Microscopia elettronica a frattura da congelamento per l'analisi delle vescicole extracellulari
16 settembre 2022
Presentiamo un protocollo per l'isolamento e la congelamento-fratturazione di vescicole extracellulari (EV) provenienti da cellule uroteliali cancerose. La tecnica di congelamento-frattura ha rivelato il diametro e la forma dei veicoli elettrici e, come caratteristica unica, l'organizzazione interna delle membrane EV. Questi sono di immensa importanza per capire come i veicoli elettrici interagiscono con le membrane riceventi.
In video, presentiamo un protocollo per la congelamento-fratturazione di vescicole extracellulari provenienti da cellule tumorali della vescica in vitro. Le vescicole extracellulari sono vescicole limitate alla membrana che derivate dalle cellule vengono rilasciate nello spazio extracellulare e hanno un ruolo nella comunicazione intercellulare. All'interno delle vescicole extracellulari, discriminiamo tre popolazioni, esosomi, microvescicole e corpi apoptotici, che differiscono per origine, dimensioni e composizione molecolare.
La composizione molecolare delle vescicole extracellulari riflette il profilo molecolare della cellula donatrice e interferisce con i processi biologici nella cellula ricevente. Tuttavia, la composizione della membrana limitante delle vescicole cellulari è cruciale per l'interazione con la membrana cellulare ricevente. Per analizzare l'organizzazione della membrana limitante, le vescicole extracellulari devono essere prima isolate e quindi avvicinate alla tecnica di congelamento-frattura.
La congelo-frattura è una tecnica al microscopio elettronico dedicata allo studio dell'organizzazione bidimensionale delle membrane biologiche, comprese le vescicole. Le fasi della fratturazione del congelamento sono il congelamento rapido del campione, la fratturazione del campione, la realizzazione della replica della superficie fratturata congelata e la pulizia della replica per rimuovere materiali biologici. Le repliche vengono infine visualizzate con il microscopio elettronico a trasmissione.
Il nostro obiettivo era quello di utilizzare la tecnica della frattura da congelamento per caratterizzare le microvescicole in termini di forma, dimensioni e composizione della membrana. Inizia con le cellule in crescita nell'incubatore cellulare. Ispezionare le cellule al microscopio per confermarne la variabilità e la confluenza.
Raccogliere i terreni di coltura con microvescicole in tubi e centrifugare a 300 g-forze per 10 minuti. Colleziona surnatante. Successivamente, centrifuga surnatante a 2000 g-forze e 10.000 g-forze.
Successivamente, osservare la punta del tubo per un pellet biancastro che indica microvescicole. Rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere 1,5 millilitri di PBS e sospendere nuovamente il pellet contenente microvescicole.
Quindi centrifugare a 10.000 g-forze. Osservare per il pellet biancastro. Rimuovere il surnatante e aggiungere delicatamente fissativo.
Lasciare agire per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi rimuovere il fissativo e aggiungere il tampone di lavaggio per risciacquare il pellet senza sospenderlo nuovamente. Lasciare agire per 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere il 30% di glicerolo al pellet. Sospendere nuovamente il pellet in sospensione omogenea e incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Preparare supporti di rame puliti con una fossa centrale e sviluppare un pallone con cipiglio e azoto liquido.
Al microscopio, trasferire il campione nella fossa centrale del supporto di rame. Mescolare il freon solidificato per diventare liquefatto. Afferrare l'anello esterno del supporto con una pinzetta e immergerlo nel freon raffreddato.
Dopo otto secondi trasferire rapidamente il supporto in un pallone di sviluppo con azoto liquido. Mark cryo vile e raffreddarlo. Sotto azoto liquido raccogliere i vettori nel vile, chiuderlo e conservare nel contenitore di azoto liquido fino a congelare la fratturazione.
Preparare l'unità di frazione di congelamento secondo le istruzioni operative del produttore. Avviare il sistema di vuoto e raffreddare la camera dell'unità a meno 150 gradi Celsius. Trasferire i supporti di rame con il campione congelato nell'unità di congelamento-frazionamento.
Impostare la temperatura del coltello a meno 100 gradi Celsius e attendere il vuoto. Iniziare a sezionare il campione attivando il movimento motorizzato del coltello fino a quando la superficie del campione non è liscia. Per la fratturazione spegnere il movimento motorizzato del coltello e procedere con il lento controllo manuale del coltello.
Procedere con l'ombreggiatura in platino con l'angolo di 45 gradi. Accendere l'alta tensione e aumentare la corrente alla pistola di platino. Scintille di platino dovrebbero iniziare a ombreggiare il campione.
Supervisionare la posizione del platino sul monitor dello spessore del cristallo di quarzo. Lo spessore consigliato del platino è di 2,5 nanometri. Spegnere la corrente e l'alta tensione.
Procedere con l'ombreggiatura del carbonio con un angolo di 90 gradi. Accendere l'alta tensione e aumentare la corrente alla pistola in carbonio. Scintille di carbonio dovrebbero iniziare a mettere in ombra il campione.
Quando si ottengono 2,5 nanometri di carbonio, spegnere la corrente e l'alta tensione. Trasferire quei campioni con le repliche dall'unità di congelamento-frattura a una piastra a 12 valvole riempita con acqua a doppia distillazione. Le repliche galleggieranno sulla superficie dell'acqua mentre i vettori affondano.
Trasferire le repliche con anello di filo a una piastra a 12 valvole riempita con ipoclorito di sodio e incubare durante la notte. Lavare le repliche in acqua a doppio distillato. Raccoglieteli su una griglia TM in rame a rete e lasciateli asciugare all'aria per due ore.
Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione per visualizzare repliche e ottenere micrografie. Per un'interpretazione accurata di repliche e micrografie, seguire le linee guida per il corretto orientamento sulla nomenclatura. Le analisi delle repliche hanno mostrato che il mezzo isolato-condizionato conteneva una frazione arricchita di vescicole.
Le vescicole isolate sono state raccolte in gruppi di tre o più o distribuite molto individualmente. Le vescicole erano di forma sferica. Il diametro delle vescicole corrispondeva al diametro delle microvescicole.
La fratturazione del congelamento ha anche rivelato un'organizzazione bidimensionale della membrana delle microvescicole. La fase esoplasmatica delle microvescicole aveva un aspetto liscio e uniforme, mentre nella fase dei protoplasti abbiamo osservato particelle intermembrana. Le particelle inter-membrana sono apparse sporadicamente, il che implica che le microvescicole isolate dalle cellule del materiale tumorale contengono solo una bassa quantità di proteine di membrana o assemblaggi proteici.
Per riassumere, la tecnica di congelamento-frattura utilizzata nel protocollo presentato si rivela una tecnica ottimale per la caratterizzazione di vescicole extracellulari e può essere utilizzata per la valutazione di altre popolazioni di vescicole extracellulari. Un vantaggio cruciale della tecnica di congelamento-frattura è il suo potere di risolvere l'organizzazione interna della membrana che limita le vescicole, che determina la funzione biologica delle vescicole extracellulari.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'isolamento e la criofratturazione di vescicole extracellulari (EV) da cellule uroteliali tumorali. La tecnica di criofratturazione permette un'analisi dettagliata del diametro, della forma e dell'organizzazione interna della membrana delle EV, aspetti fondamentali per comprendere le interazioni delle EV con le membrane riceventi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sul cancro
Sfondo
- Le vescicole extracellulari (EVs) svolgono un ruolo significativo nella comunicazione intercellulare.
- Le EVs possono essere classificate in esosomi, microvescicole e corpi apoptotici in base alla loro origine e dimensione.
- La composizione molecolare delle EVs riflette il profilo della cellula donatrice.
- Comprendere la composizione della membrana limitante è essenziale per lo studio delle interazioni delle EVs.
Scopo dello studio
- Caratterizzare i microvesicoli derivati da cellule di carcinoma della vescica.
- Analizzare la forma, le dimensioni e la composizione della membrana degli EV.
- Utilizzare la tecnica di congelamento-frattura per l'analisi dettagliata dell'organizzazione della membrana.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di microvescicole da mezzi di coltura cellulare mediante centrifugazione.
- Frammentazione criogenica delle microvescicole isolate per l'analisi al microscopio elettronico.
- Visualizzazione delle repliche mediante microscopia elettronica a trasmissione.
- Analisi dell'organizzazione bidimensionale delle membrane delle microvescicole.
Risultati principali
- Si è scoperto che le microvescicole hanno una forma sferica con un diametro corrispondente a quello delle microvescicole.
- La frattura criogenica ha rivelato una fase esoplasmatica liscia e particelle intermembranarie sporadiche nella fase del protoplasto.
- Le vescicole isolate erano distribuite in gruppi o singolarmente.
- La tecnica si è rivelata ottimale per caratterizzare le EV e comprendere le loro funzioni biologiche.
Conclusioni
- La tecnica della frattura congelata è efficace per lo studio dell'organizzazione interna delle membrane delle VES.
- Questo metodo può essere applicato per valutare altre popolazioni di vescicole extracellulari.
- Comprendere la composizione della membrana delle VES è fondamentale per chiarire i loro ruoli biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La microscopia elettronica a congelamento-frattura consente una caratterizzazione ad alta risoluzione dell'architettura della membrana delle vescicole extracellulari (EV), supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale di scoperta. Un'analisi dettagliata della composizione e dell'organizzazione della membrana delle EV fornisce informazioni utili per la validazione degli obiettivi e aumenta la fiducia predittiva negli studi sulla comunicazione intercellulare. Questa capacità è strategicamente rilevante per i portafogli di oncologia e biologia cellulare in cui la segnalazione mediata da EV influisce sui modelli di malattia e sulle ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la visualizzazione diretta della distribuzione delle proteine della membrana degli EV per la validazione funzionale del bersaglio.
- Consente la riduzione dei rischi meccanicistici chiarificando l'origine delle vescicole e la loro composizione molecolare.
- Facilita la verifica di ipotesi relative ai percorsi di segnalazione mediati dagli EV.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce immagini standardizzate e riproducibili delle popolazioni di vescicole per lo sviluppo di saggi successivi.
- Fornisce dati quantitativi su dimensione, forma e caratteristiche della membrana delle vescicole per definire criteri di screening.
- Consente la preparazione di campioni di EV validati per la valutazione comparativa di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la caratterizzazione delle vescicole a modelli rilevanti per la malattia confermando l'identità e la purezza degli EV.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica permettendo un profilo consistente degli EV.
- Riduce il rischio di traduzione garantendo che le caratteristiche della membrana siano rappresentate accuratamente nei sistemi modello.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La microscopia elettronica con replica di congelamento-rottura si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo una caratterizzazione solida delle vescicole extracellulari prima di studi funzionali o traslazionali.
- Biologia della scoperta: Fornisce dati sull'organizzazione delle membrane per supportare la verifica delle ipotesi e la riduzione dei rischi biologici.
- Screening: Fornisce metriche quantitative e riproducibili sulle vescicole per la prontezza dei saggi.
- Analisi: Consente la misurazione del diametro delle vescicole, della forma e della distribuzione delle proteine di membrana per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Garantisce che le preparazioni di EV riflettano caratteristiche rilevanti per la malattia, in linea con gli studi preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato applicabile a diverse popolazioni di EV e programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità negli studi sui meccanismi mediati dagli EV.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione dei flussi di lavoro per la caratterizzazione degli EV.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati robusti sulle membrane in una fase precoce del processo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio di bersagli e modelli correlati agli EV.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in microscopia elettronica e tecniche di isolamento delle vescicole.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per microscopia elettronica a congelamento-frattura e a trasmissione.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale per le procedure di preparazione dei campioni e di acquisizione delle immagini.
- Adattabile a diverse popolazioni di EV con modifiche delle procedure secondo necessità.
- Limitata dalla produttività e dai requisiti di attrezzature specializzate intrinseci ai flussi di lavoro della microscopia elettronica.
