Name: Co-coltura di organoidi epiteliali murini dellintestino tenue con cellule linfoidi innate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Scopri la co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate ILC1. Questo metodo consente di studiare le interazioni tra cellule epiteliali e immunitarie intestinali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

E.R. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). D.C. riconosce un dottorato di ricerca. studentship dal NIHR GSTT BRC. J.F.N. riconosce una borsa di studio Marie Skłodowska-Curie, una borsa di studio King's Prize, una borsa di studio RCUK / UKRI Rutherford Fund (MR / R024812 / 1) e un Seed Award in Science dal Wellcome Trust (204394 / Z / 16 / Z). Ringraziamo anche il team principale della citometria a flusso BRC con sede presso il Guy's Hospital. I topi reporter Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 sono stati un generoso dono di G. Eberl (Institut Pasteur, Parigi, Francia). I topi CD45.1 C57BL/6 sono stati gentilmente somministrati da T. Lawrence (King's College London, Londra) e P. Barral (King's College London, Londra).

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).</li>
<li>Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cell-epithelial+cell+modules+sustain+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis.</a> Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).</li>
<li>Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+major+players+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+10+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: 10 years on.</a> Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).</li>
<li>Klose, C. S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+type+1+ILCs+from+a+common+progenitor+to+all+helper-like+innate+lymphoid+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages.</a> Cell. 157 (2), 340-356 (2014).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+and+-23+control+plasticity+of+CD127%2B+group+1+and+group+3+innate+lymphoid+cells+in+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria.</a> Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).</li>
<li>Jowett, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ILC1+drive+intestinal+epithelial+and+matrix+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling.</a> Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).</li>
<li>Wong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+ROR%CE%B1+is+critical+for+nuocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor RORα is critical for nuocyte development.</a> Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).</li>
<li>Neill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuocytes+represent+a+new+innate+effector+leukocyte+that+mediates+type-2+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity.</a> Nature. 464, 1367-1370 (2010).</li>
<li>Mjösberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA3+is+essential+for+the+function+of+human+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).</li>
<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li>
<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
<li>Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+innate+lymphoid+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of innate lymphoid cell subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+type+1+innate+lymphoid+cells+accumulate+in+inflamed+mucosal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues.</a> Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).</li>
<li>Date, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-gut+organoids%3A+reconstitution+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).</li>
<li>Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+infectious+diseases+and+host-microbe+interactions+in+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids.</a> Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Tallapragada, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflation-collapse+dynamics+drive+patterning+and+morphogenesis+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lymphocytes+from+the+mouse+small+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281(2018).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+maintenance+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells.</a> Bio-protocol. 6 (4), 1733(2016).</li>
<li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li>
<li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li>
<li>Seehus, C., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+murine+innate+lymphoid+cells+from+common+lymphoid+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells.</a> Bio-protocol. 6 (6), 1770(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive i metodi per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolando il raro ILC1 riducendo al minimo la perdita di linfociti durante il protocollo di dissociazione intestinale e stabilendo co-colture tra questi due compartimenti. Ci sono molti passaggi per questo protocollo, e mentre alcuni sono specifici per ILC1, questo approccio può essere applicato ad altri tipi di cellule immunitarie intestinali e le configurazioni di co-coltura possono essere adattate in modo modulare per soddisfare le...

La comunicazione tra l'epitelio intestinale e il sistema immunitario residente nell'intestino è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi intestinale1. Le interruzioni di queste interazioni sono associate a malattie sia locali che sistemiche, tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e i tumori gastrointestinali2. Un esempio notevole di un regolatore critico dell'omeostasi descritto più di recente proviene dallo studio delle cellule linfoidi innate (ILC), che sono emerse come attori chiave nel panorama immunitario intestinale3. Le ILC sono un gruppo di cellule immunitarie innate eterogenee che regolano l'omeostasi intestinale e orchestrano l'infiammazione in gran parte attraverso la segnalazione mediata da citochine4.
Le ILC murine sono ampiamente suddivise in sottotipi basati sul fattore di trascrizione, sul recettore e sui profili di espressione delle citochine5. Le ILC di tipo 1, che includono cellule natural killer citotossiche (NK) e ILC di tipo 1 simili a helper (ILC1), sono definite dall'espressione del fattore di trascrizione (eomesodermi) Eomes e della proteina T-box espresse rispettivamente nelle cellule T (T-bet)6 e secernono citochine associate all'immunità T helper di tipo 1 (TH H1): interferone-γ (IFNγ) e fattore di necrosi tumorale (TNF), in risposta all'interleuchina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante l'omeostasi, gli ILC1 residenti nei tessuti secernono β del fattore di crescita trasformante (TGF-β) per guidare la proliferazione epiteliale e il rimodellamento della matrice8. Le ILC di tipo 2 (ILC2) rispondono principalmente all'infezione da elminti attraverso la secrezione di citochine associate a T helper di tipo 2 (TH2): IL-4, IL-5 e IL-13 e sono caratterizzate dall'espressione del recettore orfano correlato all'acido retinoico (ROR) α (ROR-α)9 e della proteina legante GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Nei topi, gli ILC2 "infiammatori" intestinali sono ulteriormente caratterizzati dall'espressione del recettore simile alla lectina delle cellule killer (sottofamiglia G membro 1, KLRG)13 dove rispondono a IL-2514,15 derivato dalle cellule del ciuffo epiteliali. Infine, le ILC di tipo 3, che includono cellule indurici del tessuto linfoide e ILC di tipo 3 simili a helper (ILC3), dipendono dal fattore di trascrizione ROR-γt16 e si raggruppano in gruppi che secernono il fattore stimolante la colonia di macrofagi dei granulociti (GM-CSF), IL-17 o IL-22 in risposta ai segnali locali IL-1β e IL-2317. Le cellule indurici del tessuto linfoide si raggruppano nei cerotti di Peyer e sono cruciali per lo sviluppo di questi organi linfoidi secondari durante lo sviluppo18, mentre gli ILC3 sono il sottotipo ILC più abbondante nella lamina propria dell'intestino tenue murino adulto. Uno dei primi sistemi di co-coltura di organoidi intestinali murini con ILC3 è stato sfruttato per separare l'impatto della citochina IL-22 sul trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT-3) mediato dalla ripetizione ricca di leucina contenente il recettore accoppiato alla proteina G 5 (Lgr5) + proliferazione delle cellule staminali intestinali19, un potente esempio di interazione rigenerativa ILC-epiteliale. Le ILC mostrano eterogeneità di impronta tra gli organi20,21 e mostrano plasticità tra i sottoinsiemi in risposta alle citochine polarizzanti22. Ciò che guida queste impronte tessuto-specifiche e le differenze di plasticità, e quale ruolo svolgono in malattie croniche come IBD23, rimangono argomenti interessanti che potrebbero essere affrontati utilizzando co-colture organoidiche.
Gli organoidi intestinali sono emersi come un modello di successo e affidabile per studiare l'epitelio intestinale24,25. Questi sono generati dalla coltivazione di cellule staminali Lgr5+ epiteliali intestinali, o intere cripte isolate, che includono le cellule di Paneth come fonte endogena del membro della famiglia Wnt 3A (Wnt3a). Queste strutture 3D sono mantenute in idrogel sintetici26 o in biomateriali che imitano la lamina propria basale, ad esempio la matrice extracellulare basale reticolante termica (TBEM), e sono ulteriormente integrate con fattori di crescita che imitano la nicchia circostante, in particolare il fattore di crescita epiteliale (EGF), l'inibitore della proteina morfogenetica ossea (BMP) Noggin e un Lgr5-ligando e Wnt-agonista R-Spondin127 . In queste condizioni, gli organoidi mantengono la polarità apico-basale epiteliale e ricapitolano la struttura cripto-villi dell'epitelio intestinale con cripte di cellule staminali in erba che si differenziano terminalmente in cellule assorbenti e secretorie al centro dell'organoide, che poi si riversano nello pseudolume interno da anoikis28. Sebbene gli organoidi intestinali da soli siano stati estremamente vantaggiosi come modelli riduzionisti di sviluppo e dinamica epiteliale in isolamento29,30, hanno un enorme potenziale futuro per capire come questi comportamenti sono regolati, influenzati o addirittura interrotti dal compartimento immunitario.
Nel seguente protocollo, viene descritto un metodo di co-coltura tra organoidi intestinali piccoli murini e ILC1 derivati dalla lamina propria, che è stato recentemente utilizzato per identificare come questa popolazione diminuisce inaspettatamente le firme intestinali dell'infiammazione e contribuisce invece ad aumentare la proliferazione epiteliale tramite TGF-β in questo sistema8.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse NK1.1 (PE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), senza siero</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127 Anticorpo monoclonale (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD19 Anticorpo monoclonale (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3e anticorpo monoclonale (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 anticorpo monoclonale (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>COLLAGENASI D, 500MG</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T La</td><td>linea cellulare è stata utilizzata per raccogliere il surnatante RSpondin1 condizionato, la linea cellulare e l'accordo di trasferimento dei materiali sono stati forniti dal Consiglio di amministrazione della Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD, PhD, Stanford University)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DISPASE II (PROTEASI NEUTRA, GRADO II)</td><td>Merck</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNASE I, GRADE II</td><td>Merck</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Ethilenediamine Tetraacetato Acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC block</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, inattivato</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T- mNoggin-Fc La</td><td>linea cellulare Cells è stata utilizzata per raccogliere il surnatante Noggin condizionato, una linea cellulare acquisita attraverso un accordo di trasferimento di materiali con l'Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, Paesi Bassi, e si basa sulla pubblicazione di Farin, Van Es e Clevers Gastroenterology (2012).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES (1M)</td>Anticorpo monoclonale <td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1 (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>Kit colorante per cellule morte blu fissabile vivo/morto, per eccitazione UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Ly-6G/Ly-6C (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Fattore di crescita Matrice della membrana basale ridotta, senza rosso fenolo, senza LDEV</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina (500mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 Anticorpo monoclonale (PE Cianina7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1 X) 7,2 pH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante, R& Proteine prive di animali</td><td> D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Proteina umana ricombinante IL-15 GMP, FC</td><td>R& D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 umano ricombinante (senza carrier)</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante IL-7 (senza carrier)</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML-005/CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato (inibitore ROCK)</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL provetta</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Pippette da 10 mL</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>Falcon</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>Pippette da 25 mL</td><td>StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10 punte Pippette</td><td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>P1000 punte Pippette</td><td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 punte Pippette</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti trattata per coltura tissutale standard</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a CO2 e temperatura controllata</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td>Flow Assisted Cellular Sorter</td><td>BD equipment</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore riscaldato</td><td>Stuart Equipment</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Ice box</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microscopio a luce invertita</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)</td><td></td></tr><tr><td>p10 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>Pippette gun</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio bagnato</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complesse co-colture di organoidi con cellule immunitarie forniscono uno strumento versatile per interrogare le interazioni bidirezionali che sono alla base del delicato equilibrio dell'omeostasi della mucosa. Questi sistemi 3D e multicellulari offrono un modello riduzionista per affrontare le malattie multifattoriali e risolvere le difficoltà tecniche che sorgono quando si studiano tipi di cellule rare come le cellule linfoidi innate residenti nei tessuti (ILC). Questo articolo descrive un sistema murino che combina organoidi dell'intestino tenue e ILC di tipo 1 (ILC1) derivati dalla lamina propria dell'intestino tenue, che possono essere facilmente estesi ad altre POPOLAZIONI ILC o immunitarie. Le ILC sono una popolazione residente nei tessuti particolarmente arricchita nella mucosa, dove promuovono l'omeostasi e rispondono rapidamente a danni o infezioni. Le co-colture organoidi con ILC hanno già iniziato a far luce su nuovi moduli di segnalazione epiteliale-immunitaria nell'intestino, rivelando come diversi sottoinsiemi di ILC influiscono sull'integrità e sulla rigenerazione della barriera epiteliale intestinale. Questo protocollo consentirà ulteriori indagini sulle interazioni reciproche tra cellule epiteliali e immunitarie, che hanno il potenziale per fornire nuove informazioni sui meccanismi dell'omeostasi e dell'infiammazione della mucosa.

Una volta completate con successo, le cripte appena isolate dovrebbero formare strutture di cripte in erba entro 2-4 giorni (Figura 1A). Le colture organoidi sane e robuste dovrebbero crescere attivamente e possono essere passate ed espanse come dettagliato nel protocollo.
Questo protocollo descrive l'isolamento dell'ILC1 dell'intestino tenue dalla linea di reporter transgenici murini RORγtGFP , che consente l'isolamento di ILC1 vivo mediante FACS (<str...

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Questo protocollo fornisce uno strumento significativo per studiare le interazioni tra le cellule immunitarie intestinali e l'epitelio e per analizzare come queste interazioni possono regolarsi nell'omeostasi intestinale e nell'infiammazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la squisita quantità di controllo sperimentale facilitato dal modello di riduzione in vitro, che può essere utilizzato per affrontare questioni di biologia epiteliale e immunitaria. Questo sistema è già stato utilizzato per determinare il ruolo di ILC1 nell'espansione delle cripte epiteliali CD44-positive e ha il potenziale per far progredire ulteriormente la nostra comprensione delle malattie gastrointestinali mediate dall'infiammazione.Per iniziare, posizionare la matrice extracellulare basale reticolante termica sul ghiaccio per scongelare e preriscaldare una piastra standard a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale posizionandola in un incubatore a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la piastra contenente organoidi dall'incubatrice e scartare il mezzo dal pozzo da passare. Quindi, aggiungere 500 microlitri di DMEM F12 avanzato ghiacciato ai pozzetti e, utilizzando una punta P-1000, r

co-culture-murine-small-intestine-epithelial-organoids-with-innate

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Le colture derivate da cellule staminali hanno un enorme potenziale per modellare le malattie infettive. Qui viene descritta la coltura di organoidi gastrici di topo e umani derivati da cellule staminali adulte. Gli organoidi vengono microiniettati con l'agente patogeno gastrico Helicobacter pylori.

Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell&#39;uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell&#39;Helicobacter Pylori

Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

In questo protocollo, descriviamo come generare monostrati epiteliali primari murini direttamente dalle cripte intestinali. Forniamo approcci sperimentali per generare monostrati confluenti su filtri permeabili, monostrati confluenti per la guarigione delle ferite da graffio e studi biochimici e monostrati sparsi e confluenti per l'analisi dell'immunofluorescenza.

Generazione di monostrati epiteliali del colon primario murino da cripte intestinali

Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

Il presente protocollo descrive la creazione di un sistema di organoidi del colon murino per studiare l'attività e il funzionamento delle cellule staminali del colon in un modello knockout di claudina-7.

Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

Qui, descriviamo un protocollo per la coltura di organoidi intestinali 3D di maiale da cripte epiteliali crioconservate. Descriviamo anche un metodo per stabilire monostrati cellulari derivati da organoidi 3D, consentendo l'accesso al lato apicale delle cellule epiteliali.

Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari

Descriviamo un protocollo per isolare le piccole cripte intestinali murine e la coltura di organoidi 3D intestinali dalle cripte. Inoltre, descriviamo un metodo per generare organoidi da una singola cellula staminale intestinale in assenza di una nicchia cellulare sub-epiteliale.

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

Lo studio presenta un metodo per l'indagine in vitro delle infezioni batteriche utilizzando organoidi intestinali derivati dalle cellule staminali tissutali. Il protocollo descrive come coltivare e differenziare gli organoidi in due dimensioni, infettarli con Escherichia coli invasiva da aderenti e valutare i dati chiave, tra cui la rottura della barriera epiteliale, l'imaging infezionale e la risposta dell'RNA epiteliale.

Una coltura organoide bidimensionale su estratto di invasina o membrana basale per studiare le interazioni ospite-batteri

Descriviamo pipeline di imaging confocale e tracciamento applicati a due strategie di reporter: organoidi mosaici per risolvere il comportamento delle singole cellule e organoidi fate reporter per il monitoraggio delle transizioni cellulari in organoidi intestinali umani e murini.

Imaging a cellule vive e tracciamento a singola cellula per monitorare la dinamica clonale e le transizioni del destino negli organoidi intestinali umani e murini

Scopri la co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate ILC1. Questo metodo consente di studiare le interazioni tra cellule epiteliali e immunitarie intestinali.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Esplora altri video