
	<li>Trasferire il tubo lentamente e delicatamente in una centrifuga e ruotare a 4 °C e 3.000 × g per 10 minuti.</li>
	<li>Cerca tre strati dopo la centrifugazione. Aspirare completamente i due strati superiori utilizzando una pipetta da 1.000 μL (Figura 2).</li>
	<li>Riempire il tubo fino a 5 ml con tampone di carico a freddo e capovolgere delicatamente il tubo tre volte.</li>
	<li>Centrifugare a 4 °C e 1.000 × g per 10 min. Aspirare completamente il surnatante ed evitare di interrompere il pellet cellulare.</li>
</ol>5. Separazione magnetica delle cellule microgliali
<ol><li>Risospesciare il pellet cellulare con 90 μL di tampone di carico e aggiungere 10 μL di perline CD11b (Microglia).</li>
	<li>Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di carico e pipettare delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1.000 μL per lavare le cellule dopo l'incubazione. Centrifugare le celle a 4 °C e 300 × g per 10 minuti e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate.</li>
	<li>Risospesciare le celle in 500 μL di buffer di carico.</li>
	<li>Posizionare la colonna MS con il relativo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico.</li>
	<li>Risciacquare la colonna con 500 μL di tampone di carico per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica basata sul protocollo del produttore.</li>
	<li>Applicare la sospensione di cella sulla colonna MS ed eliminare il flusso passante contenente celle senza etichetta.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di buffer di carico alla colonna tre volte per lavare via le celle che aderiscono alla parete della colonna ed eliminare il flowthrough. NOTA: aggiungere un nuovo buffer di carico per il lavaggio solo quando il serbatoio della colonna è completamente vuoto.</li>
	<li>Rimuovere la colonna dal separatore dopo aver lavato la colonna e posizionarla su un tubo centrifugo da 15 ml.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di buffer di carico nella colonna e spingere lo stantuffo sul fondo della colonna per scovare le celle etichettate magneticamente. Ripetere questo passaggio tre volte per raccogliere completamente le cellule etichettate magneticamente.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

Il protocollo propone un metodo per isolare la microglia attorno alle lesioni demielinizzanti, che può aiutare a studiare le caratteristiche funzionali della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti. Le microglia catturate utilizzando perline CD11b mostrano un'elevata purezza e vitalità. I passaggi critici del protocollo includono la localizzazione precisa dei fuochi e la purificazione microgliale ottimale. Nella fase di protocollo 2.1, è necessario iniettare la soluzione NR 2 ore prima di sacrificare il mo...

Le microglia provengono da progenitori del sacco vitellino, che raggiungono il cervello embrionale molto presto e partecipano allo sviluppo del SNC 1,2. Ad esempio, sono coinvolti nella potatura sinaptica3 e nella regolazione della crescita assonale4. Secernono fattori che promuovono la sopravvivenza neuronale e aiutano la localizzazione neuronale5. Allo stesso tempo, sono coinvolti nella rimozione di cellule anormali e cellule apoptotiche per garantire il normale sviluppo del cervello6. Inoltre, come cellule immuno-competenti del cervello, le microglia sorvegliano continuamente il parenchima cerebrale per eliminare le cellule morte, le sinapsi disfunzionali e i detriti cellulari7. È stato dimostrato che l'attivazione microgliale svolge un ruolo importante in una varietà di malattie, tra cui malattie infiammatorie demielinizzanti, malattie neurodegenerative e tumori cerebrali. Le microglia attivate nella sclerosi multipla (SM) contribuiscono alla differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) e alla rigenerazione della mielina inghiottendo i detritimielinici 8.
Nella malattia di Alzheimer (AD), l'accumulo di amiloide-beta (Aβ) attiva la microglia, che colpisce le funzioni fagocitiche e infiammatorie della microglia9. La microglia attivata nel tessuto del glioma, chiamata microglia associata al glioma (GAM), può regolare la progressione del glioma e, infine, influenzare la prognosi dei pazienti10. L'attivazione altera profondamente il trascrittoma microgliale, con conseguenti cambiamenti morfologici, espressione dei recettori immunitari, aumento dell'attività fagocitica e aumento della secrezione di citochine11. Esistono diversi sottoinsiemi di microglia attivate nelle malattie neurodegenerative come la microglia associata alla malattia (DAM), la microglia a risposta attivata (ARM) e il fenotipo neurodegenerativo microgliale (MGnD)8.
Allo stesso modo, più sottoinsiemi funzionali dinamici di microglia coesistono anche nel cervello nelle malattie infiammatorie demielinizzanti12. Comprendere l'eterogeneità tra diversi sottoinsiemi di microglia è essenziale per studiare la patogenesi delle malattie demielinizzanti infiammatorie e per trovare le loro potenziali strategie terapeutiche. L'eterogeneità della microglia dipende principalmente dalla specificità molecolare8. È essenziale descrivere accuratamente le alterazioni molecolari della microglia per lo studio dell'eterogeneità. I progressi nella tecnologia di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (RNA-seq) hanno permesso l'identificazione delle caratteristiche molecolari della microglia attivata in condizioni patologiche13. Pertanto, la capacità di isolare le popolazioni cellulari è fondamentale per ulteriori indagini su queste cellule bersaglio in condizioni specifiche.
Gli studi condotti per comprendere le caratteristiche e le funzioni della microglia sono di solito studi in vitro, poiché è stato riscontrato che un gran numero di microglia primarie possono essere preparate e coltivate dal cervello del cucciolo di topo (1-3 giorni), che si attaccano ai palloni di coltura e crescono sulla superficie plastica con altre cellule gliali miste. Successivamente, la microglia pura può essere isolata in base alla diversa adesività delle cellule gliali miste14,15. Tuttavia, questo metodo può solo isolare la microglia dal cervello perinatale e richiede diverse settimane. Le potenziali variabili in coltura cellulare possono influenzare le caratteristiche microgliali come l'espressione molecolare16. Inoltre, le microglia isolate con questi metodi possono partecipare solo a esperimenti in vitro simulando le condizioni delle malattie del SNC e non possono rappresentare le caratteristiche e le funzioni della microglia negli stati di malattia in vivo. Pertanto, è necessario sviluppare metodi per isolare la microglia dal cervello del topo adulto.
Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la separazione magnetica sono due metodi ampiamente utilizzati, sebbene abbiano i loro diversi limiti 16,17,18,19. I loro rispettivi vantaggi e svantaggi saranno contrastati nella sezione di discussione. La maturazione della tecnologia MACS offre la possibilità di purificare rapidamente le cellule. Huang et al. hanno sviluppato un metodo conveniente per etichettare le lesioni demielinizzanti nel cervello20. Combinando questi due approcci tecnici, proponiamo un protocollo di separazione magnetica CD11b colonnare rapido ed efficiente, fornendo una descrizione passo-passo per isolare la microglia attorno a lesioni demielinizzanti nel cervello di topo adulto e preservare le caratteristiche molecolari della microglia. Le lesioni demielinizzanti focali sono state causate dall'iniezione stereotassica di 2 μL di soluzione di lisolecitina (1% LPC in 0,9% NaCl) nel corpo calloso 3 giorni prima di iniziare il protocollo21. Questo protocollo pone le basi per eseguire il passo successivo in esperimenti in vitro. Inoltre, questo protocollo consente di risparmiare tempo e rimane fattibile per un uso diffuso in vari esperimenti.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT001015</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga da 15 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga da 50 mL</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 &; m Filter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione cerebrale adulta, topo e ratto</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Topi</td><td>SJA Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) Perline, umano e topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>BOSTER</td><td>PYG0001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a</td> flusso <td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte</td> rosso neutro <td>Agilent</td><td></td><td>Un sistema composto da NovoExpress</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Le microglia, le cellule immunitarie innate residenti nel cervello, sono i principali rispondenti all'infiammazione o alle lesioni nel sistema nervoso centrale (SNC). La microglia può essere suddivisa in stato di riposo e stato attivato e può cambiare rapidamente stato in risposta al microambiente del cervello. Le microglia saranno attivate in diverse condizioni patologiche e presenteranno fenotipi diversi. Inoltre, ci sono molti sottogruppi diversi di microglia attivate e una grande eterogeneità tra diversi sottogruppi. L'eterogeneità dipende principalmente dalla specificità molecolare della microglia. Gli studi hanno rivelato che la microglia sarà attivata e svolgerà un ruolo importante nel processo patologico di demielinizzazione infiammatoria. Per comprendere meglio le caratteristiche della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti come la sclerosi multipla e il disturbo dello spettro della neuromielite ottica, proponiamo un protocollo di smistamento microgliale primario perilesionale. Questo protocollo utilizza il cartomanziamento cellulare attivato magneticamente colonnare (MACS) per ottenere microglia primarie altamente purificate e preservare le caratteristiche molecolari della microglia per studiare i potenziali effetti della microglia nelle malattie demielinizzanti infiammatorie.

Le microglia isolate con perline CD11b hanno un'elevata purezza Le cellule microgliali intorno alle lesioni nei modelli murini di demielinizzazione sono state isolate utilizzando il protocollo sopra menzionato e testate mediante citometria a flusso. Le cellule sono etichettate fluorescentemente con ISOTIOCIANATO CD11b-Fluoresceina (FITC) e CD45-alloficocianina (APC) per determinare la microglia nella citometria a flusso secondo le istruzioni del produttore. Esistono diverse letterature che dimostrano ...

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Questo protocollo aiuta a isolare la microglia dalle lesioni demielinizzanti microdissecate del cervello del topo adulto per studiare le caratteristiche microgliali in vivo. Questa tecnica consente di risparmiare tempo e ha requisiti inferiori sia per gli sperimentatori che per le attrezzature. Questo metodo aiuta a isolare le microglia dal cervello dell'animale, in particolare quei tessuti microdissezionati in vari stati patologici.Inizia microdissezionando le lesioni etichettate con colorante neutro attorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio. Centrifugare il tessuto sezionato a 300 volte g per 30 secondi per raccogliere il campione sul fondo del tubo. Preriscaldare la miscela enzimatica uno e la miscela enzimatica da due a 37 gradi Celsius in un'incubatrice.Quindi, aggiungere 1.950 microlitri di miscela enzimatica preriscaldata uno a un campione e digerire in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere 30 microlitri di enzima preriscaldamento mescolare due e mescolare delicatamente. Dopo la digestione, aggiungere quattro millilitri di PBS freddo al tubo e agitare delicatamente.Centrifugare i campioni di tessuto a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante lentamente e completamente. Risospesciare delicatamente il pellet cellulare con 1.550 microlitri di PBS freddo. Aggiungere 450 microlitri della soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolarli bene.Utilizzare una pipetta da 1.000 microliti per sovrapporre la miscela molto lentamente e delicatamente con due millilitri di PBS freddo. Centrifugare la miscela e quindi cercare i tre strati. Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aspirare completamente i due strati superiori e riempire il tubo fino a cinque millilitri con tampone di carico a freddo.Capovolgere delicatamente il tubo tre volte. Successivamente, dopo la centrifugazione e l'aspirazione del surnatante, risospesere il pellet di cella con 90 microlitri di buffer di carico e aggiungere 10 microlitri di perline CD11b. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro del tampone di carico e lavare le cellule convogliando delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1.000 microliti. Centrifugare le cellule a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate. Risospesciare le celle in 500 microlitri del buffer di carico e posizionare la colonna MS con il suo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico.Risciacquare la colonna con 500 microlitri del buffer di carico per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica basata sul protocollo del produttore. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna MS ed eliminare il flusso passante contenente le celle senza etichetta. Aggiungere 500 microlitri del buffer di carico per lavare la colonna e rimuoverla dal separatore.Posizionare la colonna su un tubo di centrifuga da 15 millilitri e aggiungere un millilitro del buffer di carico nella colonna. Infine, spingere lo stantuffo sul fondo della colonna per scovare le celle etichettate magneticamente. Una rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso di microglia isolate da lesioni demielinizzanti di topi adulti prima e dopo lo smistamento cellulare attivato magneticamente è mostrata qui.Le immagini grafiche rappresentano l'altezza di dispersione in avanti e l'altezza di dispersione laterale per la selezione delle celle, l'area di dispersione in avanti e l'altezza di dispersione in avanti per la selezione di celle singole e CD11b-FITC e CD45-APC per la selezione delle cellule mieloidi e delle microglia. La proporzione di microglia è aumentata significativamente dopo la selezione cellulare attivata magneticamente. L'immagine grafica rappresenta la strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso per singole cellule vive e morte dopo lo smistamento cellulare attivato magneticamente.Qui, la 7-aminoactinomicina D e l'altezza di dispersione laterale sono state utilizzate per selezionare le cellule viventi. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di microdissettare con precisione le lesioni demielinizzanti sotto uno stereomicroscopio basato sui segni rossi neutri.

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In questo video, descriviamo un protocollo per isolare le cellule CD11b, inclusa la microglia, da cervelli di cuccioli di topo utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente. I tessuti cerebrali vengono omogeneizzati per ottenere sospensioni a singola cellula, che vengono incubate con microsfere rivestite di anticorpi anti-CD11b, seguite da una separazione basata su colonna magnetica per purificare la popolazione cellulare CD11b+.

Isolamento magnetico della microglia dal cervello di un cucciolo di topo

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule primarie degli oligodendrociti da una sospensione di cellule neurali ottenuta da un cucciolo di topo utilizzando la separazione magnetica. La tecnica impiega biglie magnetiche rivestite con anticorpi specifici per gli antigeni degli oligodendrociti, consentendo l'isolamento selettivo di queste cellule.

Isolamento di oligodendrociti primari murini mediante microsfere immunomagnetiche

Questo video mostra un protocollo per estrarre cellule microgliali da lesioni demielinizzanti nel cervello di topo utilizzando la selezione magnetica delle cellule. Il protocollo prevede la sezionazione del tessuto cerebrale lesionato contenente cellule microgliali, il trattamento del tessuto con enzimi specifici per ottenere una sospensione di una singola cellula e l'utilizzo di microsfere magnetiche specifiche del recettore microgliale per isolare le cellule microgliali.

Isolamento della microglia da lesioni demielinizzanti del cervello di topo mediante smistamento cellulare attivato magneticamente

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente  

Abbiamo stabilito modelli murini di leucomalacia periventricolare (PVL), il danno cerebrale predominante in neonati prematuri caratterizzata da lesioni della sostanza bianca periventricolare. Ipossia / ischemia con / senza infezione sistemica sono le cause primarie del PVL. Unilaterale legatura carotidea e l'esposizione ipossia con / senza iniezione lipopolisaccaride crea PVL-come le lesioni nei topi P6.

I modelli del mouse di leucomalacia periventricolare

Scopri l'isolamento di microglia primarie da lesioni di demielinizzazione nel cervello di topo adulto mediante smistamento cellulare magnetico. Questo metodo ottimizza tempi e risorse per studiare le caratteristiche microgliali in vivo.

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione (Video) | JoVE Journal

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