Name: Dispositivi elettronici organici flessibili per la terapia del campo elettrico pulsato del glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Scopri come utilizzare dispositivi elettronici flessibili per la terapia con campi elettrici pulsati nel trattamento del glioblastoma. Questo metodo integra modelli in vitro e in vivo per visualizzare il microambiente tumorale.

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Il lavoro qui riportato è stato sostenuto dall'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR-18-CE19-0029). Gli autori ringraziano calorosamente S.M. Bardet per il suo contributo alla generazione di una linea cellulare GCaMP6f stabile e D. O'Connor per il suo aiuto con il modello in ovo .

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L'approccio descritto in questo lavoro consente a modelli di tumore cerebrale con un sistema integrato di rilascio di PEF di studiare l'effetto delle PEF a diversi livelli di organizzazione biologica. Il protocollo di microfabbricazione consiste in processi standard a film sottile, che forniscono un ampio grado di libertà nella progettazione degli elettrodi che può essere adattato all'applicazione specifica. A volte, un'ulteriore fase di ricottura termica può essere utile alla fine della fabbricazione, per ridurre la flessione degli elettrodi che si è verificata durante la produzione.
L'uso di una linea cellulare stabile di glioblastoma che esprime un indicatore fluorescente di calcio evita tutte le complicazioni legate alla consegna e alla ritenzione del colorante, specialmente nei tumori 3D che sono molto densi16. In effetti, un alto livello di espressione è osservato per un lungo periodo rispetto agli indicatori chimici fluorescenti standarddel calcio 17. Questo protocollo può essere applicato a varie linee cellulari, poiché è comunemente usato per l'imaging dell'attività neurale11. Qui sono state utilizzate linee cellulari umane e murine (U87 e Gl261 per l'impianto in topi immunodeficienti o immunocompetenti, rispettivamente). Infatti, studi recenti hanno dimostrato che la linea cellulare U87 è diversa da quella delle cellule originali in quanto molte mutazioni sono state acquisite in anni di coltura cellulare, influenzando la riproducibilità sperimentale18. Il metodo utilizzato per la preparazione dei tumori 3D è ad alto rendimento, riproducibile e consente la generazione di sferoidi di dimensioni specifiche a seconda della linea cellulare, del numero di cellule in fase di semina e del tempo di crescita19. Tuttavia, questi sferoidi sono densi, il che presenta uno svantaggio quando si esegue l'imaging al centro del tumore.
Il modello in ovo è utile come primo approccio per studiare l'effetto della PEF sui tumori 3D e sulla loro vascolarizzazione, senza interazioni con altri tipi cellulari presenti nel cervello. Questo modello è economico, veloce, ad alto rendimento e solleva meno problemi etici rispetto ai modelli animali. È importante mantenere l'integrità dell'embrione durante l'intero esperimento, in quanto potrebbe influire sulla sua sopravvivenza e sulla qualità dell'imaging. Prestare particolare attenzione durante l'apertura dell'uovo di quaglia, per evitare danni alla membrana embrionale. Anche l'innesto e il posizionamento degli elettrodi flessibili devono essere eseguiti con attenzione, per evitare sanguinamenti che potrebbero uccidere l'embrione. L'iniezione di colorante fluorescente nei vasi sanguigni consente la visualizzazione simultanea delle cellule tumorali e la vascolarizzazione con microscopia a fluorescenza. L'iniezione intraoculare deve essere eseguita con attenzione per evitare fuoriuscite di colorante nel liquido embrionale, che potrebbe causare una fluorescenza residua sullo sfondo che degrada la qualità dell'imaging. Questo modello può essere utilizzato anche per seguire l'assorbimento del farmaco, in quanto consente l'accesso al sistema circolatorio. Tuttavia, gli esperimenti sono limitati dal tempo di sopravvivenza di 12 giorni dell'embrione, consentendo così 7 giorni di osservazione, che è significativamente più breve del modello in vivo 21.
Il modello di tumore cerebrale in vivo può essere monitorato per 4-5 settimane prima che gli animali raggiungano un endpoint sperimentale etico determinato da un'improvvisa perdita di peso del 20%. È ben tollerato e rimane in posizione se la coda di collegamento dell'elettrodo non è troppo lunga. Altrimenti, gli animali tendono a graffiare il connettore ribaltabile, che alla fine potrebbe essere strappato, impedendo così la successiva connessione allo stimolatore. Questo periodo di 4 settimane è comunque prezioso per coprire le diverse fasi dello sviluppo del glioblastoma. Quando si confrontano le densità delle cellule tumorali nello stesso volume di interesse a diversi intervalli di tempo, si può osservare l'evoluzione della cinetica di crescita del tumore. In particolare, una maggiore crescita tumorale è stata osservata al momento del passaggio immunitario22. Uno studio simile in presenza di un elettrodo stimolante informerebbe sull'effetto della PEF sul tasso di proliferazione tumorale e sulla sensibilità tumorale all'eliminazione immunitaria. Rispetto al modello in ovo , il modello in vivo può essere visto come un valido modello preclinico per studiare l'impatto delle cellule immunitarie sulla progressione tumorale e il loro contributo all'effetto terapeutico della PEF. Questo protocollo è adattato da un articolo precedente con l'aggiunta di un dispositivo elettrodo flessibile sul tumore prima di posizionare una finestra cranica14. Sia i trattamenti bioelettrici acuti che cronici dei tumori possono essere caratterizzati da osservazioni dirette e successive con microscopia a due fotoni, dato che ci si aspetta che la stimolazione iniziale induca la morte cellulare e inneschi una disregolazione duratura della risposta immunitaria.
Le connessioni della sonda flessibile sono facilmente accessibili al microscopio a due fotoni. I parametri di stimolazione elettrica possono quindi essere regolati in tempo reale in base all'effetto osservato sul tessuto neurale e / o sulle cellule bersaglio, in modo simile a come un medico eseguirebbe procedure interventistiche mentre osserva le immagini MRI o TC del suo paziente. Un'ultima considerazione è l'importanza di un'attenta sigillatura dell'elettrodo sul cervello con supercolla e colla siliconica per prevenire la ricrescita dei tessuti.
In conclusione, il protocollo qui descritto rappresenta un modello innovativo per studiare l'effetto della terapia PEF con elettrodi polimerici organici flessibili per modelli tumorali di glioblastoma. I due modelli presentano diversi livelli di complessità tali che gli effetti cellulari, vascolari o immunitari possono essere separati per una migliore comprensione dei meccanismi d'azione. Gli elettrodi conformi e superficiali riducono il danno iatrogeno consentendo allo stesso tempo la rottura del microambiente tumorale, innescando vasocostrizione o disregolazione del calcio15 intracellulare.

Il glioblastoma multiforme (GBM) è un tumore altamente invasivo e quindi difficile da sradicare con trattamenti standard come la resezione, la radioterapia e la chemioterapia. Nonostante i trattamenti multimodali, la prognosi rimane molto sfavorevole e la maggior parte dei pazienti manifesta una progressione della malattia entro 1 anno dalla diagnosi 1,2. Recentemente, lo sviluppo di trattamenti bioelettrici ha mostrato un grande potenziale per migliorare le terapie esistenti. Queste terapie utilizzano la consegna di campi elettrici pulsati (PEF), tipicamente in una singola sessione di trattamento, per interrompere l'integrità della membrana cellulare e il microambiente dei tumori. Questa rottura della membrana cellulare, nota anche come elettroporazione, può essere reversibile o irreversibile a seconda dell'intensità del campo elettrico e del numero di impulsi. L'elettroporazione irreversibile (IRE) viene applicata come tecnica di ablazione tissutale non termica in cui gli impulsi elettrici causano danni fatali alle membrane cellulari che portano alla morte cellulare3. L'elettroporazione reversibile viene applicata nell'elettrochemioterapia (ECT), una tecnica consolidata che consiste nella somministrazione di PEF in combinazione con farmaci chemioterapici per migliorare l'assorbimento del farmaco nelle cellule tumorali4. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che l'elettroporazione del calcio è un'alternativa all'ECT ad alta efficienza per il trattamento del cancro, che è anche poco costoso e induce meno effetti collaterali5. Nonostante questi promettenti progressi, i PEF vengono generalmente applicati utilizzando elettrodi rigidi e metallici che sono noti per causare danni ai tessuti molli6. Il cervello è particolarmente sensibile a tali dispositivi invasivi in cui il disallineamento meccanico induce infiammazione e cicatrici astrogliali7.
In questo contesto, viene presentato un sistema flessibile di rilascio di PEF in combinazione con modelli 3D di tumori del glioblastoma, dalla microfabbricazione a un modello murino. Gli elettrodi conformi sono realizzati con processi standard di microfabbricazione a film sottile, compreso l'uso di materiali morbidi e biocompatibili come parylene-C, oro e PEDOT: PSS 8,9. Un design dell'elettrodo interdigitato viene utilizzato per coprire un'ampia superficie mantenendo un'adeguata trasparenza per l'imaging tra le dita dell'elettrodo10. Per il modello tumorale, sferoidi 3D di cellule di glioblastoma che esprimono un reporter di fluorescenza geneticamente codificato sono prodotti utilizzando una variazione del metodo della piastra a 96 pozzetti di sovrapposizione liquida11. Gli sferoidi vengono innestati nella membrana corioallantoica di un embrione di quaglia, risultando in un modello in ovo che è stato ampiamente utilizzato per studiare l'angiogenesi o la tossicologia dei farmaci12,13. I tumori possono essere innestati e vascolarizzati dalla vascolarizzazione dell'embrione in assenza di un sistema immunitario in questa fase dello sviluppo embrionale12. Gli elettrodi flessibili vengono quindi posizionati sopra il tumore vascolarizzato per studiare l'effetto della consegna di PEF sullo sferoide e sulla sua vascolarizzazione. Infine, questi effetti sono studiati su un organismo vivente completo, compreso il microambiente tumorale e il sistema immunitario, impiantando sferoidi ingegnerizzati nel parenchima cerebrale di modelli murini14. Gli elettrodi flessibili sono posizionati sopra il sito di inserimento e la craniotomia è sigillata con una finestra di vetro, consentendo l'imaging ripetuto a due fotoni per diverse settimane.
Questi metodi saranno utili per le persone interessate a vari settori che vanno dall'ingegneria microelettronica alle applicazioni oncologiche. Il protocollo di microfabbricazione può essere utilizzato e adattato per qualsiasi applicazione che richieda elettrodi metallici a film sottile rivestiti con PEDOT:PSS. Inoltre, i modelli biologici sviluppati per la valutazione di trattamenti elettrici antitumorali saranno di interesse generale per lo studio del differenziamento della risposta cellulare, vascolare e immunitaria ai materiali impiantati.

<table><tbody><tr><td>(3-glicidilossipropil)trimetossisilano</td><td>Sigma</td><td>440167</td><td>GOPS</td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>acido 4-dodecilbenzensolfonico</td><td>Sigma</td><td>44198</td><td>DBSA</td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Technic</td><td>530</td><td></td></tr><tr><td>Resina acrilica</td><td>Fischer </td><td>NC1455685</td><td></td>scientifico</tr><tr><td>agarosio</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>3150 EL</td><td></td></tr><tr><td>AZ 10XT</td><td>Microchemicals</td><td></td><td>Fotoresist positivo</td></tr><tr><td>AZ 826 MIF Sviluppatore</td><td>Merck</td><td>10056124960</td><td>Sviluppatore senza ioni metallici per il fotoresist negativo</td></tr><tr><td>AZ Developer</td><td>Merck</td><td>10054224960</td><td>Sviluppatore privo di ioni metallici per il fotoresist positivo</td></tr><tr><td>AZ nLof 2070</td><td>Microchemicals</td><td></td><td>Fotoresist negativo</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Axience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall Legend X1R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>fotocamera CMOS Prime 95B</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubatore a CO2 HERAcell 150i</td> Scheda DAC <td>termoscientifica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>USB 6259</td><td></td></tr><tr><td>D&eacute; co spray P&eacute; b&eacute; o</td><td>Cultura</td><td>3167860937307</td><td>Colore acrilico nero</td></tr><tr><td>Destrano Texas Red 70.000</td><td>Thermofisher</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>Die pasta adesiva "Epinal"</td><td>Hitachi</td><td>EN-4900GC</td><td>Pasta d'argento</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido Sigma</td><td></td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Macchina erogatrice</td><td>Tianhao</td><td>TH-2004C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium + GlutaMAX&trade;-I</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice per uova COUVAD'OR 160</td><td>lafermedemanon.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico</td><td>Carl Roth</td><td>6881.1</td><td></td></tr><tr><td>Uova fecondate di quaglia giapponese</td><td>Japocaille</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino fetale</td><td>VWR</td><td>S181BH</td><td></td></tr><tr><td>Flask</td><td>Greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Macroscopio a fluorescenza</td><td>Leica MZFLIII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gl261</td><td>DSMZ</td><td>ACC 802</td><td></td></tr><tr><td>Pellet d'oro - Diametro 3 mm x 6 mm th</td><td>Neyco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contatore di celle automatizzato portatile</td><td>Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td> <td>di riscaldamento ed essiccazioneMemmert</td><td>UF110</td><td></td></tr><tr><td>Esadimetririna Bromuro Sequa-brene</td><td>Sigma</td><td>S2667</td><td></td></tr><tr><td>piastra riscaldante Delta 6 HP 350</td><td>S&uuml; ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione pE-4000</td><td>CoolLed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser a femtosecondi sintonizzabile a infrarossi (Ma&iuml;-Ta&iuml;)</td><td>Spectra Physics (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sale di calcio ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>Nastro Kapton SCOTCH 92 33x19</td><td>3M</td><td></td><td>Nastro di protezione in poliimmide</td></tr><tr><td>Generatore</td><td></td><td></td><td></td>di impulsi Lab made</tr><tr><td>Labcoter 2 Sistema di deposizione di parylene PDS 2010</td><td>SCS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293 Linea cellulare T</td><td>Takara Bio</td><td>63218</td><td>Linea cellulare derivata da HEK 293T ottimizzata per la produzione di lentivirus</td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus</td><td>Takara Bio</td><td>631280</td><td>Test quantitativo del titolo lentivirale</td></tr><tr><td>Allineatore di maschere MJB4</td><td>S&uuml; ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-90 Soluzione detergente concentrata</td><td>Prodotti internazionali</td><td>M9050-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio 76 x 52 x 1 mm</td><td>Marienfeld</td><td>1100420</td><td></td></tr><tr><td>Aghi 30G</td><td>BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>PalmSens4 potenziostato</td><td>PalmSens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>parylene-c : dicloro-p-ciclofano</td><td>SCS</td><td>300073</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di elaborazione PCB</td><td>Mega Electronics</td><td>PA104</td><td></td></tr><tr><td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicillina / streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>pGP-CMV-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>40755</td><td>plasmide</td></tr><tr><td>Fosfato Soluzione salina</td> <td>tamponeThermofisher</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di trattamento al plasma PE-100</td><td>Plasma Etch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasmaLab 80 Incisore ionico reattivo</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maschera in plastica</td><td>Selba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pesa in plastica 64 x 51 x 19 mm</td><td>VWR</td><td>10770-454</td><td></td></tr><tr><td>Poli-dimetilsilossano: SYLGARD 184 Kit elastomero siliconico</td><td>Dow chemicals</td><td></td><td></td>1673921</tr><tr><td>Film di rame poliimmide 60 &micro; m (Kapton)</td><td>Goodfellow</td><td>IM301522</td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Technic</td><td>574</td><td></td></tr><tr><td>Protolaser S</td><td>LPKF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Gibco</td><td>A11103</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura rotondo diametro 5 mm</td><td>Fischer scientific</td><td>50-949-439</td><td></td></tr><tr><td>Sensori a scettro - 60 &; m</td><td>Millipore</td><td>PHCC60050</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo siliconico Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments spin coater</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>S&uuml; ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Laurell</td><td>WS-650</td><td></td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Deposito</td><td></td><td></td>ufficio</tr><tr><td>senza tetracicline f&oelig; Siero bovino</td><td>Takara Bio</td><td>631105</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore termico Auto 500</td><td>Boc Edwards</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni</td><td>Zeiss LSM 7MP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87-MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>Cellule di glioblastoma umano</td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex VTX-3000L</td><td>LMS</td><td>VTX100323410</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Xfect a colpi singoli</td><td>Takara Bio</td><td>631447</td><td>Reagente per trasfezione</td></tr></tbody></table>

dispositivi elettronici organici flessibili per la terapia del campo elettrico pulsato del glioblastoma

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Il glioblastoma è difficile da debellare con le terapie oncologiche standard a causa del suo alto grado di invasività. I trattamenti bioelettrici basati su campi elettrici pulsati (PEF) sono promettenti per il miglioramento dell'efficienza del trattamento. Tuttavia, si basano su elettrodi rigidi che causano danni acuti e cronici, specialmente nei tessuti molli come il cervello. In questo lavoro, è stata utilizzata un'elettronica flessibile per fornire PEF ai tumori e la risposta biologica è stata valutata con microscopia fluorescente. Gli elettrodi d'oro interdigitati su un substrato sottile e trasparente di parylene-C sono stati rivestiti con il polimero conduttore PEDOT: PSS, risultando in un dispositivo conformabile e biocompatibile. Gli effetti delle PEF sui tumori e sul loro microambiente sono stati esaminati utilizzando vari modelli biologici. In primo luogo, monostrati di cellule di glioblastoma sono stati coltivati sopra gli elettrodi per studiare i fenomeni in vitro. Come fase intermedia, è stato sviluppato un modello in ovo in cui sferoidi tumorali ingegnerizzati sono stati innestati nella membrana embrionale di una quaglia. A causa dell'assenza di un sistema immunitario, questo ha portato a tumori altamente vascolarizzati. In questa fase iniziale dello sviluppo, gli embrioni non hanno un sistema immunitario e i tumori non sono riconosciuti come corpi estranei. Pertanto, possono svilupparsi rapidamente mentre sviluppano i propri vasi dal sistema vascolare embrionale esistente, che rappresenta un prezioso modello 3D del cancro. Infine, la somministrazione di elettrodi flessibili di PEF è stata valutata in un organismo completo con un sistema immunitario funzionale, utilizzando un modello murino singenico, ortoinnesto (intracranico). Gli sferoidi tumorali sono stati innestati nel cervello di topi transgenici multi-fluorescenti prima dell'impianto di dispositivi di elettrodi organici flessibili. Una finestra cranica sigillata ha permesso l'imaging multifotonico del tumore e del suo microambiente durante il trattamento con PEF per un periodo di diverse settimane.

Questo protocollo consente l'applicazione a due modelli di glioblastoma in cui è integrato un sistema flessibile di erogazione della PEF. Seguendo le fasi di microfabbricazione e confezionamento, gli elettrodi flessibili sono caratterizzati in soluzione salina mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) per valutare e convalidare le loro prestazioni. Gli elettrodi rivestiti PEDOT:PSS mostrano le tipiche regioni dominate capacitive e resistive separate da una frequenza di taglio, mentre gli elettrodi non rivestiti mostrano solo un comportamento capacitivo (Figura 2).
Una variante del metodo della piastra a 96 pozzetti di sovrapposizione liquida viene utilizzata per far crescere tumori 3D fatti di cellule di glioblastoma trasfettate che esprimono stabilmente un reporter di calcio intracellulare fluorescente. La crescita degli sferoidi può essere osservata con un microscopio a campo luminoso (Figura 3; ED 0). Sono necessari almeno 2 o 3 giorni per ottenere sferoidi sferici e densi, a seconda della linea cellulare e del numero di cellule seminate.
Nel modello in ovo , gli sferoidi sono innestati nella membrana corioallantoica di un embrione di quaglia (Figura 3; ED 6). Il successo dell'innesto può essere valutato mediante microscopia a fluorescenza pochi giorni dopo, poiché le cellule viventi hanno calcio intracellulare e sono quindi fluorescenti (Figura 3; ED 9). La vascolarizzazione del tumore può essere osservata al microscopio a fluorescenza iniettando un colorante fluorescente nei vasi sanguigni (Figura 3; ED9). Tuttavia, potrebbe non essere sempre possibile visualizzare i vasi sanguigni all'interno del tumore poiché lo sferoide è molto denso. Gli elettrodi interdigitati flessibili sono posizionati sopra il tumore vascolarizzato (Figura 3; ED 9) e collegato ad un generatore di impulsi. La sonda deve essere posizionata delicatamente per evitare il sanguinamento dell'embrione; Altrimenti, il colorante fluorescente può diffondersi, il che ostacola qualsiasi osservazione mediante imaging. La corretta erogazione dell'impulso all'ambiente biologico può essere verificata misurando la corrente che attraversa il circuito. L'imaging di questi in modelli ovo consente il monitoraggio in tempo reale dell'effetto dei PEF sul calcio intracellulare in un tumore del glioblastoma 3D, nonché della vasocostrizione indotta sulla vascolarizzazione del tumore, evitando qualsiasi influenza di altri tipi di cellule incluso il sistema immunitario15.
Lo studio dell'effetto della PEF sul glioblastoma può essere eseguito anche in un modello più completo e predittivo. Infatti, il modello in vivo descritto sopra14 consiste nell'innesto di un tumore di glioblastoma 3D nel parenchima cerebrale di un topo (Figura 4). Il sito di iniezione del tumore è tappato da una hemi-bead reticolato in gel di destrano, per ricapitolare i vincoli biofisici fisiologici durante la crescita del tumore. Sebbene descritto nel riferimento14, vale la pena sottolineare nuovamente che è di fondamentale importanza che l'emiperlina destrano sia esattamente superincollata alla dura madre; Altrimenti, il tumore può sfuggire attraverso la dura aperta e coprire completamente il cervello, rendendo impossibile l'imaging. Per qualsiasi imaging cronico, la crescita tissutale che avviene quando la finestra cranica guarisce rappresenta una seria barriera, poiché il nuovo tessuto non è trasparente e rende le immagini nebbiose o non utilizzabili. Pertanto, dopo aver inserito e incollato l'emi-bead, le pareti laterali della finestra cranica aperta devono essere sigillate con un sottile strato di supercolla meticolosamente posizionato intorno alla parete della cavità, senza lasciare che la supercolla scivoli o fluisca sulla dura. Quando la sonda flessibile viene posizionata sopra il sito di iniezione del tumore, nessuna bolla può rimanere sotto la sonda, per due motivi. In primo luogo, l'imaging non può procedere quando sono presenti bolle. In secondo luogo, le bolle fungono da isolanti, modificando così le proprietà di stimolazione elettrica. Dopo aver preso le precauzioni sopra descritte, la craniotomia viene sigillata con una finestra di vetro cementata al cranio per consentire l'imaging cronico per settimane. Poiché il tumore è costituito da cellule che esprimono GCaMP o DsRed, l'iniezione può essere confermata con un microscopio a fluorescenza. L'impedenza elettrochimica degli elettrodi deve essere misurata per convalidare le prestazioni dopo l'impianto. Rispetto all'impedenza in soluzione salina, si prevede un aumento dell'impedenza in vivo a frequenze superiori a 100 Hz a causa della presenza di un ambiente biologico (Figura 5). Il parenchima neurale vascolarizzato e l'infiltrazione tumorale possono essere osservati e caratterizzati attraverso il substrato trasparente per settimane mediante microscopia a due fotoni (Figura 6). L'uso di animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule di interesse (cellule immunitarie e neuroni) può, ad esempio, consentire la dimostrazione del processo infiammatorio minimo indotto dalla sola impiantazione di elettrodi (Figura 6A) o mostrare la presenza di microglia e monociti 26 giorni dopo l'impianto di un elettrodo stimolato dalla PEF impiantato sopra un tumore GBM in crescita (Figura 6B1 ). In quest'ultimo caso, sia le cellule derivate dai monociti periferici che le cellule microgliali residenti nel cervello sono state trovate intorno e all'interno del tumore (Figura 6B2). Il giorno della consegna della PEF, i pad di contatto degli elettrodi flessibili possono essere collegati al generatore di impulsi, direttamente sotto il microscopio a due fotoni. Nel complesso, questo modello può essere utilizzato per studiare l'effetto dei trattamenti bioelettrici nel tempo utilizzando vari tipi di cellule coinvolte nello sviluppo del tumore cerebrale, fino a una profondità di circa 500 μm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> Figura 1: Microfabbricazione di elettrodi flessibili. (A) Pattern di elettrodi d'oro e substrato di parylene C. (B) Apertura schematica. (C) PEDOT:Rivestimento PSS. (D) Connessioni e imballaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> Figura 2: Spettroscopia di impedenza elettrochimica di elettrodi flessibili in oro e elettrodi freddi rivestiti PEDOT:PSS in una soluzione salina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> Figura 3: Il modello in ovo del glioblastoma. ED 0: Sferoide osservato con un microscopio a campo chiaro. ED 3: Coltura senza guscio di un embrione di quaglia 3 giorni dopo l'apertura. ED 6: Tumore impiantato nella CAM osservato con un microscopio a campo chiaro. ED 9: Dispositivo flessibile posto sul tumore vascolarizzato (tumore in verde e vasi sanguigni in rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> Figura 4: Applicazione in vivo. (A) Schema per esperimenti in vivo. (B) Posizionamento della sonda prima dell'applicazione del vetro di copertura e della resina acrilica. (C) Impianto della sonda completato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> Figura 5: Spettroscopia di impedenza elettrochimica di elettrodi d'oro flessibili in una soluzione salina rispetto a una sonda impiantata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> Figura 6: Imaging multispettrale intravitale a due fotoni attraverso elettrodi . (A) Immagine piastrellata della superficie cerebrale sana in un topo multifluorescente di controllo AMU-Neuroinflam 3 giorni dopo l'impianto dell'elettrodo. Il ciano mostra l'arborizzazione dendritica dei neuroni piramidali di livello 5, il verde mostra granulociti e monociti reclutati e il giallo mostra microglia attivata e cellule dendritiche. Il rosa mostra la diffusione infrarossa dovuta all'accumulo di calore. (B1) Immagine simile a quella di A, ma 26 giorni dopo l'impianto sferoidale tumorale a 200 μm di profondità all'interno della corteccia immediatamente seguita dall'impianto dell'elettrodo. Si noti l'accumulo di cellule immunitarie verdi e gialle. (B2) Immagine simile a quella di B1 ma 100 μm sotto la superficie degli elettrodi. Si noti la presenza di arborizzazione dendritica neuronale blu nella periferia della massa tumorale rossa stessa infiltrata da microglia gialle e cellule dendritiche. Il blu intenso mostra un secondo segnale armonico dal collagene peritumorale. (B3) Vista ingrandita di B2 che mostra la presenza di somi interneuronali (indicati da frecce) in prossimità del tumore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo lavoro descrive lo sviluppo di elettrodi interdigitati flessibili per l'implementazione in modelli 3D di tumore cerebrale, vale a dire, coltura in vitro , modello ovo e modello murino in vivo . Il metodo proposto può essere utilizzato per valutare gli effetti dei campi elettrici pulsati sui tumori a diversi livelli di complessità.

Dispositivi elettronici organici flessibili per la terapia del campo elettrico pulsato del glioblastoma

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

Questo protocollo consente l'erogazione di campi elettrici a impulsi da parte di un'elettronica flessibile per studiare i loro effetti terapeutici sul glioblastoma. Lo facciamo visualizzando il microambiente tumorale in vivo con l'imaging. La bioelettronica si sta integrando in questo protocollo utilizzando diversi modelli di complessità crescente al fine di studiare l'effetto dei campi pulsanti sul cancro.Le tecniche di microfabbricazione presentate in questo lavoro possono anche essere testate come mezzo per trattare altri tipi di tumori, compresi gli xenotrapianti derivati dal paziente. Questo si muove verso l'idea di medicina di precisione su misura per ogni singolo paziente. Queste sonde sono realizzate con tecniche di microfabbricazione standard, quindi la produzione è semplice e chiunque abbia una camera bianca può realizzarle.Per la modellazione di elettrodi d'oro, depositare uno strato di tre micrometri di parylene C con un sistema di deposizione di parylene posizionando i vetrini puliti nella camera di deposizione. Pesare sei grammi di parylene C in una barca di alluminio, metterlo nella fornace, evacuare la macchina e iniziare la deposizione con i parametri descritti nel manoscritto. Quando la deposizione è terminata e la temperatura del vaporizzatore è inferiore a 40 gradi Celsius, spegnere il refrigeratore, il vaporizzatore, il forno.Sfiatare la macchina e raccogliere i campioni. Spin coat i campioni trattati al plasma con un fotoresist negativo a 1.000 volte G per 40 secondi. Esporre il fotoresist attraverso una maschera che presenta il design dell'elettrodo interdigitato.Quindi immergere i campioni in uno sviluppatore privo di ioni metallici per tre minuti per rimuovere il fotoresist non esposto. Per depositare uno strato di adesione di 20 nanometri di cromo e uno strato di 300 nanometri di oro con un evaporatore termico, sfiatare la macchina dell'evaporatore e ritagliare i campioni sulla piastra rotonda superiore con viti metalliche. Riempire i crogioli dedicati rispettivamente con cromo e oro.Sigillare ed evacuare la macchina e avviare la rotazione del portacampioni. Selezionare il crogiolo contenente cromo e aumentare lentamente la corrente fino a quando la velocità di deposizione raggiunge 0,2 angstrom al secondo. Aprire l'otturatore, attendere fino alla deposizione di 20 nanometri di cromo, chiudere l'otturatore e scendere lentamente la corrente fino a zero milliampere.Selezionare il crogiolo contenente oro e aumentare lentamente la corrente fino a raggiungere una velocità di deposizione di 0,2 angstrom al secondo. Aprire l'otturatore per far evaporare l'oro, attendere fino alla deposizione di 10 nanometri di oro, quindi aumentare la velocità di deposizione a 1,5 angstrom al secondo fino a depositare circa 300 nanometri. Chiudere l'otturatore e ridurre lentamente la corrente fino a zero milliampere.Immergere i campioni in un becher contenente acetone. Quindi sciacquare i campioni con isopropanolo e asciugarli con un fucile ad aria compressa. Spin coat quattro strati di soluzione PEDOT:PSS a 150 volte G per 35 secondi.Rimuovere lo strato sacrificale di parylene C immergendo i campioni in acqua. Immergere i campioni in acqua deionizzata per 30 minuti per rimuovere il sapone rimanente e i composti a basso peso molecolare nel film PEDOT:PSS e staccare i campioni dal substrato di vetro. Aggiungere 75 microlitri di soluzione fusa all'1% di agarosio in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con attenzione e lasciare solidificare per 15 minuti a temperatura ambiente.Staccare le cellule di glioblastoma trasdotte ottenute durante la generazione della linea cellulare stabile. Aggiungere 10.000 cellule di glioblastoma per pozzetto e portare il volume totale a 150 microlitri per pozzetto utilizzando DMEM contenente un grammo per litro di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, siero bovino fetale al 10%, 100 unità per microlitri di penicillina e 100 microgrammi per microlitri di streptomicina. Sostituire metà del terreno con mezzi freschi ogni due giorni fino a ulteriori esperimenti, mantenendo la punta della pipetta nella parte superiore del pozzetto per evitare danni all'agarosio o allo sferoide stesso.Metti le uova fecondate della quaglia giapponese, Coturnix japonica, in un'incubatrice su vassoi con un rotatore automatico che gira le uova ogni due ore. Questo giorno è considerato embrionale giorno zero. Il terzo giorno embrionale, aprire delicatamente le uova usando una pinzetta con punte sottili pre-lavate con etanolo al 70%.Versare l'embrione in un contenitore di pesatura di plastica, coprirlo con un altro battello di pesatura e metterlo in un'incubatrice umidificata standard a 37 gradi Celsius per tre giorni. Il sesto giorno embrionale, fare una piccola incisione nella membrana corioallantoica con un ago di calibro 23. Posizionare uno sferoide di sette giorni sull'incisione usando una pipetta e riportare l'embrione all'incubatrice per tre giorni fino a ulteriori esperimenti.Posizionare una goccia di DPBS per coprire la craniotomia. Posizionare l'elettrodo flessibile sulla goccia di DPBS e posizionare delicatamente la parte posteriore della sonda con i cuscinetti di contatto sul dorso del mouse. Assorbire la goccia DPBS con un piccolo pezzo di carta fino a quando la sonda può distendersi sulla dura e seguire la curvatura del cervello, assicurandosi che il piccolo strato di soluzione salina rimanga sotto gli elettrodi per fungere da barriera contro lo spillover della colla.Posizionare una piccola goccia di adesivo siliconico sulla sonda e coprirla con un vetro di copertura rotondo da cinque millimetri. Spingere il vetro di copertura verso il basso fino a quando il silicone è distribuito uniformemente e la distanza tra il vetro di copertura e la sonda è minima. Quindi attendere 30 secondi affinché il silicone si solidifichi.Per fissare il vetro di copertura, applicare rapidamente la supercolla sui lati e spingerla verso il basso fino a quando la colla diventa solida. Applicare la super colla sul collo della sonda usando uno stuzzicadenti facendo attenzione che la super colla venga disegnata sotto il collo per fornire un supporto stabile. Coprire il cranio con cemento dentale per costruire un cappuccio cronico e prestare particolare attenzione a coprire solo i bordi del vetro di copertura.Sollevare la parte posteriore della sonda e applicare il cemento sotto il collo della sonda. Resto della sonda sul cemento prima che si polimerizzi. Spingere delicatamente verso il basso il collo della sonda per posizionare la sua superficie allo stesso livello del vetro di copertura e non nel modo dell'obiettivo del microscopio durante l'esperimento.Coprire la parte superiore del collo della sonda con non più di 1,5 millimetri di strato di cemento dentale per ottenere una presa salda sulla sonda. Costruire un pozzo di cemento che presenti una cresta di 1,5 millimetri da uno a due millimetri attorno al vetro di copertura per creare un bacino per il fluido di immersione per l'imaging a due fotoni. Dopo che il cemento si è indurito, somministrare l'analgesia postchirurgica e mantenere l'animale caldo fino al recupero avvolgendolo in un tovagliolo di carta e posizionandolo vicino a una lampadina a infrarossi.Gli elettrodi rivestiti PEDOT:PSS mostrano le tipiche regioni dominate capacitive e resistive separate da una frequenza di taglio, mentre gli elettrodi non rivestiti mostrano solo un comportamento capacitivo. La crescita degli sferoidi osservata con un microscopio a campo chiaro ha rivelato che sono necessari almeno due o tre giorni per ottenere sferoidi sferici e densi a seconda della linea cellulare e del numero di cellule seminate. Nel modello in ovo, l'innesto di sferoidi nella membrana corioallantoica può essere valutato mediante microscopia a fluorescenza poiché le cellule viventi hanno calcio intracellulare e la vascolarizzazione del tumore può essere valutata iniettando un colorante fluorescente nei vasi sanguigni.Rispetto all'impedenza in soluzione salina, si prevede un aumento dell'impedenza in vivo a frequenze superiori a 100 hertz a causa della presenza di un ambiente biologico. Il parenchima neurale vascolarizzato e l'infiltrazione tumorale possono essere osservati e caratterizzati attraverso il substrato trasparente per settimane mediante microscopia a due fotoni. L'uso di animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti nelle cellule di interesse può dimostrare il minimo processo infiammatorio indotto dalla sola impiantazione di elettrodi.Può mostrare la presenza di microglia e monociti 26 giorni dopo l'impianto campi elettrici pulsati stimolati elettrodo. Sia le cellule microgliali derivate dai monociti periferici che quelle risonanti cerebrali sono state trovate intorno e all'interno del tumore. Il punto critico per il successo nella procedura di impianto è garantire la tenuta e la planarità della finestra cranica e ottimizzare la qualità del contatto con la sonda.Oltre all'imaging intravitale, cosa potrebbe considerare la combinazione del nostro protocollo con altre misure e tecniche come i campionamenti e le misure di analisi del sangue per le citochine, lo stato immunitario mediante citometria a flusso o persino l'analisi comportamentale. Questo lavoro apre la strada all'uso di dispositivi impiantabili flessibili per il cancro e apre nuove prospettive per l'uso della medicina bioelettronica per questa malattia cronica.

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Fonte: Lefevre, M. C., et al., Dispositivi elettronici organici flessibili per la terapia del campo elettrico pulsato del glioblastoma. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra l'impianto di una sonda flessibile e biocompatibile in un modello murino di glioblastoma per fornire una terapia mirata con campo elettrico pulsato per applicazioni neuroterapeutiche.

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