Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali
16 marzo 2022
In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.
Questo protocollo offre un metodo di somministrazione della terapia genica a più tessuti oculari in modo sicuro, facile ed efficace. È anche adattabile per iniezioni intrastromali e sottoretiniche in piccoli animali. L'uso della via di iniezione subcongiuntivale è minimamente invasivo.
Pone meno rischi e rappresenta una grande promessa per la somministrazione AV per il trattamento di più malattie oculari. Con oltre 1 miliardo di persone in tutto il mondo che soffrono di disabilità visive, l'utilizzo di un metodo sicuro e semplice per la somministrazione di farmaci offre un'ampia applicabilità per il trattamento di molte diverse cause di cecità. I metodi di consegna genica descritti in questo protocollo sono di particolare interesse per coloro che stanno sviluppando potenziali strategie di intervento e praticando oftalmologi, che alla fine consegneranno questi farmaci ai pazienti.
La sfida più grande per qualcuno che sta eseguendo questo protocollo per la prima volta è probabilmente l'inserimento dell'ago nello spazio congiuntivale concettuale. Per iniziare, assemblare il sistema di iniezione posizionando uno stereomicroscopio e una pompa a siringa in un armadio di biosicurezza. Quindi, tagliare il tubo di polietilene ad una lunghezza di circa 50 centimetri.
Inserire l'estremità di un ago calibro 36 in un'estremità del tubo. Quindi riempire una siringa monouso da 3 millilitri con acqua sterile e inserirla nel lato del tubo opposto all'ago. Lavare il tubo tre volte, alternando acqua sterile e alcool al 70% per disinfettare il tubo e assicurarsi che non vi siano perdite, intasamenti o danni in tutto il tubo.
Utilizzando la siringa monouso da 3 millilitri, riempire il tubo con acqua sterile e lasciare il tubo attaccato alla siringa monouso. Quindi posizionare un pezzo di paraschiuma sulla superficie dell'armadio di bio-sicurezza e aggiungere una pozza di acqua sterile ad esso. Immergere la porzione del tubo collegato all'ago nella piscina di acqua sterile.
Quindi, estrarre la siringa monouso dall'apertura del tubo per evitare che l'aria entri nel sistema di tubi dopo la rimozione della siringa. Quindi riempire una siringa Hamilton da 10 microlitri con acqua sterile. Quindi, collegare l'ago della siringa di Hamilton all'estremità aperta del tubo immergendo la punta dell'ago della siringa di Hamilton nella pozza di acqua sterile sul film parapara.
Tenere premuto il pulsante di inversione rapida sullo schermo della pompa per spostare i blocchi di spinta alla lunghezza approssimativa della siringa. Quindi, svitare le manopole di serraggio della staffa per allentare le staffe di fissaggio sullo spintore e sui blocchi del supporto della siringa. Successivamente, caricare la siringa Hamilton sul blocco portasiringa e fissare la siringa seguendo le istruzioni del produttore.
Per regolare i parametri nella schermata di impostazione della pompa, premere il pulsante "Forza" e impostare il livello di forza su 30%Quindi accettare le modifiche per tornare alla schermata di impostazione. Premere il pulsante "Quick Start", selezionare Metodo, quindi selezionare l'opzione "Solo infusione". Per l'opzione siringa, selezionare Hamilton 1700, quindi fare clic su "Vetro" e selezionare 10 microlitri.
Successivamente, selezionare la velocità di infusione e il volume di iniezione. Espellere l'acqua dalla siringa di Hamilton lasciando il tubo e l'ago per iniezione pieni d'acqua premendo il pulsante "Infuse". Quindi, prelevare il virus inserendo l'ago per iniezione in un'aliquota dello stock virale.
Quindi tirare leggermente indietro la siringa di Hamilton premendo il pulsante inverso per introdurre una piccola bolla d'aria nel tubo. Dopo aver anestetizzato l'animale, afferra la congiuntiva con una pinza. Quindi inserire l'ago nella congiuntiva fino a quando la smussatura è interamente coperta dalla membrana congiuntivale e appoggiare l'ago contro il globo.
Contemporaneamente, iniziare l'iniezione premendo il pulsante "Start" utilizzando l'interruttore a pedale. Per esaminare la distribuzione del vettore AAV, i tessuti oculari e circostanti sono stati colorati con ematossilina ed eosina. Le sezioni sagittali rappresentative hanno dimostrato che la dispersione dell'inchiostro indiano si è verificata principalmente adiacente ai muscoli extraoculari nella superficie esterna della sclera nei tessuti connettivi sciolti perioculari.
Per confermare la trasduzione dell'AAV 8 auto-complementare a otto settimane dopo l'iniezione, l'abbondanza di proteine a fluorescenza verde nelle sezioni trasversali è stata esaminata mediante colorazione con immunofluorescenza. I risultati hanno rivelato che i vettori AAV 8 trasducevano efficacemente i muscoli perioculari posteriori all'occhio e alla cornea. Per analizzare la biodistribuzione del vettore, i numeri di copie del genoma vettoriale e i compartimenti oculari distinti in altri organi, tra cui fegato e cuore, sono stati esaminati mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa utilizzando primer e sonde specifici per il transgene.
L'espressione del transgene è stata confermata dalla reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa, che ha suggerito che l'iniezione subcongiuntivale di AAV 8 provoca l'espressione di transgeni nella palpebra, nella congiuntiva, nella cornea e nel nervo ottico. La bolla d'aria fungerà da barriera tra l'acqua nel tubo e il farmaco terapeutico. Questa tecnica consente ad altri ricercatori di esplorare l'uso della via di somministrazione subcongiuntivale sia per le soluzioni oftalmiche che per le terapie geniche oculari per più malattie.
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Panoramica
Questo protocollo offre un metodo di somministrazione della terapia genica a diversi tessuti oculari in modo sicuro, semplice ed efficace. La via di iniezione sottocute è poco invasiva e comporta minori rischi, mostrando un notevole potenziale per la somministrazione del virus adeno-associato (AV) nel trattamento di numerose malattie oculari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Terapia genica
- Metodi di somministrazione oculare
- Tecniche mini-invasive
Sfondo
- Oltre 1 miliardo di persone in tutto il mondo soffre di deficit visivo.
- Metodi sicuri ed efficaci di somministrazione di farmaci sono fondamentali per il trattamento della cecità.
- Il protocollo è adattabile per iniezioni intrastromali e subretiniche in animali di piccola taglia.
- Lo sviluppo di strategie di intervento per le malattie oculari è di grande interesse.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo valido di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari.
- Fornire un'opzione minimamente invasiva per la terapia genica.
- Migliorare la sicurezza e l'efficacia della somministrazione di farmaci oculari.
Metodi Utilizzati
- Iniezione sottocnjuntivale mediante una pompa per siringa a infusione/prelievo.
- Utilizzo di una siringa ermetica rimovibile abbinata a aghi per microiniezione.
- Adattamento del sistema di iniezione per diverse vie di somministrazione intraoculari.
- Valutazione dei metodi di somministrazione in modelli animali di piccola taglia.
Risultati principali
- Il metodo di iniezione sottocongiuntivale è efficace per la terapia genica oculare.
- La minima invasività riduce i rischi associati alle iniezioni oculari.
- Il metodo mostra un'ampia applicabilità nel trattamento di numerose malattie oculari.
- Potenziale impatto significativo sul trattamento del deficit visivo.
Conclusioni
- L'iniezione sottocnjuntivale è un metodo promettente per la somministrazione di farmaci a livello oculare.
- Offre un approccio sicuro ed efficace per la terapia genica.
- Il protocollo può aiutare gli oftalmologi a somministrare trattamenti ai pazienti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'amministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati (AAV) in modelli animali di piccola taglia affronta la sfida di un rilascio genico localizzato e sicuro per le malattie oculari. Questo metodo minimamente invasivo consente un indirizzamento preciso dei tessuti oculari, sostenendo la previsione nei primi stadi della ricerca sulle terapie geniche. La sua adattabilità e riproducibilità lo posizionano come strumento prezioso per la selezione di portafoglio e la continuità traslazionale nello sviluppo di farmaci oftalmici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi relative al trasferimento genico nei tessuti oculari con minima invasività.
- Consente la riduzione dei rischi biologici permettendo una trasduzione mirata e l'analisi dell'espressione specifica per tessuto.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione del vettore e della via di somministrazione per programmi di terapia genica oculare.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara modelli validati di piccoli animali per la valutazione successiva dell'espressione genica e del targeting tissutale.
- Standardizza i parametri di iniezione per garantire riproducibilità e valutazione quantitativa della distribuzione del vettore.
- Consente un confronto affidabile tra sierotipi di AAV e vie di somministrazione per la valutazione preliminare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli oculari pertinenti alle malattie per valutare l'espressione di biomarcatori traducibili dopo la somministrazione.
- Permette la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica confermando l'espressione del transgene specifica per il tessuto.
- Fornisce dati aggiustati per il rischio per supportare le decisioni di avanzamento nei percorsi terapeutici genici oculari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica delle ipotesi, l'ottimizzazione dei vettori e la validazione quantitativa in modelli oculari di piccoli animali.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico mediante il trasferimento mirato di geni e l'analisi dell'espressione genica.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per confrontare le prestazioni dei vettori e le diverse vie di somministrazione.
- Analisi: Offre misurazioni basate su immunofluorescenza e qPCR per valutare l'espressione del transgene e la biodistribuzione in tessuti specifici.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla validazione preclinica confermando il rilascio e l'espressione in tessuti rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e adattabile per diversi studi di terapia genica oftalmica e di somministrazione di farmaci.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulla terapia genica oculare.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei protocolli di somministrazione oculare.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati solidi in fase precoce.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione dei candidati alla terapia genica oculare con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in procedure oculari su piccoli animali e tecniche di microiniezione.
- Necessita dell'accesso a pompe siringa programmabili, microscopi operatori e strumenti analitici per la validazione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di iniezione e i saggi di validazione.
- È adattabile a diverse vie di somministrazione intraoculare e soluzioni oftalmiche.
- I limiti pratici includono i requisiti relativi all'abilità tecnica e le considerazioni anatomiche specifiche del modello.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:26
Preparation and Administration of Adeno-Associated Virus via Subconjunctival Injection
4:21
Results: Analysis of AAV Vector Administration, Biodistribution and Transgene Expression into the Subconjunctival Space
5:41
Conclusion
