Il manoscritto presenta protocolli di spettrometria di massa versatili, robusti e sensibili per identificare e quantificare diverse classi di lipidi dai fotorecettori di Drosophila .
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Articolo metodologico
Il manoscritto presenta protocolli di spettrometria di massa versatili, robusti e sensibili per identificare e quantificare diverse classi di lipidi dai fotorecettori di Drosophila .
L'attivazione della fosfolipasi Cβ (PLCβ) è un passaggio essenziale durante la trasduzione sensoriale nei fotorecettori della Drosophila . L'attività della PLCβ provoca l'idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato del lipide di membrana [PI(4,5)P2] che porta infine all'attivazione dei canali del potenziale recettoriale transitorio (TRP) e TRP like (TRPL). L'attività di PLCβ porta anche successivamente alla generazione di molte specie lipidiche, molte delle quali sono state proposte per svolgere un ruolo nell'attivazione di TRP e TRPL. Inoltre, è stato proposto che diverse classi di lipidi svolgano un ruolo chiave nell'organizzazione della biologia cellulare dei fotorecettori per ottimizzare le reazioni di segnalazione per una trasduzione sensoriale ottimale. Storicamente, queste scoperte sono state guidate dalla capacità di isolare i mutanti di Drosophila per gli enzimi che controllano i livelli di lipidi specifici ed eseguire analisi della fisiologia dei fotorecettori in questi mutanti. Più recentemente, sono stati sviluppati potenti metodi di spettrometria di massa per l'isolamento e l'analisi quantitativa di lipidi con elevata sensibilità e specificità. Questi sono particolarmente adatti per l'uso in Drosophila , dove l'analisi dei lipidi è ora possibile dai fotorecettori senza la necessità di marcatura con radionuclidi. In questo articolo, vengono trattate le considerazioni concettuali e pratiche nell'uso della spettrometria di massa lipidica per la valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata di vari lipidi di segnalazione nei fotorecettori di Drosophila . Insieme ai metodi esistenti nella genetica molecolare e nell'analisi fisiologica, è probabile che tali lipidi aumentino la potenza dei fotorecettori come sistema modello per le scoperte in biologia.
La fototrasduzione in Drosophila è mediata da una cascata di PLCβ accoppiata a proteine G che porta all'attivazione dei canali attivati dalla luce TRP e TRPL1. PLCβ idrolizza il fosfolipide legato alla membrana, il fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato [PI(4,5)P2] e genera diacilglicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5 trisfosfato (IP3). Il DAG viene quindi fosforilato dalla DAG-chinasi per generare acido fosfatidico (PA). Successivamente, attraverso una serie di reazioni che coinvolgono la generazione di intermedi lipidici, PI(4,5)P2 viene rigenerato2. Di....
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato sostenuto dal Dipartimento dell'Energia Atomica, Governo dell'India (Progetto di identificazione n. RTI 4006), il Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India (BT/PR4833/MED/30/744/2012) e una borsa di studio senior dell'India Alliance (IA/S/14/2/501540) a PR. Ringraziamo la NCBS Mass Spectrometry Facility, in particolare il Dr. Dhananjay Shinde e i membri del laboratorio di pubbliche relazioni per il loro contributo allo sviluppo di questi metodi.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 N metanolico HCL | Per l'isolamento totale dei lipidi | ||
| 0,88% KCl | Sigma Aldrich | P9541 | Per l'isolamento totale dei lipidi |
| 1,5 ml / 2 ml di provette LoBind Eppendorf | Eppendorf, Eppendorf,022431081 | /022431102 | Per l'isolamento totale dei lipidi |
| 2,3.18 16:0/18:1 Diether PE | Avanti lipidi polari | 999974 | Lipid Internal Standard |
| 37% HCl puro | Sigma Aldrich | 320331 Per l'isolamento | totale dei lipidi Piastra |
| a 96 pozzetti | Saggio del fosfato organico totale | ||
| Acetone | Fisher Scientific | 32005 | Per le dissezioni |
| Molibdato | Saggio del fosfato organico totale | ||
| Acido | Saggio del fosfato organico totale | ||
| Sonicatore | a bagno | ||
| Colonna BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm] | Waters India Pvt. Ltd. | 186002352 | LC |
| Portalama | Fine Scientific Tools | 10052-11 | Per dissezioni |
| Incubatore | Saggio del fosfato organico totale | ||
| Lame frangibili | Fine Scientific tools | 10050-00 | Per dissezioni |
| Carta burrosa | GE | healthcare 10347671 | Per dissezioni |
| C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] colonna | Waters India Pvt. Ltd. | Cromatografia LC 186004623 | |
| flaconi in vetro color ambra con inserti | Merck | 27083-U | |
| d18:1/17:0) | Avanti lipidi polari | 860517 | Lipid Internal Standard |
| d5-Fosfatidilinositolo 3,5-bisfosfato [PI(3,5)P2]-16:0/16:0 | Lipidi polari Avanti | 850172 | Microscopi |
| da dissezione standard interni ai lipidiOlympus | SZ51 | Per dissezioni | |
| Bagno di calore secco. | |||
| Eluente A | Esano:Alcool isopropilico:100 mM Acetato acquoso di ammonio (68:30:2) , per LC | ||
| Eluente B | Esano:Alcool isopropilico:100 mM Acetato acquoso di ammonio (70:20:10), per LC | ||
| Carta da filtro | Indica-HM2 | 74039 | Per dissezioni |
| Palloni | Borosil | Per dissezioni | |
| Mosche | NA | NA | Raghu Padinjat lab |
| Cibo per mosche | NA | NA | NCBS lab kitchen, composizione: farina di mais 80 g/L, D-glucosio 20 g/L, saccarosio 40 g/L, agar 8 g/L, estratto di lievito 15 g/L, acido propionico 4 mL, TEGO (metil para idrossibenzoato) 0,7 g/L, acido ortofosforico 0,6 mL) |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11254-20 | Per dissezioni |
| Cappa | |||
| aspirante | Borosil | Per le dissezioni | |
| Acido acetico glaciale | Fisher Scientific | A35-500 | Per la derivatizzazione |
| Flaconi di vetro: colore trasparente e ambrato | Per l'isolamento totale dei lipidi Provette | ||
| di vetro prive di fosfati resistenti alle alte temperature. | Saggio del fosfato organico totale | ||
| Provette per omogeneizzazione con perle di ossido di | Per l'isolamento totale dei lipidi | ||
| Strumento omogeneizzatore | Precellys | ||
| CO2sub umidificato collegato a fly pad | Per spingere le mosche | ||
| Incubatrici a illuminazione controllata | Panasonic Sanyo | MIR-553 | Per le mosche Miscela |
| organica iniziale | metanolo: cloroformio (2:1), Per l'isolamento lipidico totale | ||
| Cloroformio di grado LC-MS | Sigma Aldrich | 650498 | Per l'isolamento lipidico totale |
| Grado LC-MS Metanolo | Sigma Aldrich | 34860 | Per l'isolamento lipidico totale |
| Acqua di grado LC-MS | Sigma Aldrich | 34877 | Per l'isolamento lipidico totale |
| Light misuratore | HTC instruments | LX-103 | |
| Punte a bassa ritenzione | Eppendorf | 0030072006/72014/72022/72030 | Per l'isolamento totale dei lipidi |
| Strumento LTQ Orbitrap XL | Thermo Fisher Scientific, Brema, Germania | ||
| Acido lisofosfatidico (LPA) - 13:0 | Avanti lipidi polari | LM-1700 | Lipidi standard interni |
| Acido lisofosfatidico (LPA) - 17:1 | Lipidi polari Avanti | LM 1701 | Standard |
| Lisofosfatidilcolina (LPC) -13:0 | Lipidi polari Avanti | LM-1600 | Standard interno lipidico |
| Lisofosfatidilcolina (LPC) -17:1 | Lipidi polari Avanti | 855677 | Standard |
| Lisofosfatidilcolina (LPC)- 19:0 | Lipidi polari Avanti | 855776 | Standard |
| Acido perclorico. | Saggio del fosfato organico totale | ||
| Fosfato standard di potassio diidrogeno fosfato | Saggio del fosfato organico totale | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | NA | NA | Composizione: 137mMNaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 |
| Acido fosfatidico (PA)- 12:0/13:0 | Lipidi polari avanti | , LM-1400 | Lipidi interni standard |
| Acido fosfatidico (PA) - 17:0/14:1 | Avanti lipidi polari | LM-1404 | Lipidi interni standard Acido |
| fosfatidico (PA)-(17:0/17:0) | Avanti lipidi polari | 830856 | Lipidi interni standard |
| Acido fosfatidico (PA)-16:0-D31/18:1 | Avanti lipidi polari | 860453 | Lipidi interni standard |
| Fosfatidilcolina (PC) -12:0/13:0 | Lipidi polari Avanti | LM-1000 | Lipidi standard interni |
| Fosfatidilcolina (PC) - 17:0/14:1 | Lipidi polari Avanti | LM-1004 | Lipidi interni standard |
| Fosfatidiletanolammina (PE) - 17:0/14:1 | Lipidi polari Avanti | LM-110 | Lipidi standard interni |
| Fosfatidilinositolo (PI) - 17:0/14:1 | Lipidi polari Avanti | LM-1504 | Standard interno lipidico |
| Fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4 | Lipidi polari | Avanti LM-1904 | Lipid Internal |
| Standard Fosfatidilinositolo 4-fosfato (PI4P) - 17:0/20:4 | Lipidi polari | Avanti ML-1901 | Lipid Internal Standard |
| Sorgente ionica robotica a nanoflusso | TriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA) | ||
| Rotospin strumento | Tarsons | 3090X | |
| Cuscinetti | Per dissezioni | ||
| solvente A | 0,1% acido formico in acqua, per solvente LC | ||
| B | 0,1% acido formico in acetonitrile, per LC | ||
| Centrifuga | |||
| Termomiscelatore | |||
| TMS-diazometano | Acros | AC385330050 | Per la derivatizzazione |
| Spettrometro di massa a triplo quadrupolo | AB Sciex | QTRAP 6500 | |
| Sistema UPLC | Waters Acquity | ||
| Concentratore centrifugo sottovuoto | Scanvac , Labogene | ||
| Vortex machine |
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