Microdissezione a strati di foglietti valvolari tricuspidi per caratterizzazione meccanica biassiale e quantificazione microstrutturale

Questo metodo può isolare i contributi degli strati tissutali al comportamento generale del tessuto, fornendo nuove informazioni sulla microstruttura del tessuto. Il nostro framework di microdissezione e test ci consente di confrontare direttamente le proprietà meccaniche e microstrutturali dei lembi delle valvole cardiache con i loro strati compositi. La microdissezione può essere difficile da padroneggiare, quindi, si consiglia vivamente di esercitarsi il più possibile prima di avviare lo studio.

Per prima cosa, raccogli i materiali richiesti, il pannello di cera, l'acqua DI, la pipetta, il bisturi, le micro forbici, le pinze sottili, le pinze curve, le pinze spesse e i perni. Smontare il tessuto dal tester biassiale e misurarne lo spessore utilizzando il sensore di spostamento laser. Posizionare il tessuto sulla tavola di cera.

Esaminare il lato ventricolare del tessuto per grandi inserzioni di corda. Scatta una fotografia come riferimento. Stendere il tessuto piatto sulla tavola di cera con l'atriale rivolto verso l'alto.

Per fissare il tessuto alla tavola, posizionare un perno angolato lontano dal tessuto in ogni angolo in modo che tiri leggermente il tessuto teso. Assicurarsi che i perni siano all'esterno dei fori creati dai denti durante il montaggio del tessuto e che il tessuto sia quadrato e non si sposti durante la microdissezione dello strato. Se necessario, posizionare i perni lungo il lato del tessuto durante la dissezione per allungare maggiormente il tessuto.

Rimuovere i marcatori fiduciali di perline di vetro. Posizionare l'acqua DI sulla superficie del tessuto con una pipetta in modo che copra completamente il tessuto in modo simile a una bolla. Per fare l'angolo iniziale, selezionare un angolo del campione appuntato, evitando grandi inserzioni di corda in aree fragili.

Quindi, tagliare lo strato A / S trascinando leggermente il bisturi sulla superficie del tessuto lungo i fori di montaggio per i test meccanici. I bordi del taglio iniziano a staccarsi, rivelando lo strato F/V sottostante. Con pinze smussate e sottili, strofinare saldamente lungo il taglio per separarne ulteriormente i bordi.

Se il taglio nello strato A / S non inizia a staccarsi, tracciare leggermente sullo stesso taglio di nuovo con un bisturi. Fate un secondo taglio perpendicolare al primo taglio. Se i due tagli non sono collegati, eseguire le pinzette sottili sotto la piccola area di tessuto che separa i due tagli.

Quindi, utilizzare con attenzione le forbici per tagliare il tessuto. Strofinare lungo i tagli dell'angolo con una pinza sottile fino a quando il tessuto non si separa dallo strato F / V. Non appena un piccolo pezzo di tessuto viene separato, afferrarlo con le grandi pinzette e tirarlo delicatamente per separare ulteriormente gli strati compositi.

Continuare a sbucciare il tessuto afferrandolo con una pinzetta più grande per evitare strappi e strappi indesiderati dello strato composito A / S e strofinare la cucitura fino a raggiungere la fine dei due tagli fatti per l'angolo. Se la prima curva ha grossi problemi con la separazione, prova una curva diversa come punto di partenza. Quindi, per fare un secondo angolo, estendere i due tagli fatti per il primo angolo posizionando la punta del bisturi nella parte inferiore di ogni taglio e trascinandola leggermente lungo la superficie del tessuto in modo che le estensioni del taglio si colleghino ai tagli originali e continuino a seguire i fori del tine o della sutura.

Continuare ad estendere i tagli e a staccare lo strato A/S composito superiore mentre si strofina la cucitura fino a quando un lato non è finito. Osserva che il tessuto sarà completamente separato lungo un taglio. Quindi, creare un secondo angolo perpendicolare alla fine del lato completamente sbucciato.

Estendere i tagli rimanenti evitando grandi inserzioni di chorda. Escludere le inserzioni di chorda dall'area di separazione A/S solo quando questa esclusione consentirà un campione A/S abbastanza grande per caratterizzazioni sperimentali. Continuare a separare gli strati A/S e F/V utilizzando le tecniche di sfregamento e trazione utilizzate per la prima curva.

Smettere di separare immediatamente il tessuto se si forma una lacrima o un foro. Per evitare che le pinzette vengano catturate, posizionare le forbici in qualsiasi foro che si forma e tagliare il tessuto lontano dal centro. Se il difetto si forma lungo la cucitura di separazione, iniziare a separare il tessuto lungo un altro bordo.

Cercare connessioni interstrato che possono apparire quando si separa il tessuto e prevenire un'ulteriore separazione del tessuto. Osserva che si tratta di fili sottili ma forti che devono essere tagliati con cura usando le forbici. Evitate di creare un foro nel livello A/S o di tagliare verso il basso nel livello F/V.

Continuare questo processo fino a quando il campione più grande possibile dello strato A/S non è stato separato. Contrassegnare l'orientamento del campione utilizzando la penna chirurgica. Infine, tagliare lungo la cucitura di separazione per il bordo del tessuto rimanente con le forbici.

Posizionare lo strato composito A/S separato piatto sul tappetino di taglio. Se necessario, utilizzare il bisturi per raddrizzare i bordi del tessuto e creare una forma di tessuto quadrato adatta per i test meccanici biassiali. Posizionare lo strato A / S in acqua DI fino a quando non è pronto per essere testato.

Contrassegnare l'orientamento dello strato F/V che rimane sulla tavola di cera. Tagliare il quadrato più grande possibile dall'area in cui è stato rimosso lo strato A/S. Quindi, metterlo in acqua DI.

L'analisi istologica del foglietto intatto e dei due strati sezionati ha verificato se il tessuto era correttamente separato lungo il confine tra la spongiosa e la fibrosa. Le micrografie istologiche sono state utilizzate per determinare lo spessore dello strato tissutale e le frazioni di massa costituenti utilizzando il software ImageJ. I test meccanici controllati dallo spostamento e la post-elaborazione hanno prodotto la tensione della membrana rispetto ai dati di allungamento del foglietto anteriore della valvola tricuspide, del foglietto posteriore della valvola tricuspide e del foglietto settale della valvola tricuspide, descrivendo il comportamento meccanico non lineare del tessuto.

I dati di imaging del dominio della frequenza spaziale polarizzata hanno prodotto mappe a colori dell'orientamento della fibra di collagene e del grado di anisotropia ottica. In particolare, queste mappe a colori hanno fornito una comprensione completa dell'architettura della fibra di collagene attraverso l'intero campione di tessuto. È importante notare che lo strato composito si restringe una volta separato dal tessuto appuntato.

Raccogliere il campione più grande possibile per assicurarsi che ci sia abbastanza tessuto per il test successivo.