Name: Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare lespressione di CD226 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226 mediante citometria a flusso. Questo metodo consente di studiare il ruolo delle ILC2 nelle malattie nasali.

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R.Z. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81871258) e dai fondi forniti dalla Fourth Military Medical University (No.2020rcfczr). Y.Z. è stato supportato dal Programma di ricerca di base di scienze naturali dello Shaanxi (n. 2021JM-081).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure e i protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico per la Ricerca Scientifica della Quarta Università Medica Militare (n. 20211008).
1. Creazione di modelli AR murini
<ol><li>Ospitare topi selvatici maschi e femmine (WT) C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane in specifiche condizioni prive di agenti patogeni e fornire chow e acqua standard di laboratorio.</li>
	<li>Emulsionare 50 μg di ovoalbumina (OVA) in 0,2 mL di PBS sterile contenente 2 mg di idrossido di alluminio su un banco pulito per mantenere la sterilità. Nei giorni 0, 7 e 14, iniettare per via intraperitoneale topi femmina o maschio con 50 μg ciascuno di OAV emulsionati.</li>
	<li>Nei giorni 21, 22, 23, 24 e 25, i topi instillati per via intranasale con 50 μg di OAV disciolti in 30 μL di PBS sterile (15 μL per narice) in anestesia per inalazione (isoflurano al 2-3% con una portata di ossigeno o 0,5 L / min).</li>
	<li>Eutanasia dei topi 24 ore dopo l'ultima sfida (giorno 26).</li>
</ol>2. Isolamento delle cellule mononucleate (MNC) dalla mucosa nasale
<ol><li>Eutanasia dei topi per lussazione cervicale in anestesia profonda. Immergere i topi a testa in su in etanolo al 75% per 5 minuti ed evitare che l'etanolo entri nella narice esterna. Posizionare l'addome verso il basso sul tavolo operatorio.</li>
	<li>Taglia i denti anteriori. Sulla linea mediana della testa, fai un'incisione e apri la pelle usando le forbici.</li>
	<li>Rimuovere la mascella inferiore, tagliare l'intero naso lungo la fine del palato e posizionare il tessuto in una capsula di Petri da 60 mm contenente 5 ml di PBS ghiacciato. Usando forbici e pinze, rimuovere la carne e i muscoli che aderiscono alle ossa.</li>
	<li>Trasferire il naso del topo in una nuova capsula di Petri da 60 mm contenente 5 ml di PBS ghiacciato. Lavare le ossa due volte con 5 ml di PBS ghiacciato.</li>
	<li>Trasferire il naso in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
	<li>Rompere e trasferire sufficientemente il naso in una provetta da 15 mL contenente 2 mL di tampone digest preriscaldato (RPMI 1640 medium integrato con 1 mg/mL di collagenasi IV e 10 U/mL DNasi I).</li>
	<li>Fissare il coperchio e posizionare il tubo verticalmente in uno shaker orbitale a 37 °C, con agitazione continua a 120-150 giri/min per 40 minuti. NOTA: Preriscaldare il tampone digestivo a 37 °C per ottenere la massima attività enzimatica.</li>
	<li>Aggiungere 5 ml di terreno RPMI 1640 ghiacciato contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) per interrompere il processo di digestione.</li>
	<li>Filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere i frammenti solidi.</li>
	<li>Centrifugare a 500 x g per 5 minuti, quindi eliminare delicatamente il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in RPMI 1640 a freddo ghiacciato e centrifugare a 500 x g per 5 minuti. Scartare delicatamente il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 4 mL di fluido gradiente al 40% (160 μL di 10x PBS + 1,44 mL di soluzione madre di fluido a gradiente di densità + 2,4 mL di mezzo RPMI 1640).</li>
	<li>Inserire delicatamente una pipetta Pasteur sul fondo del tubo e aggiungere lentamente 2,5 ml di fluido con gradiente all'80% (200 μL di 10x PBS + 1,8 mL di soluzione madre di fluido con gradiente di densità + 0,5 mL di fluido RPMI 1640).</li>
	<li>Impostare la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga più bassa rispetto alla terza marcia e centrifugare a 400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Rimuovere lo strato superiore di impurità prima di drenare le celle all'interfaccia per evitare potenziali contaminazioni. Drenare accuratamente lo strato di celle mononucleate (MNC) all'interfaccia del fluido con gradiente di densità del 40%/80% in un tubo da 15 mL contenente 2 mL di PBS ghiacciato utilizzando una pipetta. Lavare le cellule con PBS ghiacciato due volte.</li>
</ol>3. Colorazione superficiale per l'analisi FCM
<ol><li>Raccogliere le cellule e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in tampone colorante (PBS integrato con 2% FBS e 0,1% NaN3) e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si prepara il tampone anti-colorazione. NaN3 è molto tossico e può causare danni agli organi se ingerito, inalato o a contatto con la pelle. Inoltre, evitare il rilascio nell'ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in una soluzione bloccante da 80 μL (anticorpo anti-CD16/32 (1:100) diluito in tampone colorante) per provetta. Incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.</li>
	<li>Senza lavare, aggiungere 20 μL della diluizione appropriata del cocktail di anticorpi che colora la superficie (Tabella 1).</li>
	<li>Aggiungere 1 μL (per test) di colorante vitalità fissabile 520 (FVD) appena prima di aggiungere il cocktail di anticorpi ai campioni. Incubare al buio a 4 °C per 30 min. Impostare gli anticorpi isotipo corrispondenti e la fluorescenza meno uno (FMO) come controlli negativi.</li>
	<li>Lavare le celle in 500 μL di tampone colorante centrifugando a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone colorante. Aggiungere 50 μL di perline di conteggio assoluto a vortice alle cellule colorate e agitare. Sottoporli a un'analisi di citometria a flusso (FCM). NOTA: I dati FCM sono stati ottenuti utilizzando un analizzatore di cellule spettrali e analizzati con il software di analisi della citometria a flusso (FCM).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le ILC2 sono strettamente associate all'infiammazione di tipo 2 e ai disturbi infiammatori, come dimostrato da un numero crescente di studi. Sia i modelli murini che l'osservazione umana contribuiscono a una migliore comprensione della sua funzione nelle vie aeree superiori. Nella fisiopatologia asmatica, le ILC2 sono attivate attraverso la linfopoietina stromale timica, IL-25 e IL-33, che sono per lo più prodotte dalle cellule epiteliali. Quindi, rispecchiando le cellule Th2, le ILC2 producono IL-4, IL-5 e IL-13 per agg...

Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2) sono state scoperte per la prima volta nei tessuti della cavità peritoneale dei topi e successivamente hanno dimostrato di essere presenti nel sangue e in altri tessuti periferici come polmoni, pelle e cavità nasale 1,2,3. Come cellule residenti nei tessuti, le ILC2 sono principalmente mantenute e proliferate localmente e funzionano come le prime guardie che rispondono agli stimoli dannosi esogeni producendo numerose citochine di tipo 2 e inducendo l'immunità di tipo 2 4,5,6. Le ILC2 possono anche esercitare i loro effetti attraverso il traffico verso i tessuti infetti 7,8.
Analogamente alle cellule T-helper 2 (Th2), le complicate reti regolatorie delle ILC2 assicurano il loro coinvolgimento significativo nella progressione di varie malattie infiammatorie di tipo 2, comprese le malattie allergiche delle vie aeree 8,9. Nell'asma, le allarmine derivate dalle cellule epiteliali possono attivare ILC2, che promuovono ulteriormente l'infiammazione polmonare attraverso la secrezione di interleuchina (IL)-4, IL-5 e IL-1310. Studi clinici hanno anche indicato che i livelli di ILC2 erano significativamente elevati nell'espettorato e nel sangue dei pazienti con asma grave, suggerendo un'associazione di ILC2 con la gravità dell'asma e la loro funzione come predittore della progressione dell'asma11.
La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica comune che colpisce milioni di persone ogni anno e i trattamenti efficaci per questa malattia sono limitati12,13. Le ILC2 svolgono un ruolo cruciale nella fisiopatologia dell'AR, sia nella fase di sensibilizzazione che nella generazione di sintomi e nella fase14 dell'infiammazione. Nei pazienti con AR, i livelli di ILC2 nel sangue periferico sono stati segnalati per essere elevati sia localmente che sistemicamente15. Tuttavia, alcuni effetti e i meccanismi alla base delle ILC2 sulla fisiopatologia e sulla progressione dell'AR richiedono ancora ulteriori esplorazioni.
CD226 - una glicoproteina transmembrana che funge da molecola costimolatoria - è espressa principalmente su cellule natural killer (NK), cellule T e altri monociti infiammatori16,17. L'interazione di CD226 e dei suoi ligandi (CD155 e/o CD112) o concorrente (TIGIT) gli consente di partecipare alle funzioni biologiche di varie cellule immunitarie18. Il legame dei ligandi sulle cellule presentanti l'antigene a CD226 sui linfociti citotossici (CTL) promuove l'attivazione di entrambe le cellule contemporaneamente, mentre l'attivazione della CTL può essere ulteriormente soppressa da TIGIT (immunorecettore delle cellule T con domini Ig e ITIM), il concorrente di CD22619,20. Uno studio umano ex vivo ha rivelato che CD226 e CD155 sulle cellule T regolano l'equilibrio tra Th1 / Th17 e Th2 attraverso la modulazione differenziale dei sottoinsiemi Th21. CD226 può anche mediare l'adesione piastrinica e l'attività di uccisione del tumore NK22,23. Nel frattempo, CD226 è ben studiato nella patogenesi di varie malattie infettive, malattie autoimmuni e tumori 18,24,25. Allo stato attuale, CD226 è diventato un nuovo punto luminoso per l'immunoterapia. Gli studi hanno scoperto che le vescicole extracellulari possono invertire l'espressione di CD226 sulle cellule NK per ripristinare la loro attività citotossica e intervenire nella progressione del cancro del polmone26. Uno studio recente ha rivelato un sottogruppo di ILC intestinali fetali di gruppo 3 caratterizzati da un'elevata espressione di CD226 mediante sequenziamento dell'RNA a singola cellula27, che ha indicato che CD226 potrebbe esercitare ruoli nell'immunità innata linfoide-mediata dalle cellule.
La nostra conoscenza delle ILC2 nell'infiammazione delle vie aeree si basa principalmente su studi sull'asma; Tuttavia, si sa poco sulle loro funzioni nell'immunità della mucosa nasale. Pertanto, è stato stabilito un protocollo per isolare e identificare le ILC2 dalla mucosa nasale. Lo studio si concentra sull'espressione di CD226 sulle ILC2 nei tessuti nasali e sulla sua variazione tra topi sani e AR. Ciò può fornire nuove informazioni sui meccanismi alla base della regolazione mediata da ILC2 nell'immunità locale e servire come base per lo sviluppo di nuovi approcci per il trattamento dell'AR.

<table><tbody><tr><td>Idrossido di alluminio</td><td>Meilun biological Technology</td><td>21645-51-2</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td>Utilizzato nell'anticorpo coctail</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BioLegend</td> 117306 <td>Utilizzato nell'anticorpo coctail</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Clone: 93; Diluizione 1:100</td></tr><tr><td>CD226</td><td>BioLegend</td> 128812 <td>Utilizzato nell'anticorpo coctail</td><td></td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td> 100306 <td>Utilizzato nell'anticorpo coctail</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td> 103128 <td>Utilizzato nell'anticorpo coctail</td><td></td></tr><tr><td>CD45R</td><td>eBioscience</td><td>11-0452-82</td><td>Utilizzato nell'anticorpo coctail</td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553014</td><td>Utilizzato nell'anticorpo coctail</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>DIYIBio</td><td>DY40128</td><td></td></tr><tr><td>CountBright perline di conteggio assoluto</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td>perline di conteggio assoluto</td></tr><tr><td>Dnase <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margine: auto; "></td><td>Beyotime</td><td>D7076</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di vitalità fissabile eFluor 520 (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>65-0867-14</td><td>FVD</td></tr><tr><td>HBSS, calcio, magnesio</td><td>Servicebio</td><td>G4204-500</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1</td><td>eBioscience</td><td>17-5893-81</td><td>Utilizzato nel cocktail anticorpale</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>SIGMA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Software NovoExpress</td><td>AgilentTechnologies</td><td>Versione 1.5.0</td><td>Software di analisi per citometria a flusso (FCM)</td></tr><tr><td>OVA</td><td></td><td>SIGMA 9006-59-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Yeasen</td><td>40501ES60</td><td>densità terreno di coltura a gradiente</td></tr><tr><td>RPMI 1640 terreno</td><td>di coltura Corning</td><td>10-040-CVRV</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di cellule spettrali</td><td>SONY</td><td>SA3800</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di cd226

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

Con abbondanti ricerche sulle cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) pubblicate nel corso degli anni, le ILC2 sono ampiamente note per essere implicate nella regolazione di vari processi patologici, tra cui l'immunità anti-elminti, la riparazione dei tessuti, la termogenesi e le malattie autoimmuni come l'asma e la rinite allergica (AR). Le ILC2 risiedono permanentemente nei tessuti periferici come la pelle, l'intestino, i polmoni e la cavità nasale; Tuttavia, ci sono informazioni limitate sulle loro esatte funzioni nell'immunità della mucosa nasale. CD226 è una molecola costimolatoria attivante, espressa principalmente su cellule natural killer (NK), cellule T e monociti infiammatori. Tuttavia, se le ILC2 esprimono CD226 o svolgono un ruolo nella patogenesi delle malattie correlate alle ILC2 rimane sconosciuto. Qui, abbiamo stabilito un metodo per isolare e identificare ILC2 dalla mucosa nasale e rilevato l'espressione di CD226 su ILC2 ottenute da topi sani e AR. Qui, descriviamo questo protocollo per l'isolamento e l'identificazione di ILC2 dalla mucosa nasale del topo, che aiuterà a esplorare il meccanismo patologico interno dei disturbi immunologici nelle malattie della mucosa nasale.

È stato sviluppato un modello murino indotto da OAV per esplorare il ruolo delle ILC2 nell'AR. La costruzione del modello murino AR si è basata su studi precedenti con lievi modifiche 28,29,30,31. È stato catturato un video di 10 minuti per misurare la frequenza degli starnuti e dei graffi nasali dopo l'ultima sfida nasale. I sintomi allergici dei topi AR indotti da OAV sono stati presentati ne...

Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2), implicate nell'infiammazione di tipo 2, partecipano principalmente alla risposta all'infezione da elminti, alle malattie allergiche, all'omeostasi metabolica e alla riparazione dei tessuti. In questo studio, viene dimostrata una procedura per isolare le ILC2 dalla mucosa nasale murina e rilevare l'espressione di CD226.

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Questo protocollo è stabilito per isolare e identificare le cellule linfoidi innate del gruppo due dalla mucosa nasale murina ed esplorare i determinati effetti e meccanismi sottostanti dell'ILC due nelle malattie nasali. Questa tecnica consente ai ricercatori di isolare ILC due dal mesoteliale locale ed esporre l'espressione dell'antigene di superficie mediante citometria a flusso. La nostra tecnica non prevede operazioni complicate.Tuttavia, una cosa importante è cercare di rimuovere completamente la carne aderente alle piccole ossa per evitare l'impatto di altri tessuti vicini Prima di iniziare l'esperimento, ospitare topi neri selvatici di tipo C57 sei maschi e femmine di età compresa tra 8 e 12 settimane in condizioni specifiche prive di agenti patogeni forniti di chow e acqua di laboratorio standard. Per stabilire il modello di rinite allergica, emulsionare 50 microgrammi di ovalbumina in 0,2 millilitri di PBS sterile contenente due milligrammi di idrossido di alluminio e iniettare per via intraperitoneale 50 microgrammi di ovoalbumina emulsionata in ciascun topo su zero, sette e 14 giorni. Nei giorni 21, 22, 23, 24 e 25, i topi instillati per via intranasale con 50 microgrammi di ovalbumina si sono sciolti in 30 microlitri di PBS sterile, seguiti dall'eutanasia dei topi 24 ore dopo l'ultima sfida.Immergere la testa del topo eutanasia in etanolo al 75% per cinque minuti ed evitare che l'etanolo entri nella narice esterna. Posizionare l'addome verso il basso sul tavolo operatorio. Tagliare i quattro denti e sulla linea mediana della testa fare un'incisione e tagliare la pelle usando le forbici.Quindi, rimuovere la mascella inferiore, tagliare l'intero naso lungo la fine del palato e posizionare il tessuto in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente cinque litri di PBS ghiacciato. Usando forbici e pinze, rimuovere la carne e i muscoli che aderiscono alle ossa. Quindi, trasferire il naso del topo in una nuova capsula di Petri da 60 millimetri contenente cinque millilitri di PBS ghiacciato e lavare le ossa.Dopo il secondo lavaggio, trasferire il naso in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Rompere sufficientemente il tessuto e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di tampone digestivo preriscaldato. Fissare il coperchio e posizionare il tubo verticalmente in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e da 120 a 150 RPM per 40 minuti.Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo RPMI 1640 ghiacciato contenente il 10% di siero bovino fetale per interrompere la digestione. Quindi filtrare il contenuto attraverso un filtro a celle da 70 micron per rimuovere i frammenti solidi. Dopo aver centrifugato il filtrato a 500 G per cinque minuti, scartare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet in mezzo RPMI 1640 ghiacciato.Per ripetere la centrifugazione come dimostrato in precedenza, risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di mezzo con gradiente del 40%. Quindi, inserire delicatamente un pipet Pasteur sul fondo del tubo per aggiungere 2,5 millilitri di fluido sfumato all'80% di densità. Centrifugare il tubo a 400 G per 15 minuti a temperatura ambiente con la velocità di accelerazione e decelerazione impostata inferiore rispetto alla terza marcia.Prima di drenare le celle all'interfaccia, rimuovere lo strato superiore di impurità per evitare potenziali contaminazioni. Quindi utilizzare un pipettuccio per drenare lo strato di cellule mononucleate all'interfaccia del fluido con gradiente di densità del 40% per 80% in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di ghiaccio freddo. Lavare le celle con PBS ghiacciato due volte.Raccogliere le cellule e centrifugarle per cinque minuti a 500 g a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet cellulare nel tampone colorante e centrifugare nuovamente per cinque minuti a 500 G.Eliminare il surnatante. Risospendere e incubare le cellule in una soluzione bloccante da 80 microlitri per 30 minuti a quattro gradi Celsius allo stato di oscurità.Aggiungere un microlitro di colorante vitalità fissabile 520 subito prima di aggiungere 20 microlitri del cocktail di anticorpi anticorpali di colorazione superficiale della diluizione appropriata al campione. Inoltre, impostare gli anticorpi isotipo corrispondenti e la fluorescenza meno uno come controlli negativi. Quindi, lavare le cellule in 500 microlitri di tampone colorante centrifugando a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Quindi risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone colorante. Infine, aggiungere 50 microlitri di perline di conteggio assoluto a vortice alle celle colorate. Agitarli e sottoporli a un'analisi di citometria a flusso.Un modello murino indotto da ovuli sviluppato per esplorare il ruolo delle cellule linfoidi innate del gruppo due ha mostrato che la frequenza di sfregamento nasale e starnuti nei topi con rinite allergica era significativamente più alta rispetto al gruppo di controllo. Nella mucosa nasale di topi di controllo sani, sono state identificate circa il 2-3% delle cellule negative del lignaggio e CD 45 positive. Il numero assoluto di cellule linfoidi innate del gruppo due variava da 2.000 a 4.000.L'analisi della citometria a flusso ha indicato un notevole aumento del numero totale di cellule linfoidi innate del gruppo due nella mucosa nasale della rinite allergica rispetto a quella nei topi sani di controllo. Una maggiore espressione di CD 226 è stata rilevata sulle cellule linfoidi innate del gruppo due nei topi con rinite allergica rispetto ai topi di controllo. Inoltre, l'intensità media della fluorescenza di CD 226 era significativamente sovraregolata nei topi AR.Essere consapevoli dei passaggi di rimozione della carne aderente all'osso nasale, impostando il tasso di accelerazione e decelerazione durante la centrifugazione dei mezzi e il drenaggio delle cellule mononucleate. I due ILC identificati possono essere un supporto per la caratterizzazione della citometria a flusso ordinati per la coltura cellulare o stimolati in vitro, che aiuterebbero a esplorare il rischio specifico di ILC due nel tessuto nasale. Questa procedura di isolamento e caratterizzazione dei linfociti, in particolare nelle cellule linfatiche innate nella mucosa nasale, rende questo protocollo un riferimento preliminare per i ricercatori che esplorano l'ambiente immunitario nasale locale.

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