Name: Ablazione laser mirata nellembrione di Saccharina latissima (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Scopri l'ablazione laser mirata negli embrioni di Saccharina latissima per studiare il destino cellulare e le interazioni durante l'embriogenesi nelle alghe brune. Questo metodo offre precisione elevata per ricerche sullo sviluppo.

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La borsa di dottorato di S.B. è finanziata dalla Regione Bretagne (numero di sovvenzione ARED COH20020) e dall'Università della Sorbona. I.T.is borsa di dottorato è finanziata dalla Regione Bretagna (numero di sovvenzione ARED COH18020) e dall'Università norvegese NMBU. Questo progetto ha ricevuto un sostegno finanziario dal CNRS attraverso i programmi interdisciplinari miti. MRic è membro dell'infrastruttura nazionale France-BioImaging sostenuta dall'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR-10-INBS-04).

1. Produzione di Saccharina latissima gametophytes
<ol><li>Raccogliere sporofite mature di S. latissima dallo stato selvatico come precedentemente descritto20,21. Assicurarsi che gli sporofiti selezionati siano privi di epifite (piccoli organismi visibili sulla superficie della lama) o parassiti interni (che si trovano nelle aree sbiancate o macchie sulla lama) . 
</li>
	<li>Utilizzando un bisturi, tagliare la parte più scura al centro della lama (tessuto fertile che produce spore22) in 1-5 pezzi quadrati (1 cm²), evitando eventuali macchie sbiancate, se presenti.</li>
	<li>Rimuovere eventuali epifite rimanenti pulendo delicatamente i pezzi tagliati con il retro di un bisturi e un po 'di carta assorbente.</li>
	<li>Mettere i pezzi puliti in un piatto di vetro pieno di acqua di mare naturale sterile (vedi Tabella dei materiali) per 45 minuti per rilasciare spore dopo il rapporto22 precedentemente pubblicato.</li>
	<li>Rimuovere i pezzi della lama e filtrare l'acqua di mare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere detriti o organismi indesiderati.</li>
	<li>Diluire le spore nel filtrato ad una concentrazione di 20-40 spore/mL in piastre di Petri di plastica22.</li>
	<li>Posizionare la soluzione di spore in un armadio di coltura (vedere Tabella dei materiali) configurato con le condizioni di coltura ottimali (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiodo 16:8 L:D).</li>
	<li>Lascia che le spore germoglino e si sviluppino in gametofiti. NOTA: La germinazione delle spore è visibile dopo 2 giorni nell'armadio e la prima divisione cellulare delle cellule gametofite di solito avviene entro le seguenti 48 ore.</li>
	<li>Sostituire il terreno di coltura dopo 5 giorni con acqua di mare naturale microfiltrata arricchita con una soluzione provasoli 0,5x (NSW1/2) (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Per evitare di ripetere questi passaggi, è possibile selezionare specifici gametofiti maschili e femminili e propagarli vegetativamente per diversi mesi. I gametofiti rimangono vegetativi se coltivati sotto luce rossa (4 μE.m-2.s-1 con una lunghezza d'onda di almeno 580 nm)23 nelle stesse condizioni di coltura sopra descritte (fase 1.7).</li>
</ol>2. Frammentazione e induzione dell'oogenesi
<ol><li>Raccogli gametofiti con un raschietto cellulare.</li>
	<li>Usando un piccolo pestello di plastica, schiacciare i gametofiti raccolti in un tubo da 1,5 ml in pezzi a 4-5 celle.</li>
	<li>Riempire il tubo con 1 mL NSW1/2 (passo 1.9).</li>
	<li>Aggiungere 2,5 μL della soluzione di gametofita frantumata in 3 mL di acqua di mare naturale arricchita con 1x soluzione di Provasoli (NSW) e metterli in una capsula di Petri. NOTA: una capsula di Petri con fondo di vetro da 25 mm è consigliata per una più facile manipolazione.</li>
	<li>Mettere i piatti preparati in un armadietto di coltura e indurre la gametogenesi a 13 °C sotto luce bianca con un'intensità di 24 μE.m-2.s-1 (luce fioca, fotoperiodo 16:8 L:D). NOTA: La prima gametangia (oogonia femminile e archegonia maschile) può essere osservata dopo 5 giorni. Il maschio è iper-ramificato con piccole cellule, e la femmina è composta da cellule più grandi che formano lunghi filamenti15,22. Le prime uova vengono osservate ~ 10 giorni dopo e la prima divisione degli zigoti di solito avviene entro i successivi 2 giorni.</li>
	<li>Sei giorni dopo aver osservato le prime uova, trasferire i piatti in condizioni di luce bianca più brillante: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiodo 16:8 L:D, ancora a 13 °C.</li>
</ol>3. Acquisizione di immagini per la selezione degli embrioni per l'ablazione e il monitoraggio della crescita successiva
<ol><li>Immagine dell'intera capsula di Petri per (ri)localizzare gli embrioni selezionati durante la fase di ablazione (non è necessario restituire il piatto al microscopio oculare) e monitorare il successivo sviluppo degli embrioni selezionati. NOTA: utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertita (vedere Tabella dei materiali) per l'imaging (Figura 1) e l'ablazione laser è descritta nel passaggio 5.</li>
	<li>Posiziona la capsula di Petri sul palco e orientala con un segno visivo (ad esempio, disegna una linea con un pennarello permanente).</li>
	<li>Usa l'obiettivo 10x/0.45 per concentrarti su un embrione. Registrare la posizione dei quattro punti cardinali della capsula di Petri.</li>
	<li>Avviare la scansione dei riquadri. Acquisisci immagini trasmesse/fluorescenti dell'intera capsula di Petri a bassa risoluzione: 256 x 256 pixel, un tempo di permanenza in pixel di 1,54 μs con scansione bidirezionale e uno zoom digitale di 0,6x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione dell'1,2%. NOTA: il tempo di scansione per un'intera capsula di Petri da 2,5 cm è di ~ 6 minuti per 225 tessere (Figura 2). Qui, il laser a 561 nm è stato utilizzato per la trasmissione e l'imaging a fluorescenza. Il segnale di fluorescenza è stato raccolto tra 580-720 nm sui fotomoltiplicatori confocali (PMT) e la luce trasmessa è stata raccolta sul PMT trasmesso. Il laser a 561 nm può anche monitorare la clorofilla in questa fase, ma non è necessario perché aiuta solo a distinguere correttamente il rumore del segnale e gli organismi.</li>
	<li>Salvare l'immagine di scansione dei riquadri e tenerla aperta nella finestra del software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Cambia l'obiettivo, non rimuovere la capsula di Petri. NOTA: l'obiettivo acqua 40x/1.2 è stato spostato sul lato dello stadio in modo che il mezzo di immersione (acqua) potesse essere aggiunto all'obiettivo senza spostare la capsula di Petri dalla sua posizione iniziale.</li>
	<li>Naviga attraverso l'immagine di scansione delle tessere acquisita in precedenza per selezionare l'embrione appropriato. Una volta che un embrione è stato identificato su questa immagine, spostare lo stadio nella posizione esatta dell'embrione e acquisire immagini trasmesse / fluorescenti di quell'embrione ad alta risoluzione. NOTA: impostazioni ad alta risoluzione: 512 x 512 pixel, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel di tempo di permanenza con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione dello 0,9%.</li>
	<li>Annotare l'immagine di scansione delle tessere per ogni embrione candidato all'ablazione laser (Figura 2B) e procedere alla fase di ablazione laser.</li>
</ol>4. Calibrazione laser
<ol><li>Calibrare il laser e sincronizzare il software di acquisizione delle immagini con il software del driver laser nella modalità "Click & Fire" e un laser pulsato a 355 nm. NOTA: questo passaggio è fondamentale per garantire una perfetta sincronizzazione tra la posizione del cursore del mouse nel software del driver laser (vedere Tabella dei materiali) con la posizione nell'immagine live del software di acquisizione.</li>
	<li>Aprire il pacchetto software laser-driver e fare clic su Live nel pacchetto software di acquisizione immagini.</li>
	<li>Sincronizzare entrambi i pacchetti software facendo clic su Avvia acquisizione nel pacchetto software laser-driver. L'immagine dal vivo viene ora registrata anche nel software del driver laser UV.</li>
	<li>Definisci un'area di interesse (AOI) facendo clic sul pulsante Scegli AOI e facendo clic sui bordi dell'immagine (destra, sinistra, in alto e in basso) nel pacchetto software del driver laser UV. NOTA: dopo questa fase di calibrazione, le impostazioni per la dimensione dei pixel, il formato dell'immagine e lo zoom nel pacchetto software di acquisizione devono rimanere costanti.</li>
	<li>Selezionare un'area vuota sul piatto e abbassare il livello dello stadio a 20 μm sotto il piano focale del campione per mettere a fuoco il fondo di vetro.</li>
	<li>Impostare il laser di ablazione e le traiettorie laser di imaging facendo clic su Avvia calibrazione e scegliere Calibrazione manuale.</li>
	<li>Selezionare una potenza laser sufficientemente alta da vedere un punto nero al centro dell'immagine dal vivo corrispondente al foro nel coperchio di vetro (tutte le persiane devono essere aperte).</li>
	<li>Clicca su questo punto nero centrale con il cursore del mouse e clicca su 18 punti aggiuntivi proposti dal software per completare la procedura di allineamento.</li>
	<li>Controllare la calibrazione nella "modalità Click & Fire" sullo stesso coverslip. NOTA: la calibrazione laser dipende dai parametri di imaging. Una volta calibrato il laser, assicurarsi che i parametri di imaging (ad esempio, 512 x 512 pixel, 0,130 μm / pixel, 0,208 μs pixel tempo di permanenza con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x) non siano cambiati.</li>
</ol>5. Ablazione laser
<ol><li>Seleziona un embrione di interesse. Avviare una registrazione time-lapse nel software di acquisizione delle immagini.</li>
	<li>Acquisire immagini trasmesse/fluorescenza con un obiettivo 40x/1,2 W ad alta risoluzione (cioè 512 x 512 pixel, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel dwell time con scansione monodirezionale e zoom digitale 2x utilizzando un laser a 561 nm con trasmissione allo 0,9%). Acquisisci la registrazione time-lapse alla massima velocità.</li>
	<li>Eseguire lo zoom indietro dell'area all'inizio della registrazione time-lapse. Ingrandire l'AOI.</li>
	<li>Utilizzare la funzione "Click & Fire" del software laser-driver per applicare l'irradiazione dannosa sulla cellula di interesse nell'embrione. Utilizzare i seguenti parametri: trasmissione laser al 45% (corrispondente a un massimo di 40 μW) e durata dell'impulso di 1 ms (fase 4). NOTA: si consiglia la registrazione video durante la ripresa laser.</li>
	<li>Sotto 688 nm, monitorare l'espulsione di cloroplasti autofluorescenti dal citoplasma.</li>
	<li>Se il contenuto della cella rimane nella cella, utilizzare nuovamente la funzione "Click & Fire" per aumentare le dimensioni della violazione nella cella. Ripetere, mantenendo il numero di scatti al minimo fino a quando la maggior parte del contenuto della cella non è stata rilasciata.</li>
	<li>Interrompere la registrazione del time-lapse dopo che l'embrione si è stabilizzato (cioè, non è possibile rilevare ulteriori movimenti intracellulari (~ 1-5 min).</li>
	<li>Aggiornare l'annotazione sull'immagine di scansione dei riquadri, se necessario.</li>
</ol>6. Monitoraggio della crescita degli embrioni irradiati
NOTA: il monitoraggio viene effettuato per diversi giorni.
<ol><li>Determinare il tasso di sopravvivenza monitorando il numero di embrioni che si sviluppano dopo l'ablazione laser e confrontarli con quelli che muoiono. NOTA: Alcuni embrioni muoiono immediatamente dopo l'ablazione per vari motivi. Un tasso di mortalità elevato e rapido è di solito un segno di parametri laser inappropriati o di un'esposizione più alta / più lunga allo stress durante l'esperimento o il successivo trasporto.</li>
	<li>Determinare il ritardo di crescita misurando la lunghezza degli embrioni sparati al laser ogni giorno e confrontandolo con embrioni intatti. NOTA: Il tasso di crescita degli organismi laser-shot è generalmente più lento di quello degli organismi non trattati. Tuttavia, alcune impostazioni laser (inappropriate) possono inibire la crescita per più di una settimana, con la crescita che riprende dopo.</li>
	<li>Scopri il danno adiacente monitorando la reazione delle cellule adiacenti alle cellule ablate. In alcuni casi, la depressurizzazione post-scoppio può causare lo scoppio delle cellule vicine.</li>
	<li>Verificare la presenza di contaminazioni da microbi. Monitorare la crescita di microalghe e batteri nel mezzo. Se nel piatto è presente un livello insolito di microbi, scartarlo e ripetere il protocollo dal passaggio 2 o dal passaggio 3. NOTA: Dopo l'ablazione laser, gli embrioni di S. latissima danneggiati sono già molto stressati e ulteriori stress esterni possono causare un aumento della mortalità. Focolai batterici o virali sono possibili perché gli embrioni trattati non possono crescere in condizioni astoniche.</li>
	<li>Controllare lo sviluppo globale degli organismi shot studiando il fenotipo e comprendendo il ruolo nello sviluppo della regione bersaglio.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'ablazione laser cellulare locale consente l'ablazione temporale e spaziale con un alto livello di precisione. Tuttavia, la sua efficienza può essere ostacolata dalla non accessibilità delle cellule bersaglio; ad esempio, tutte le cellule sono di un embrione tridimensionale. Questo protocollo è stato sviluppato sull'embrione dell'alga Saccharina latissima, che sviluppa una lamina monostrato in cui tutte le cellule possono essere facilmente distinte e distrutte individualmente con un raggio laser.
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L'ablazione laser è stata utilizzata per decenni per studiare lo sviluppo dell'embrione. L'irradiazione delle cellule embrionali con un raggio laser consente di monitorare il potenziale rigenerativo e la modifica del lignaggio cellulare durante l'embriogenesi e studiare l'impatto dell'ablazione mirata sulla divisione cellulare e sul destino cellulare. Gli organismi modello utilizzati nei metodi di ablazione laser sono tipicamente animali, come insetti 1,2, nematodi 3,4, vertebrati 5,6 e occasionalmente piante 7,8. Inoltre, un approccio di micro-ablazione laser è stato utilizzato sull'alga marrone Fucus nel 1994 e nel 1998 per dimostrare il ruolo della parete cellulare nella fotopolarizzazione dell'embrione precoce 9,10.
Le alghe brune appartengono al gruppo Stramenopiles, divergente alla radice dell'albero eucariotico 1,6 miliardi di anni fa. Di conseguenza, sono filogeneticamente indipendenti da altri organismi multicellulari, come animali e piante11. Saccharina latissima appartiene all'ordine Laminariales, più comunemente noto come alghe, e sono tra i più grandi organismi sulla terra, raggiungendo dimensioni di oltre 30 m. Saccharina sp. è una grande alga utilizzata per molte applicazioni come alimenti e mangimi, e i suoi polisaccaridi sono estratti per l'uso nelle industrie agricole, farmacologiche e cosmetiche in tutto il mondo12, 13. La sua coltivazione, principalmente in Asia e più recentemente in Europa, richiede la preparazione di embrioni negli incubatoi prima di rilasciare il novellame in mare aperto. Come tutte le alghe, ha un ciclo di vita bifasico composto da una fase gametofita microscopica, durante la quale un gametofito aploide cresce e produce gameti per la fecondazione, e una fase sporofita macroscopica diploide, in cui una grande lama planare si sviluppa dalla sua tenuta attaccata al fondo marino o alle rocce. Lo sporofito rilascia spore aploidi alla maturità, completando così il ciclo di vita 14,15,16.
S. latissima presenta alcune interessanti caratteristiche morfologiche17. Il suo embrione si sviluppa come un foglio planare monostrato 15,18,19 prima di acquisire una struttura multistrato che coincide con l'emergere di diversi tipi di tessuto. Inoltre, Laminariales è uno dei pochi taxa di alghe brune i cui embrioni rimangono attaccati al loro tessuto gametofito materno (Desmarestiales e Sporochnales fanno anche15). Questa caratteristica offre l'opportunità di studiare il ruolo del tessuto materno in questo processo di sviluppo e confrontare i meccanismi di controllo materno nelle alghe brune con quelli negli animali e nelle piante.
Questo articolo presenta il primo protocollo completo per l'ablazione laser in un embrione di alghe precoce. Questo protocollo che coinvolge la tecnica UV ns-pulsed provoca la distruzione specifica di singole cellule embrionali per studiare i loro rispettivi ruoli durante l'embriogenesi. La procedura offre un approccio affidabile per studiare le interazioni cellulari e il destino cellulare durante l'embriogenesi nei Laminariales.

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri con fondo in vetro da 25 mm</td><td>NEST</td><td>801001</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di mare autoclavata-Raccolta</td><td></td><td></td> <td>al largo vicino alla boa di Astan (48&deg; 44.934 N 003&deg; 57,702 W) vicino a Roscoff, Francia, a una profondità di 20 m.</td></tr><tr><td>Raschiatore per celle</td><td>MED 2</td><td>83.3951</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per celle 40 &; micro; m</td><td>Corning / Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Armadi per</td> colture <td>Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01</td><td></td><td>Qualsiasi altra marca è adatta a condizione che l'intensità della luce, il fotoperiodo e la temperatura possano essere controllati.</td></tr><tr><td>LSM 880 Microscopio confocale Zeiss</td><td>Microscopia Carl Zeiss, Jena, Germania</td><td></td><td>L'ablazione e l'imaging sono stati eseguiti utilizzando un obiettivo ad acqua 40x/1,2</td></tr><tr><td>Pestelli a pellet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947</td><td>Polipropilene blu (autoclavabile)</td></tr><tr><td></td><td>La ricetta dell'integratore</td><td></td> Provasoli <td>è disponibile qui: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td></tr><tr><td>Laser pulsato 355 (UGA-42 Caliburn 355/25)</td><td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Paramount</td><td>PDSS 11</td><td></td></tr><tr><td>Software SysCon</td><td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germania</td><td></td><td>Software per driver laser</td></tr><tr><td>Software ZEN</td><td>Carl Zeiss microscopy, Jena, Germania</td><td></td><td>Software di imaging, utilizzato insieme al software SysCon; Versione nera 2.3</td></tr></tbody></table>

ablazione laser mirata nell'embrione di saccharina latissima

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

In Saccharina latissima, l'embrione si sviluppa come un foglio cellulare monostrato chiamato lamina o lama. Ogni cellula embrionale è facile da osservare, facilmente distinguibile dai suoi vicini e può essere presa di mira individualmente. Per decenni, l'ablazione laser è stata utilizzata per studiare lo sviluppo degli embrioni. Qui è stato sviluppato un protocollo per l'ablazione laser cellulare specifica per i primi embrioni dell'alga bruna S. latissima. Il lavoro presentato comprende: (1) la preparazione di embrioni di Saccharina , con una descrizione dei parametri critici, comprese le condizioni di coltura, (2) le impostazioni di ablazione laser e (3) il monitoraggio della successiva crescita dell'embrione irradiato utilizzando la microscopia time-lapse. Inoltre, vengono forniti dettagli sulle condizioni ottimali per il trasporto degli embrioni dalla piattaforma di imaging al laboratorio, che possono influenzare profondamente il successivo sviluppo dell'embrione. Le alghe appartenenti all'ordine Laminariales mostrano modelli di embriogenesi simili a Saccharina; questo protocollo può quindi essere facilmente trasferito ad altre specie in questo taxon.

I gametofiti di S. latissima sono stati coltivati e la gametogenesi è stata indotta a produrre zigoti ed embrioni. Dodici giorni dopo l'induzione della gametogenesi, gli embrioni sono stati sottoposti ad ablazione laser. Qui, l'esperimento mirava a valutare il ruolo di cellule specifiche nello sviluppo complessivo degli embrioni di S. latissima . La cellula più apicale, la cellula più basale e le cellule mediane sono state prese di mira. Dopo la scansione delle piastrelle, l'intera capsula di Petri (<st...

La distruzione di cellule specifiche nell'embrione è un potente strumento per studiare le interazioni cellulari coinvolte nel destino cellulare. Il presente protocollo descrive le tecniche per l'ablazione laser di cellule bersaglio nell'embrione precoce dell'alga bruna Saccharina latissima.

Ablazione laser mirata nell'embrione di Saccharina latissima

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

Questo protocollo è il primo protocollo di ablazione laser completo sull'embrione precoce di alghe. La procedura offre un approccio affidabile per studiare il destino e l'interazione cellulare durante l'embriogenesi nelle alghe brune. L'ablazione laser cellulare locale consente l'ablazione temporale e speciale con un alto livello di precisione e tessuto sulle cellule.Questo approccio è un metodo promettente per studiare il destino cellulare e l'interazione nell'embrione precoce delle alghe brune. Può essere applicato ad altri sistemi di alghe con poche modifiche. Inizia con l'imaging dell'intera capsula di Petri per localizzare gli embrioni per la selezione durante la fase di ablazione e monitorare il successivo sviluppo degli embrioni selezionati.Avviare la scansione dei riquadri. Registrare la posizione dei quattro punti cardinali della capsula di Petri. Inserisci i parametri definiti nel manoscritto testuale e acquisisci immagini trasmesse o fluorescenti dell'intera capsula di Petri a bassa risoluzione.Salvare l'immagine di scansione dei riquadri e tenerla aperta nella finestra del software di acquisizione delle immagini. Cambia l'obiettivo senza rimuovere la capsula di Petri. T

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death utilizzando la microscopia confocale laser UV convenzionale. J. Vis. Exp. (2017) In questo video, esploriamo la tecnica dell'ablazione laser UV ad alta intensità per indirizzare e studiare con precisione i singoli neuroni nel pesce zebra transgenico. Dimostriamo come preparare, immobilizzare e visualizzare le risposte neuronali, evidenziando le dinamiche cellulari della lesione e del recupero.

Ablazione laser selettiva a singolo neurone in una larva di zebrafish utilizzando un microscopio confocale

Fonte: Muto, A., et al. Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un laser a due fotoni e sua valutazione utilizzando l'imaging del calcio e la registrazione comportamentale nelle larve di zebrafish. J. Vis. Exp. (2018) In questo video,  Viene dimostrata una procedura di ablazione laser a due fotoni, che consente la distruzione selettiva dei neuroni fluorescenti in larve di zebrafish immobilizzate con agarosio. L'imaging ad alta risoluzione prima e dopo la procedura conferma...

Ablazione neuronale mirata mediante microscopia a due fotoni in una larava di pesce zebra

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l'evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Questo protocollo mostra come eseguire la microiniezione citoplasmatica negli zigoti degli animali da allevamento. Questa tecnica può essere utilizzata per fornire qualsiasi soluzione nell'embrione unicellulare, come gli strumenti di editing del genoma per generare animali knockout.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Lo sviluppo embrionale richiede una coordinazione su larga scala del movimento cellulare. L'ablazione laser mediata dall'eccitazione a due fotoni consente l'ablazione tridimensionale controllata spazialmente di grandi gruppi di cellule profonde. Inoltre, questa tecnica può sondare la reazione delle cellule che migrano collettivamente in vivo alle perturbazioni nel loro ambiente meccanico.

Ablazioni di volume profonde e controllate spazialmente utilizzando un microscopio a due fotoni nella Zebrafish Gastrula

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

Questo protocollo dimostra l'ablazione laser di singoli neuroni in larve di Drosophila intatte. Il metodo consente di studiare l'effetto della riduzione della competizione tra i neuroni nel sistema nervoso in via di sviluppo.

L'ablazione cellulare laser in larve di Drosophila intatte rivela la competizione sinaptica

Questo protocollo descrive un approccio di ablazione laser a due fotoni effettuato su larve di zebrafish, che funge da modello per studiare la rigenerazione ossea e gli effetti della risposta immunitaria all'ablazione.

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Scopri l'ablazione laser mirata negli embrioni di Saccharina latissima per studiare il destino cellulare e le interazioni durante l'embriogenesi nelle alghe brune. Questo metodo offre precisione elevata per ricerche sullo sviluppo.

Ablazione laser mirata nell'embrione di Saccharina latissima

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