Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Il test standard di alimentazione a membrana (SMFA) è considerato il gold standard per la valutazione e l'identificazione di potenziali composti antimalarici. Questo sistema di alimentazione artificiale viene utilizzato per infettare le zanzare per valutare ulteriormente gli effetti di tali composti sull'intensità e la prevalenza del parassita Plasmodium falciparum .

Il protocollo ci permette di rilevare l'effetto del trattamento sulla suscettibilità alla malaria dei vettori africani della malaria. Ad esempio, composti volti a bloccare la trasmissione dall'uomo alla zanzara. Questa tecnica consente ai ricercatori di valutare un gran numero di composti in condizioni di laboratorio, anche prima che siano disponibili GATE di tossicità.

Le dissezioni dell'intestino medio possono essere difficili all'inizio, ma ci vuole solo un po 'di pratica. Inoltre, essere in grado di identificare le oocisti non è sempre facile. In primo luogo, utilizzando un aspiratore a bocca, posizionare 25 zanzare Anopheles gambiae femmine non alimentate in una tazza da 350 millilitri.

Etichettare chiaramente le coppette per distinguere tra gruppi di controllo e di trattamento. Scegli il numero di tazze per trattamento in base al numero di repliche tecniche incluse. Collegare il sistema di alimentazione del vetro a bagnomaria e mantenere la temperatura a 37 gradi Celsius.

Quindi, preparare l'intestino di mucca o la membrana sintetica sciacquandolo in acqua di rubinetto e tagliandolo in pezzi che sono montati per ogni alimentatore. Coprire la parte inferiore di ciascun alimentatore e fissare la membrana con un elastico. Per utilizzare le tazze di alimentazione come coppette di infezione, in primo luogo, mantenere la membrana sopra le reti delle tazze.

Quindi posizionare le coppe di infezione sotto gli alimentatori. Ora, aggiungi un millilitro di sangue infetto da gametociti agli alimentatori delle coppe di controllo e sangue infetto da gametociti con un composto di prova agli alimentatori delle coppe di trattamento. Quindi lasciare le zanzare a nutrirsi per circa 40 minuti.

Dopo l'alimentazione, rimuovere gli alimentatori dalle tazze, sciacquare gli alimentatori e trattare il sangue in eccesso con ipoclorito. Quindi, abbatti tutte le zanzare sul ghiaccio per uno o due minuti e seleziona le zanzare che hanno preso un pasto di sangue cercando addomi gonfi e rossi. Sostituire l'acqua zuccherata che viene somministrata a giorni alterni a ciascuna tazza di infezione con un tampone di acqua zuccherata al 10% e incubare le coppette di infezione in una camera di biosicurezza per otto o 10 giorni.

Da otto a 10 giorni dopo l'alimentazione, abbatti le zanzare infette mettendole sul ghiaccio. Quindi, trasferirli in tubi etichettati con etanolo al 70%, mantenendo il controllo in ciascun gruppo di trattamento in provette separate. Mantenendo separati i gruppi di controllo e di test, trasferire le zanzare in piastre di Petri etichettate rivestite con carta da filtro.

Aggiungere una goccia di PBS su un vetrino opportunamente contrassegnato e trasferire una zanzara dalla carta da filtro alla goccia. Appuntare il torace della zanzara con l'ago da dissezione. Quindi, rimuovere l'intestino medio tirando il settimo segmento addominale con una pinza e trasferirlo in una goccia di mercurocromo allo 0,1% su un nuovo vetrino da microscopio.

Lasciare macchiare l'intestino per otto-10 minuti. Quindi posizionare una pellicola di copertura sull'intestino macchiato e visualizzarlo sotto l'illuminazione a campo luminoso da 20 a 40 volte l'ingrandimento. Registrare il numero di oocisti per intestino medio per il controllo e ciascun gruppo di trattamento.

In questo studio, il composto MMV1581558 è stato trovato per limitare significativamente il numero di oocisti Plasmodium falciparum nell'intestino medio delle zanzare femmine di Anopheles gambiae rispetto al controllo. Nel gruppo di controllo, la prevalenza media di oocisti nel midgut era dell'89% con un'intensità media di 9,5 oocisti per midgut. Ma nel gruppo trattato con MMV1581558, la prevalenza media delle oocisti era del 36% con un'intensità media di solo 1,5 oocisti per intestino medio.

Pertanto, il trattamento con MMV1581558 ha determinato un'attività di blocco della trasmissione del 58% e un'attività di riduzione della trasmissione dell'82% in tutte e tre le repliche biologiche. È fondamentale garantire che le zanzare si nutrano di una coltura di gametociti sana. Se questi sono gametociti immaturi o non stadiociti al quinto stadio, la probabilità di contrarre un'infezione nella zanzara è limitata o impossibile.

Il test utilizza un metodo di identificazione morfologica visiva, tuttavia è possibile utilizzare saggi di quantificazione molecolare. Questo è, tuttavia, più costoso e potrebbe limitare il loro uso in laboratori con risorse limitate. Avere la capacità di fare questa tecnica apre nuove strade per valutare il cambiamento della prevalenza e dell'intensità della malaria tra quasi tutto nella zanzara.

Ad esempio, confrontando la capacità vettoriale delle specie.