Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture

Questa tecnica consente l'identificazione delle cellule con diverse capacità invasive sotto l'influenza di fattori secreti da cellule stromali co-coltivate. La tecnica valuta l'impatto dei fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate sull'invasione cellulare. Permette inoltre il recupero e l'analisi di sottopopolazioni cellulari invasive presenti in miscele cellulari eterogenee.

La tecnica può determinare quali tumori ospitano sottopopolazioni cellulari invasive che portano a metastasi. La cattura e l'analisi delle cellule tumorali invasive possono informare le decisioni terapeutiche. Per iniziare la coltura cellulare, lavare le colture cellulari aderenza con una confluenza di circa il 70% con soluzione salina tamponata con fosfato 1X.

Quindi aggiungere 0,05% di tripsina e soluzione di EDTA per sollevare le cellule. Neutralizzare la soluzione di tripsina con terreni di coltura cellulare contenenti siero e contare le cellule usando un'aliquota della sospensione cellulare. Posizionare tutte e tre le camere sterili nella cappa di coltura del tessuto.

Posizionare la manopola sul lato corto della camera inferiore e orientare la camera inferiore in modo che la manopola sia rivolta verso lo sperimentatore. Aggiungere da 30.000 a 50.000 celle in 90 microlitri di media a ciascun pozzetto dalla camera inferiore senza formare bolle. Utilizzare il 5% dei media integrati con siero bovino fetale in due camere inferiori come controllo positivo per la motilità cellulare e utilizzare i mezzi integrati con siero allo 0% come controllo negativo.

Ruotare la camera inferiore a 90 gradi dopo averla lasciata riposare per 10-15 minuti nel cofano. Quindi posizionare la camera centrale in alto in modo che la manopola sulla camera inferiore scivoli nella tacca sulla camera centrale. Spingete la camera verticalmente verso il basso fino a quando non si sente un clic da ciascuno dei lati lunghi dell'assieme.

Aggiungere 160 microlitri di supporti privi di siero a tutti i pozzetti della camera centrale. Assicurarsi che un menisco a forma di cupola sia visibile dopo che i pozzetti sono stati riempiti e posizionare la camera superiore con elettrodi rivolti verso il basso sulla camera centrale per allineare i punti blu sulle camere centrale e superiore. Spingere la camera verticalmente verso il basso fino a quando non si sente un suono di clic da ciascuno dei lati lunghi dell'assieme.

Aggiungere da 20 a 50 microlitri di supporti privi di siero alla camera superiore. Montare il gruppo sull'analizzatore cellulare a doppio scopo nell'incubatore di colture tissutali e attendere 30 minuti prima di misurare lo sfondo. Aprire il software dell'analizzatore di celle, quindi selezionare la base da utilizzare, seguita da un clic sulla scheda del messaggio, e assicurarsi che sia indicato Connessioni ok "per assicurarsi che l'array sia ben posizionato nella culla e che gli elettrodi siano ben allineati con i sensori.

Fai clic sulla scheda note dell'esperimento e inserisci tutte le possibili informazioni sull'esperimento. Quindi fare clic sulla scheda layout e compilare la descrizione del layout dell'array. Quindi fare clic sulla scheda Pianificazione e aggiungere due passaggi dal menu dei passaggi, un passaggio di sfondo con una sweep e un passaggio di test con 100 sweep.

Una volta che l'array è rimasto nell'incubatore di analizzatori di celle a doppio scopo per 30 minuti, fare clic sul pulsante di riproduzione per avviare la misurazione in background. Al termine della misurazione in background, rimuovere l'array dalla culla e riposizionarlo nella cappa di coltura cellulare. Quindi aggiungere da 30.000 a 50.000 cellule in 100 microlitri di mezzi privi di siero a ciascun pozzetto della camera superiore.

Queste sono le cellule che l'elettrodo rileverà una volta che migrano con successo attraverso la membrana. Lasciare riposare il gruppo nella cappa per 30 minuti prima di montarlo sull'analizzatore di celle a doppio scopo per la misurazione dell'impedenza. Riposizionare l'array nell'analizzatore di celle a doppio scopo e controllare la scheda del messaggio per il messaggio Connessioni ok.

Fare clic sul pulsante di riproduzione per avviare la misurazione dell'impedenza e quindi fare clic sulla scheda della trama per monitorare l'avanzamento del segnale. Se l'endpoint viene raggiunto prima di 25 ore, fare clic sul passaggio di interruzione dal menu a discesa Esegui. Per esportare i dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico, scegliere Copia nel formato elenco, quindi incollare i dati in un foglio di calcolo.

Monitora il tasso di migrazione in tempo reale sull'analizzatore di celle a doppio scopo per determinare il punto di interesse di arresto. Una volta raggiunto, smontare l'assemblaggio dall'analizzatore cellulare a doppio scopo e posizionarlo nella cappa di coltura del tessuto. Preparare un numero appropriato di 1,5 millilitri di tubi di microcentrifuga per raccogliere le cellule dai pozzetti di interesse.

Posizionare l'assemblaggio in un piatto di 10 centimetri per contenere liquidi quando le camere si staccano. Spingere le estremità di scatto flessibili sul lato lungo della camera centrale verso l'interno fino a quando non si sente un suono di clic, seguito dallo smantellamento della camera superiore e invertendolo in un nuovo piatto di 10 centimetri. Utilizzare un sollevatore di celle con una lama da 13 millimetri per raccogliere le cellule da tutti i pozzi che ospitano la stessa condizione sperimentale.

Risciacquare o immergere la lama in 1X soluzione salina tamponata con fosfato per raccogliere le cellule in tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi ruotare le cellule a 500 volte G per cinque minuti e propagare queste cellule raccolte o eseguire analisi degli endpoint come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. La valutazione dell'invasione delle cellule in presenza o assenza di cellule stromali ha mostrato che l'invasione cellulare MDA-MB-231 è stata migliorata quando i fibroblasti J2 di Swiss-3T3 irradiati sono stati collocati nella camera inferiore per lo scambio di fattori tra le due linee cellulari.

È interessante notare che l'invasione MDA-MB-231 è aumentata quando le celle 3T3 J2 sono state raddoppiate in numero. D'altra parte, il tasso di invasione di un clone invasivo di cellule MCFDCIS, DCIS-Delta Four, sembra essere inibito dalla diafonia con cellule 3T3 J2, suggerendo la preziosa applicazione dell'array a tre camere per misurare i vari effetti dello stroma. In questo caso, fibroblasti sull'invasione cellulare.

Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana erano più invasive in risposta ai fattori secreti dalle cellule MDA-MB-231, a differenza di quelle secrete dalle cellule DCIS, che è coerente con la capacità dei tumori invasivi di reclutare cellule endoteliali per la formazione dei vasi sanguigni e la successiva diffusione nella circolazione. L'invasione delle cellule di xenotrapianto derivate dal paziente dalla camera superiore è aumentata in risposta alle cellule immunitarie del midollo osseo umano co-coltivate. È interessante notare che la presenza del 2% di siero nella camera inferiore con le cellule immunitarie del midollo osseo umano era essenziale per l'invasione di xenotrapianti derivati dal paziente.

I pozzetti possono essere rivestiti con una matrice extracellulare per imitare la barriera della membrana basale. Gli agenti terapeutici possono essere aggiunti ai media nei pozzi per monitorare il loro effetto sull'invasione.