Localizzazione del fattore a cella singola sulla cromatina utilizzando la scissione di input ultra-bassa sotto i bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi

CUT&RUN è una potente tecnica per determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina, e qui descriviamo una versione a singola cellula di questa tecnica in un formato manuale a 96 pozzetti. La maggior parte delle tecniche di localizzazione delle proteine, come ChIP-seq, richiedono un elevato input cellulare e richiedono circa tre giorni per essere completate. CUT&RUN, a causa del segnale elevato e dello sfondo basso, è stato ottimizzato per applicazioni a bassa cella e a cella singola e può essere completato in un solo giorno.

Immaginiamo che questa tecnica possa essere applicata a quasi tutti i campioni biologici e possa essere particolarmente potente per determinare la localizzazione dei fattori in campioni rari e a bassa abbondanza, come preziosi campioni di pazienti. Prima di eseguire qualsiasi esperimento su una singola cellula, testare l'anticorpo e la tecnica su un numero elevato di cellule non preziose. Il principale limite di questo esperimento è la dipendenza da un anticorpo robusto.

A dimostrare la procedura è Santana Lardo, un'esperta specialista di ricerca del mio laboratorio. Dopo aver selezionato le singole cellule e legando i nuclei alle perline, posizionare la piastra a 96 pozzetti su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che le perline si leghino per un minimo di cinque minuti. Quindi, rimuovere e scartare il surnatante.

Aggiungere 100 microlitri di tampone di blocco alle perle legate al nucleo, mescolare con un leggero pipettaggio e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di cinque minuti. Quindi, rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.

Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio per reazione con un pipettaggio delicato. Riposizionare la piastra sul rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Risospese le perline in 25 microlitri di tampone di lavaggio per reazione con un pipettaggio delicato.

Creare una miscela principale di anticorpi primari aliquotando 25 microlitri di tampone di lavaggio per reazione e quindi aggiungere 0,5 microlitri di anticorpi per reazione. Aggiungere 25,5 microlitri della miscela tampone di lavaggio degli anticorpi, seguiti da un delicato pipettaggio a ciascun campione trattato con un anticorpo mirato alla proteina di interesse. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, riposizionare i campioni sul rack magnetico a 96 pozzetti. Una volta che il surnatante è chiaro, rimuoverlo e scartarlo senza disturbare le perline. Dopo aver rimosso la piastra dal rack magnetico, lavare le perline con 100 microlitri di tampone di lavaggio e risospesciare mediante pipettaggio.

Dopo aver riposto la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e aver scartato il surnatante come dimostrato in precedenza, risospese ogni campione in 25 microlitri di tampone di lavaggio. Crea una miscela master di proteina A MNasi aggiungendo 25 microlitri di tampone di lavaggio e una quantità ottimizzata di proteina A MNasi per reazione. Aggiungere 25 microlitri di miscela principale di MNasi di proteina A a ciascun campione, compresi i campioni di controllo.

Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti. Lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di cinque minuti e poi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.

Dopo aver rimosso la piastra dal rack magnetico, lavare le perline con 100 microlitri di tampone di lavaggio e risospesciare delicatamente con un tubolare delicato. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza. Quindi, rimuovere i campioni dal rack magnetico e risospesciare le perline in 50 microlitri di tampone di lavaggio mediante un delicato pipettaggio.

Equilibrare i campioni a zero gradi Celsius in una miscela di acqua ghiacciata per cinque minuti e quindi rimuovere i campioni dal bagno di acqua ghiacciata. Aggiungere un microlitro di cloruro di calcio da 100 millimolari usando una pipetta multicanale. Mescolare bene da tre a cinque volte con un pipettaggio delicato utilizzando una pipetta multicanale di grande volume e quindi riportare i campioni a zero gradi Celsius.

Avviare un timer di 10 minuti non appena la piastra è tornata nel bagno di acqua ghiacciata. Arrestare la reazione pipettando 50 microlitri di una soluzione contenente il doppio della concentrazione di RSTOP+ e tamponare in ciascun pozzetto nello stesso ordine in cui è stato aggiunto il cloruro di calcio. Incubare i campioni per 20 minuti a 37 gradi Celsius.

Ruotare la piastra a 16.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti. Lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di cinque minuti.

Quindi, trasferire i supernatanti in un piatto fresco da 96 pozzetti e scartare le perline. Per l'estrazione del DNA, aggiungere un microlitro di 10% SDS e 0,83 microlitri di 20 milligrammi per millilitro proteinasi K a ciascun campione e mescolare i campioni mediante pipettaggio delicato. Incubare i campioni per 10 minuti a 70 gradi Celsius.

Riportare la piastra a temperatura ambiente. Aggiungere 46,6 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 90 microlitri da 50% PEG4000 e mescolare delicatamente con pipettaggio. Aggiungere 33 microlitri di perle di polistirene magnetite a ciascun campione e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che il surnatante si schiarisca per circa cinque minuti. Quindi, scartare con attenzione il surnatante senza disturbare le perline. Risciacquare due volte con 150 microlitri di etanolo all'80% senza disturbare le perline.

Ruotare brevemente la piastra a 1000 volte G per 30 secondi. Riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e rimuovere tutto l'etanolo residuo senza disturbare le perline. Asciugare all'aria i campioni per circa due-cinque minuti.

Sospendere le perline in 37,5 microlitri di 10 millimolari TRIS cloridrato di pH 8 e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Riposizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che le perline si leghino per cinque minuti. Trasferire 36,5 microlitri del surnatante in una piastra a 96 pozzetti compatibile con termociclatore fresco ed eliminare le perline.

Dopo aver eseguito la valutazione della qualità cellulare, sono stati esaminati l'aspetto e la percentuale delle cellule, dimostrando che le cellule staminali embrionali di bassa qualità non dovrebbero essere utilizzate. Lo smistamento a cella singola è stato eseguito utilizzando la colorazione Hoechst 33342 e le celle di prova sono state contate per garantire che in ogni pozzo si trovi zero o una cella. L'analisi del gel di agarosio ha rivelato una scala a basso peso molecolare e singole librerie uliCUT&RUN a singola cellula.

L'analisi della libreria non ottimale e ottimale mostra una scala a basso peso molecolare, una libreria non ottimale a causa dell'inefficiente digestione Mnase e una libreria di successo con una digestione appropriata. La distribuzione dell'analizzatore di frammenti mostra che la dimensione prevista della singola cella varia da 150 a 500 coppie di basi. Tuttavia, nelle grandi proteine, il DNA avrà circa 270 coppie di basi.

L'occupazione delle proteine utilizzando il browser del genoma a singolo locus raffigurante un numero elevato di cellule o un controllo negativo e il CTCF a singola cellula uliCUT & RUN ha rivelato che la singola cellula rappresentava in gran parte picchi forti, simili a uliCUT & RUN ad alta cellula. Le mappe termiche del CTCF a cella singola o del controllo negativo hanno rivelato un chiaro modello di arricchimento della lettura direttamente sui siti di legame CTCF stabiliti nelle cellule. Le mappe di calore unidimensionali mostrano una maggiore densità di lettura rispetto ai siti di legame CTCF stabiliti nelle librerie a singola cellula rispetto alle regioni circostanti e ai controlli senza anticorpi, dimostrando l'arricchimento anticorpo-specifico nei siti di legame stabiliti.

Equilibrare i nuclei legati alle perline sul bagno di acqua ghiacciata e non surriscaldare il campione dopo l'aggiunta di cloruro di calcio è importante per prevenire l'eccessiva digestione della cromatina.