Name: Valutazione dellubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Scopri come valutare l'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati di cellule di mammifero HEK293T. Questo metodo semplice aiuta a studiare le interazioni ligasi-sostrato in malattie come cancro e disturbi neurologici.

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F.R.T è supportato dal numero di sovvenzione FAPESP 2020/15771-6 e CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P e V.S sono supportati da CAPES. C.R.S.T.B.C è stato supportato dalla borsa di studio FAPESP numero 2019/23466-1. Ringraziamo Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) per il supporto materiale.

NOTA: Una panoramica del protocollo di analisi dell'ubiquitilazione nelle cellule di mammifero è rappresentata nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> Figura 1. Panoramica della procedura di analisi dell'ubiquitilazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Coltura cellulare
<ol><li>Coltiva la linea cellulare HEK293T in un piatto di coltura trattato tc da 100 mm fino all'80% -90% di confluenza nei mezzi di crescita (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ad alto glucosio integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e penicillina (100 unità), streptomicina (100 μg) e L-glutammina (0,292 mg / mL)). Incubare la coltura a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO2.</li>
	<li>Per passare le cellule, aspirare il mezzo dal piatto di coltura usando una pipetta sierologica. Lavare le cellule una volta con 1 mL di soluzione salina sterilizzata 1x tamponata con fosfato (PBS 1x).</li>
	<li>Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA (acido etilendiamminotetraacetico). Incubare il piatto a 37 °C per 5 min. Risospesso le cellule utilizzando una pipetta sierologica in 2 ml di terreno di crescita.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo fresco e pulito da 15 ml e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere il surnatante versandolo con cura. Risospesciare delicatamente il pellet cellulare in 3 ml di terreno di crescita pipettando su e giù per ottenere una sospensione cellulare omogenea.</li>
	<li>Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in una capsula di coltura da 100 mm trattata con TC contenente 9 mL di terreno di crescita. NOTA: Se le cellule sono in buone condizioni, ogni piatto di coltura di HEK293T, in cui la confluenza è dell'80% -90%, può generare tre piatti di coltura con confluenza dell'80% 2 giorni dopo il passaggio.</li>
</ol>2. Trasfezione cellulare
NOTA: Non è consigliabile trasfettare la coltura cellulare se la confluenza raggiunta è inferiore all'80%.
<ol><li>Prima della trasfezione, certificare se le cellule sono esenti da contaminazione e ad una confluenza adeguata per le trasfezioni transitorie.</li>
	<li>Per ogni campione di trasfezione, preparare i complessi DNA-Polietilenimina (PEI 1 μg/μL a pH 7,2) come segue:<ol>
<li>Diluire 3 μg di ciascun plasmide in 100 μL di opti-MEM I mezzo sierico ridotto senza integrazione e mescolarlo delicatamente pipettando la soluzione su e giù. NOTA: Qui, le cellule sono state trasfettate con 4 μg di ciascun plasmide: vettori vuoti (pcDNA3) o costrutti FLAG-Fbxo7 e UXT-V2-HA, con o senza 6xHis-myc-ubiquitina. Il contenuto totale di DNA era di 12 μg.</li>
		<li>Scongelare il PEI a RT e aggiungerlo nella soluzione seguendo una proporzione di 3 μL di PEI per 1 μg di DNA. Omogeneizzare la soluzione tubando su e giù. Quindi incubarlo per 15 minuti a RT per consentire la formazione di complessi DNA-PEI. NOTA: La proporzione ottimale di volume di PEI per quantità di DNA varia a seconda della linea cellulare selezionata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere il volume totale dei complessi DNA-PEI a ciascun piatto contenente la coltura cellulare e mescolarlo delicatamente facendo oscillare la piastra avanti e indietro. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO2.</li>
	<li>Sostituire il mezzo di crescita dopo 5 ore, poiché l'esposizione prolungata al PEI può essere tossica per le cellule HEK293T. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO2 per 36 ore.</li>
</ol>3. Lisi cellulare e immunoprecipitazione
<ol><li>Dopo il periodo di incubazione e 6 ore prima della lisi cellulare, trattare le cellule trasfettate con 10 μM dell'inibitore del proteasoma MG-132. Ancora una volta, incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO2.</li>
	<li>Aspirare il materiale da ogni piatto di coltura usando una pipetta sierologica e lavarlo una volta con 1 ml di 1x PBS. Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina e incubando il piatto a 37 °C per 5 min. Risospendare le cellule in 1 mL di mezzi di crescita.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml fresco e pulito e centrifugarla a 500 x g per 5 minuti a RT.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante versandolo con cura. Risospenare delicatamente il pellet cellulare in 200 μL di tampone di lisi NP-40 ghiacciato (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl e 1% NP-40), integrato con il cocktail inibitori della proteasi e della fosfatasi (10 mM NaF e 1 mM Na3VO4) e trasferire la soluzione in un microtubo pulito da 1,5 mL.</li>
	<li>Incubare il lisato cellulare per 30 minuti sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, centrifugare i lisati cellulari a 16.900 x g per 20 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Nel frattempo, equilibrare le perle di agarosio-anti-HA con un tampone di lisi NP-40 ghiacciato. Utilizzare 15 μL di perline di agarosio-anti-HA per ogni campione. Lavare le perline con 200 μL di tampone di lisi NP-40 pulsandolo in un tubo microcentrifuga a 3.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Con una pipetta, aspirare e scartare il surnatante con molta attenzione; ripetere questo processo tre volte. Successivamente, mantenere le perline equilibrate sul ghiaccio fino all'uso.</li>
	<li>Dopo aver centrifugato i lisati cellulari, recuperare il surnatante. Quantificare il contenuto proteico nel lisato totale utilizzando il metodo Bradford16.</li>
	<li>Assicurarsi che ogni campione sottoposto a immunoprecipitazione presenti una quantità uguale di proteine. Incubare il volume necessario di lisato cellulare con le perle equilibrate di agarosio-anti-HA per 4 ore, ruotando delicatamente in un incubatore rotante a 4 °C, che consente all'UXT-V2-HA di legarsi alle perle di agarosio-anti-HA.</li>
	<li>Raccogliere le perle di agarosio-anti-HA pulsandole in un tubo microcentrifuga a 3.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Aspirare con cura ed scartare il surnatante. Lavare le perline tre volte con tampone di lisi cellulare NP-40 ghiacciato e due volte con tampone FLAG/HA ghiacciato (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl e 0,1% NP-40).</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, rimuovere accuratamente tutto il surnatante utilizzando una pipetta ed eluire la proteina poliubiquitilata con peptide HA (300 μg/mL) diluito su tampone FLAG/HA. Incubare le perle di agarosio-anti-HA con peptide HA per 1 ora a 4 °C in una piattaforma shaker a dondolo.</li>
	<li>Abbassare le perline a 3.000 x g per 2 minuti a 4 °C e pipettare con cura il surnatante contenente le proteine poliubiquitinate. Se necessario, conservare l'eluato in un microtubo fresco e pulito a -20 °C.</li>
	<li>Risolvere gli eluati e i lisati cellulari in 10% SDS-PAGE (elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide)17 e immunoblotting.</li>
	<li>In questo studio, è stato eseguito un WB a trasferimento umido. Per questo tipo di trasferimento, posizionare il gel in un sandwich di trasferimento composto da carta da filtro-gel-membrana-carta da filtro, ammortizzarlo con pastiglie e premerlo insieme da una griglia di supporto. Posizionare questo sistema verticalmente in un serbatoio pieno di buffer di trasferimento e tra elettrodi a filo di acciaio inossidabile / platino. Il trasferimento avviene per 90 min a 150 V in tampone di trasferimento umido (glicina 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanolo). NOTA: Poiché gli estratti cellulari sono stati quantificati (fase 3.7), eseguire una SDS-PAGE con una quantità uguale di proteine per ciascun campione. Inoltre, per risolvere l'eluato, eseguire volumi uguali di ciascun campione.</li>
	<li>Sondare la membrana immunoblot utilizzando anticorpi selezionati 11. Assicurarsi che venga rilevato un segnale di striscio nell'eluato dal substrato poliubiquitilato estratto nel processo IP utilizzando anticorpi anti-myc nei campioni contenenti la legasi E3 wild-type, il substrato e myc-ub. Nel lisato cellulare (input), assicurarsi che venga rilevato il segnale proveniente dal substrato scelto, la proteina Fbxo7, le proteine ubiquitilate e una proteina di pulizia (ad esempio, GAPDH e β-actina) per garantire la stessa quantità di proteine in ogni corsia. NOTA: La diluizione per ciascun anticorpo utilizzato è stata preparata secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.

L'ubiquitilazione è una modificazione post-traduzionale essenziale che regola i livelli di diverse proteine e svolge un ruolo cruciale in molte vie di segnalazione e processi biologici, garantendo un ambiente intracellulare sano. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è uno dei principali focus della recente ricerca farmaceutica, fornendo la possibilità di stabilizzare i soppressori tumorali o indurre la degradazione dei prodotti oncogeni22. Ad esempio, la proliferazione aberrante delle neoplasie ...

Le modificazioni post-traduzionali (PTM) sono un meccanismo importante per quanto riguarda la regolazione delle proteine, che è essenziale per l'omeostasi cellulare. L'ubiquitilazione proteica è una modifica dinamica e intricata che crea un assortimento di segnali diversi con conseguenti diversi risultati cellulari negli organismi eucariotici. L'ubiquitilazione è un processo reversibile che consiste nell'attaccamento di una proteina di ubiquitina contenente 76 amminoacidi al substrato, che si verifica in una cascata enzimatica composta da tre reazioni distinte1. Il primo passo è caratterizzato dall'attivazione dell'ubiquitina, che dipende da un'idrolisi dell'ATP per formare un'ubiquitina legata al tioestere ad alta energia tra l'ubiquitina C-terminus e il residuo di cisteina presente nel sito attivo dell'enzima E1. Successivamente, l'ubiquitina viene trasferita all'enzima E2 formando un complesso simile al tioestere con l'ubiquitina. Successivamente, l'ubiquitina viene attaccata covalentemente al substrato dall'E2, o più spesso, dall'enzima E3, che riconosce e interagisce con il substrato 2,3. Occasionalmente, gli enzimi E4 (fattori di allungamento della catena dell'ubiquitina) sono necessari per promuovere l'assemblaggio della catena multiubiquitina3.
L'ubiquitina ha sette residui di lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63), consentendo la formazione di catene di poliubiquitina che generano legami distinti per produrre diverse strutture tridimensionali che saranno riconosciute da diverse proteine effettrici 4,5. Quindi, il tipo di catena di poliubiquitina introdotta nel substrato è essenziale per decidere il suo destino cellulare 6,7,8. Inoltre, il substrato potrebbe anche essere ubiquitinato attraverso i suoi residui N-terminali chiamati N-degrons. Specifiche ubiquitina-ligasi E3 sono responsabili del riconoscimento dell'N-degron, consentendo la poliubiquitilazione del vicino residuo di lisina9.
Al giorno d'oggi, ci sono più di 40 diversi substrati specifici SCF caratterizzati. Tra questi, i regolatori chiave di diversi percorsi biologici, tra cui la differenziazione e lo sviluppo cellulare, nonché la sopravvivenza e la morte cellulare, possono essere trovati 10,11,12,13. Pertanto, l'identificazione di substrati specifici di ciascuna ubiquitina-ligasi E3 è essenziale per progettare una mappa completa di vari eventi biologici. Anche se l'identificazione di veri substrati è biochimicamente impegnativa, l'uso di metodi basati sulla biochimica è molto adatto per valutare la specificità della catena e la distinzione tra mono- e poliubiquitilazione14. Questo studio descrive un protocollo completo per il test di ubiquitilazione utilizzando la linea cellulare di mammiferi HEK293T sovraesprimendo il substrato UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) con il complesso E3 ubiquitina-ligasi SCF (Fbxo7). UXT-V2 è un co-fattore essenziale per la segnalazione di NF-κB e, una volta che questa proteina viene abbattuta nelle cellule, inibisce l'attivazione NF-κB indotta da TNF-α11. Pertanto, per rilevare UXT-V2 poliubiquitilato, viene utilizzato l'inibitore del proteasoma MG132 poiché ha la capacità di bloccare l'attività proteolitica della subunità 26S del complesso proteasoma15. Inoltre, l'estratto cellulare viene sottoposto a un IP su piccola scala per purificare il substrato, utilizzando un anticorpo specifico immobilizzato alla resina di agarosio per la successiva rilevazione da parte di WB utilizzando anticorpi selezionati. Questo protocollo è molto utile per convalidare l'ubiquitilazione del substrato nell'ambiente cellulare e può anche essere adattato per diversi tipi di cellule di mammifero e altri complessi E3 ubiquitina-ligasi. Tuttavia, è necessario convalidare il substrato testato anche attraverso un test di ubiquitilazione in vitro, poiché entrambi i protocolli si completano a vicenda per quanto riguarda l'identificazione di substrati reali.

<table><tbody><tr><td>Microprovetta da 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura da 100 mm trattata con TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Perline di agarosio anti-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-topo</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Anticorpo IgG anti-topo</td></tr><tr><td>di</td> capra <td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>Anticorpo anti-coniglio IgG</td></tr><tr><td>anti-actina</td><td>di capra Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Diluizione utilizzata: 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Fbxo7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Diluizione utilizzata: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Diluizione utilizzata: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpi anti-Myc</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2272</td><td>Diluizione utilizzata: 1:1000</td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Siero bovino Albumina</td></tr><tr><td>Incubatore cellulare</td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R 500</td><td>x g per 5 min</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH digitale</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>Alto glucosio</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtrato uso precedente</td></tr><tr><td>Peptide HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline </td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana assorbente nitrocellulosica</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Microscopi OPTIKA</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Per l'espressione dei mammiferi</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; Gentilmente donato dal Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (terminale N). Enzimi di restrizione: EcoRI e XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta; F-box</td><td>&nbsp; Gentilmente donato dal Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (terminale N). Enzimi di restrizione: EcoRI e XhoI. e Delta; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA&</td><td>nbsp; Gentilmente donato dal Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag HA (terminale C). Enzimi di restrizione: EcoRI e XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitina</td><td>&nbsp; Gentilmente donato dal Dr. Marcelo Dam&aacute; rio</td><td></td><td>Tag 6x-His-Myc (N-terminale). Enzimi di restrizione: EcoRI e KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutammina 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>Per ottenere un 1x PBS, diluire il 10x PBS in acqua ultrapura</td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a dondolo</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>Sistema SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Omogeneizzatore</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Luminol Western Blotting</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi e3 nei lisati a cellule di mammifero

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

L'ubiquitilazione è una modifica post-traduzionale che si verifica nelle cellule eucariotiche che è fondamentale per la regolazione di diversi percorsi biologici, tra cui la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la differenziazione. È un processo reversibile che consiste in un attaccamento covalente di ubiquitina al substrato attraverso una reazione a cascata di almeno tre diversi enzimi, composti da E1 (enzima di attivazione dell'ubiquitina), E2 (enzima coniugante dell'ubiquitina) ed E3 (enzima Ubiquitina-ligasi). Il complesso E3 svolge un ruolo importante nel riconoscimento del substrato e nell'ubiquitilazione. Qui, viene descritto un protocollo per valutare l'ubiquitilazione del substrato nelle cellule di mammifero utilizzando la co-trasfezione transitoria di un plasmide che codifica il substrato selezionato, una ubiquitina ligasi E3 e un'ubiquitina marcata. Prima della lisi, le cellule trasfettate vengono trattate con l'inibitore del proteasoma MG132 (carbobenzossi-leu-leu-leucinale) per evitare la degradazione proteasomiale del substrato. Inoltre, l'estratto cellulare viene sottoposto a immunoprecipitazione su piccola scala (IP) per purificare il substrato poliubiquitilato per la successiva rilevazione mediante western blotting (WB) utilizzando anticorpi specifici per il tag ubiquitina. Quindi, viene descritto un protocollo coerente e semplice per il test di ubiquitilazione nelle cellule di mammifero per aiutare gli scienziati ad affrontare l'ubiquitilazione di substrati specifici e le ligasi di ubiquitina E3.

UXT (trascrizione ubiquitariamente espressa) è una proteina simile alla prefoldina che forma complessi di ripiegamento proteico ubiquitariamente espressi nei tessuti di topo e umani come cuore, cervello, muscolo scheletrico, placenta, pancreas, rene e fegato18. Due isoforme di giunzione di UXT, che sono denominate UXT-V1 e UXT-V2, sono state descritte mentre svolgono funzioni distinte e posizioni subcellulari. UXT-V1 è prevalentemente localizzato nel citoplasma e all'interno dei mitocondri, ed è i...

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Questo protocollo permette di valutare l'ubiquitilazione di un substrato specifico da parte di una ligasi E3. Sappiamo che la caratterizzazione dell'interazione ligasi-substrato è fondamentale per comprendere la loro funzione nelle cellule. Questa tecnica non richiede reagenti costosi o apparecchiature sofisticate.Ha bisogno di plasmidi e codifica dei geni di interesse, sviluppando un test di immunoprecipitazione con lisati cellulari e un Western blot per rilevare l'ubiquitilazione del substrato. Diverse malattie umane come il cancro e disturbi neurologici sono associate alla disregolazione della ligasi E3. Quindi, l'identificazione dell'ubiquitilazione del substrato da parte di specifiche ligasi E3 potrebbe aiutare nel trattamento o nella diagnosi di tali malattie.A dimostrare la procedura sarà di Valentine Spagnol. Per iniziare, coltiva la linea cellulare HEK293T fino all'80-90% di confluenza nel mezzo Eagles modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale e 100 unità di penicillina, 100 microgrammi di streptomicina e 0,292 milligrammi per millilitro di L-glutammina. Quindi, incubare questa coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di anidride carbonica.Passare le cellule aspirando il terreno dal piatto di coltura usando una pipetta sierologica e lavarle una volta con un millilitro di PBS 1X sterilizzato. Quindi, staccare le cellule aggiungendo un millilitro di soluzione di acido etilendiamminotetraacetico di tripsina e dopo cinque minuti di incubazione a 37 gradi Celsius, risospese queste cellule in due millilitri di mezzi di crescita usando una pipetta sierologica. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri fresco e pulito e centrifugare a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere delicatamente il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in tre millilitri di terreno di crescita pipettando su e giù per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Quindi, trasferire un millilitro di questa sospensione cellulare in un piatto di coltura trattato TC da 100 millimetri contenente nove millilitri di mezzi di crescita. Prima della trasfezione, certificare se le cellule sono esenti da contaminazione e ad una confluenza adeguata per le trasfezioni transitorie.Per ogni campione di trasfezione, preparare i complessi DNA-polietileneimina diluendo tre microgrammi di ciascun plasmide in 100 microlitri di mezzo sierico ridotto Opti-MEM 1 senza integrazione e mescolandolo delicatamente pipettando la soluzione su e giù. Quindi, scongelare il DNA-polietilenemina a temperatura ambiente e aggiungerlo nella soluzione seguendo una proporzione di tre microlitri di DNA-polietileneimmina per un microgrammo di DNA. Omogeneizzare la soluzione tubando su e giù.Quindi, incubarlo per 15 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi DNA-polietileneimina. Aggiungere il volume totale dei complessi DNA-polietileneimina a ciascun piatto contenente la coltura cellulare e mescolarlo delicatamente facendo oscillare la piastra avanti e indietro. Quindi, incubare queste cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di colture cellulari umidificate.Dopo l'incubazione e sei ore prima della lisi cellulare, trattare le cellule trasfettate con l'inibitore del proteasoma 10-micromolare MG132 e incubare le cellule nell'incubatore di colture cellulari umidificate. Quindi, aspirare il materiale da ogni piatto di coltura usando una pipetta sierologica e lavare le cellule una volta con un millilitro di 1X PBS. Quindi, staccare le cellule aggiungendo una tripsina millilitro e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Risospesere le cellule in un millilitro di terreno di crescita e trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da due millilitri fresco e pulito e centrifugarla a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere il surnatante versandolo con cura e risospesci delicatamente il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di lisi MP40 ghiacciato integrato con il cocktail inibitori della proteasi e della fosfatasi. Quindi trasferire questa soluzione in un microtubo pulito da 1,5 millilitri.Incubare questo lisato cellulare per 30 minuti sul ghiaccio e, dopo l'incubazione, centrifugare i lisati cellulari a 16.900 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Nel frattempo, equilibrare le perle anti-HA di agarosio con un tampone di lisi MP40 ghiacciato. Utilizzare 15 microlitri di perline anti-HA di agarosio per ogni campione.Lavare le perline con 200 microlitri di tampone di lisi MP40 pulsandole in un tubo di microcentrazione a 3.000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Quindi, aspirare e scartare accuratamente il surnatante con una pipetta e ripetere questo processo tre volte. Successivamente, mantenere le perline equilibrate sul ghiaccio fino all'uso.Dopo aver centrifugato i lisati cellulari, recuperare il surnatante e quantificare il contenuto proteico nel lisato totale utilizzando il metodo Bradford per garantire che ogni campione sottoposto a immunoprecipitazione presenti una quantità uguale di proteine. Incubare il volume necessario di lisato cellulare con le perle anti-HA di agarosio bilanciate per quattro ore, ruotando delicatamente in un incubatore rotante a quattro gradi Celsius, che consente all'UXT-V2-HA di legarsi alle perle anti-HA di agarosio. Raccogliere le perle anti-HA di agarosio pulsandole in un tubo microcentrifuga a 3.000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius.Aspirare con cura ed scartare il surnatante. Lavare le perline tre volte con tampone di lisi cellulare MP40 ghiacciato e due volte con tampone FLAG HA ghiacciato. Dopo il lavaggio finale, rimuovere accuratamente tutto il surnatante usando una pipetta ed eluire la proteina poli-ubiquitilata con 300 microgrammi per millilitro di peptide HA diluito sul tampone FLAG HA.Incubare le perle anti-HA di agarosio con peptide HA per un'ora a quattro gradi Celsius in una piattaforma shaker a dondolo. Quindi, abbassare le perline a 3.000 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con attenzione il surnatante contenente le proteine poli-ubiquitinate. Se necessario, conservare l'eluente in un microtubo fresco e pulito a meno 20 gradi Celsius.Risolvere gli eluenti e i lisati cellulari in 10% sodio dodecil solfato poliacrilammide gel elettroforesi e immunoblotting. Per eseguire un western blotting a trasferimento umido, posizionare il gel in un sandwich di trasferimento composto da carta da filtro, carta da filtro a membrana gel, ammortizzarlo con cuscinetti e premerlo insieme da una griglia di supporto. Quindi, posizionare questo sistema verticalmente in un serbatoio pieno di buffer di trasferimento tra elettrodi in acciaio inossidabile o filo di platino.Il trasferimento avviene per 90 minuti a 150 volt in un buffer di trasferimento bagnato. Infine, sondare la membrana immunoblot utilizzando anticorpi anti-myc. La poli-ubiquitilazione specifica di UXT-V2-HA mediata dalla proteina F-box 7 nelle cellule è stata osservata dopo aver sondato l'eluente dall'immunoprecipitazione anti-HA con un anticorpo anti-myc, che rileva il myc-ub coniugato al substrato.La specificità dell'anti-myc per il substrato poli-ubiquitilato è stata visualizzata nelle corsie uno e due, in cui uno striscio di proteine poli-ubiquitilate non è stato rilevato quando le cellule sono state co-trasfettate con la proteina F-box 7 e myc-ub in assenza di plasmide UXT-V2-HA. Inoltre, non è stato visualizzato alcuno striscio corrispondente alla poli-ubiquitinazione proteica nella combinazione di proteina F-box 7 e UXT-V2-HA senza il plasmide myc-ub. Quando un mutante 7 della proteina F-box wild-box a vettore vuoto o della proteina F-box 7 incapace di assemblare SCF attivo è stato transettato in combinazione con UXT-V2-HA e myc-ub, un forte segnale di striscio di UXT-V2 poli-ubiquitilato è stato osservato solo per la proteina F-box 7 wild-type, suggerendo che UXT-V2 era poli-ubiquitilato dal complesso SCF F-box protein 7 e cellule rispetto ai controlli.Le fasi di mono-precipitazione, compresa l'incubazione dei lisati cellulari con le perle equilibrate e l'eluizione di proteine immunoprecipitate sono essenziali per raggiungere l'obiettivo di questo protocollo. Dopo questa procedura, deve essere eseguito un test di ubiquitilazione in vitro per confermare la specificità dell'ubiquitilazione del substrato da parte della ligasi E3.

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Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in...

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Questo video dimostra il metodo in vitro per la SUMOilazione delle proteine del substrato utilizzando una cascata enzimatica sequenziale. Inoltre, lo stato SUMOilato della proteina viene identificato utilizzando l'elettroforesi e la tecnica dell'immunoblotting.

Saggio di SUMOilazione: una tecnica in vitro per rilevare lo stato di SUMOilazione delle proteine del substrato mediante immunoblotting

A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di presentare un profilo per gli studi biochimici e funzionali completi dei legamenti dell'ubiquitina E3 di tipo RING. Questa pipeline multifase, con protocolli dettagliati, convalida un'attività enzimatica della proteina testata e dimostra come collegare l'attività alla funzione.

Caratterizzazione funzionale di RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

L'ubiquitinazione è un regolatore critico delle funzioni intracellulari delle proteine. Qui descriviamo due metodi di lisi cellulare per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato nelle cellule dei mammiferi e confrontiamo la loro efficacia nell'analisi dei livelli di ubiquitinazione. La sovraespressione proteica nelle cellule di HEK293T è stata indotta tramite trasfezione transitoria, mentre proteine ubiquitinate sono state rilevate tramite analisi western blot.

Strategie comparative per il rilevamento dell'ubiquitinazione nei lisati cellulari di mammiferi utilizzando SMAD2/SMURF2 come modello

Questo protocollo descrive un metodo per ubiquitinare Streptococcus pneumoniae utilizzando lisato cellulare di mammifero o complesso enzimatico puro ubiquidina, seguito da un trattamento con complesso proteico purificato VCP/p97-UFD1-NPLOC4 per valutarne l'attività batteriolitica, consentendo lo studio degli effettori immunitari dipendenti da ubiquidina.

In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

Scopri come valutare l'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati di cellule di mammifero HEK293T. Questo metodo semplice aiuta a studiare le interazioni ligasi-sostrato in malattie come cancro e disturbi neurologici.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

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