Name: Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri la microscopia subcellulare intravivente per studiare il rimodellamento della membrana plasmatica durante la migrazione dei neutrofili nella pelle del topo. Questa tecnica consente di visualizzare in tempo reale le dinamiche cellulari.

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Questa ricerca è stata supportata dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nonostante decenni di progressi nel campo della migrazione cellulare e del rimodellamento della membrana, pochissimi studi hanno impiegato l'IVM per visualizzare le caratteristiche subcellulari negli animali vivi. Le procedure descritte in questo protocollo forniscono un potente strumento per ottenere nuove informazioni sulla migrazione dei neutrofili negli animali vivi e più specificamente sul rimodellamento della membrana plasmatica durante questo processo. Questo approccio rende possibile studiare la migrazione dei neutrofili in condizioni fisiologiche considerando la complessità intrinseca del microambiente tissutale. Infatti, l'uso del MPM consente la visualizzazione di molteplici caratteristiche all'interno del tessuto ospite utilizzando una combinazione di ceppi murini che esprimono marcatori fluorescenti selezionati, marcatura di tessuti esogeni, eccitazione della fluorescenza endogena e segnali generati attraverso SHG o THG 12,13.
Un potenziale problema da considerare in questa procedura è il fotodanneggiamento. Anche se il MPM è generalmente più sicuro della microscopia confocale per quanto riguarda il fotosbiancamento e la fototossicità, è necessario prestare attenzione quando si esegue l'imaging di tessuti vivi34. La fototossicità può ostacolare drasticamente i risultati creando artefatti di imaging che vanno da piccole macchie luminose ad aree più grandi di tessuto danneggiato o inibendo/stimolando una varietà di percorsi intracellulari. Per prevenire la fototossicità, la potenza del laser deve essere ridotta al minimo e devono essere progettati controlli appropriati per verificare che le condizioni fisiologiche siano mantenute (ad esempio, misurazione del flusso sanguigno, sonde per lo stress ossidativo)35,36. Inoltre, in questa specifica procedura, che coinvolge la pelle, i ceppi albini sono altamente raccomandati in quanto la melanina presente negli animali a pelo scuro è più sensibile alla fototossicità 36,37,38.
Tra i principali limiti della procedura ci sono il sistema di microscopio utilizzato e la natura dei neutrofili. Sebbene l'uso del MPM aumenti significativamente la profondità dell'imaging tissutale rispetto ad altre tecniche di microscopia ottica (ad esempio, confocale, disco rotante), la capacità di visualizzare le dinamiche subcellulari nell'orecchio è limitata agli strati più esterni del tessuto (80-100 μm). Ciò è dovuto all'intensa dispersione della luce prodotta dallo spesso strato ECM, che rende difficile studiare la migrazione negli strati più profondi. Un'altra limitazione è il fatto che i neutrofili hanno una vita molto breve e non possono essere conservati in coltura abbastanza a lungo per eseguire tecniche di editing genetico. Questo può essere superato ingegnerizzando i topi per produrre neutrofili privi di geni specifici o che ospitano mutazioni selezionate, il che ovviamente aumenta i costi e la durata della ricerca.
Le procedure qui descritte, sebbene progettate per studiare la dinamica della membrana, possono essere adattate per affrontare qualsiasi problema biologico cellulare non solo nei neutrofili ma anche in altri tipi di cellule immunitarie e cellule migratorie. Le informazioni raccolte attraverso l'IVM a basso ingrandimento sui comportamenti cellulari (ad esempio, fenotipo migratorio, velocità cellulare e direzionalità22) possono essere integrate e correlate con le informazioni meccanicistiche acquisite attraverso ISMic sul riposizionamento degli organelli, la secrezione proteica, l'endocitosi, la dinamica nucleare, la dinamica del calcio, l'organizzazione del citoscheletro e la netosi. L'uso di manipolazioni farmacologiche e/o genetiche può evidenziare il ruolo di specifiche vie molecolari nel processo di interesse, rendendo questo approccio unico e molto potente.

La migrazione cellulare diretta è un evento critico che si verifica durante diversi processi fisiologici e patologici, tra cui lo sviluppo, la risposta immunitaria, la riparazione dei tessuti e l'inizio, la progressione e la disseminazione del tumore 1,2. Questo processo si basa su specifici segnali chemiotattici extracellulari rilevati dai loro recettori affini sulla membrana plasmatica e poi trasdotti in intricati segnali intracellulari. Queste vie, a loro volta, attivano la migrazione cellulare attraverso una serie di risposte, tra cui l'attivazione locale del citoscheletro, il traffico e il rimodellamento della membrana e la polarizzazione cellulare3. Due tipi distinti di migrazione cellulare sono stati ben caratterizzati: mesenchimale e ameboide4. La migrazione mesenchimale è relativamente lenta (<1 μm/min), si basa su una forte adesione tra le cellule e la matrice extracellulare (ECM) e dipende dalla degradazione della matrice indotta dalle metalloproteasi. Al contrario, la migrazione ameboide, una caratteristica delle cellule immunitarie che rispondono rapidamente ai segnali infiammatori, è più veloce (>10 μm/min) e utilizza aderenze deboli per navigare attraverso la MEC. Indipendentemente dalla modalità, la migrazione cellulare richiede un costante rimodellamento della membrana plasmatica con conseguente generazione di strutture sporsive sul bordo anteriore delle cellule, che sono strettamente coordinate con la retrazione della membrana nella parte posteriore1.
Per svelare i meccanismi molecolari alla base di questi processi sub-cellulari, è fondamentale visualizzare la dinamica delle membrane nelle cellule in migrazione ad un'appropriata risoluzione temporale e spaziale. Inoltre, poiché il rimodellamento della membrana è fortemente influenzato dalle proprietà del microambiente tissutale che circonda le cellule migranti, è fondamentale visualizzare questo processo direttamente nel tessuto nativo, all'interno di animali vivi. Ciò si ottiene utilizzando la microscopia intravitale (IVM)5. Il primo imaging IVM è stato eseguito ~ 200 anni fa, quando lo stravaso dei leucociti è stato visualizzato utilizzando un semplice microscopio a trans-illuminazione6 e successivamente l'IVM è stato utilizzato principalmente su organismi modello semitrasparenti, come Zebrafish e Drosophila 7,8. Negli ultimi due decenni, l'IVM è stato utilizzato con successo per studiare i processi cellulari nei topi, nei ratti e nei mammiferi più grandi come i maiali 5,9. Ciò è stato reso possibile grazie a 1) sviluppi significativi nella microscopia confocale e multi-fotone (MP) e 2) all'aumento della tecnologia di editing genetico come CRISPR-Cas9, che ha permesso la rapida ingegnerizzazione di una varietà di modelli animali per esprimere proteine marcate in fluorescenza e reporter. Inoltre, la visualizzazione delle singole cellule e del loro microambiente durante processi come l'inizio del tumore, la migrazione cellulare e la risposta immunitaria è stata resa possibile sia da altre forme di marcature esogene, come l'introduzione sistemica di coloranti per marcare il sistema vascolare10,11, sia dall'eccitazione di molecole endogene, come il collagene attraverso la generazione di seconda armonica (SHG)10. 12 e fibre nervose attraverso la Generazione di Terza Armonica (THG)11,13. Infine, un miglioramento delle tecniche per minimizzare gli artefatti di movimento dovuti al battito cardiaco e alla respirazione ha portato allo sviluppo della microscopia subcellulare intravitale (ISMic), che ha permesso ai ricercatori di visualizzare e studiare diversi eventi subcellulari direttamente in animali vivi a un livello di risoluzione simile a quelli osservati in vitro 14,15,16,17 . Esempi di ISMic includono lo studio della dinamica del citoscheletro durante l'esocitosi 14,15,16,17 e l'endocitosi15, il rimodellamento dinamico del citoscheletro durante la migrazione cellulare17,18, la localizzazione e il metabolismo mitocondriale19,20 e la segnalazione del calcio nel cervello 21.
Questo protocollo descrive in dettaglio i diversi passaggi e procedure per studiare il rimodellamento della membrana cellulare a una risoluzione subcellulare durante la migrazione dei neutrofili nella pelle dell'orecchio di un topo vivo utilizzando ISMic. Questo approccio si basa sui protocolli22,23 precedentemente descritti e viene adattato per ottenere una maggiore risoluzione spaziale e temporale.

<table><tbody><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>ago da 27 G Kendall</td><td></td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>set per infusione alato da 27 G</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 30x</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1,05 NA, Obiettivo a immersione in olio di silicone</td></tr><tr><td>40x</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA, immersione in olio di silicone</td></tr><tr><td>Piastre da 60 mm</td><td>Siringa Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina (10 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi ACK</td><td>Qualità Biologico</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>AND</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 40 & micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Software di visualizzazione/analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Software Fluoview</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Software di acquisizione</td></tr><tr><td>FVB ceppo di topo</td><td>Jackson</td><td>N/A</td><td>FVB background</td></tr><tr><td>Sistema di anestesia gassosa</td><td>Patterson veterinario</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 modello</td></tr><tr><td>Green Cell tracker</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>Solubilizzato in DMSO per colture cellulari per raggiungere una concentrazione di 1 mM (1000x)</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td></td><td>Nair N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (senza Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td><td>Qualità Biologico</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A Software</td> di <td>visualizzazione/analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>generato in laboratorio</td><td>N/A C57BL</td><td>/6J sfondo</td></tr><tr><td>Micromanipolatore manuale</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>Software di analisi</td></tr><tr><td>ceppo di topo mtomato</td><td>generato in laboratorio</td><td>N/A</td><td>mT/mG, sfondo FVB</td></tr><tr><td>Laser multifotone</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Microscopio</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &; L siringa</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G ago</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore obiettivo</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore riscaldatore obiettivo</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore di ossigeno</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (senza Ca2+, Mg2+)Qualità</td> <td>Biologica</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Biologica</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore da palcoscenico</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Controllore da palco</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>Ipoallergenico</td></tr><tr><td>Cacciavite per siringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetti riscaldanti</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Pompa riscaldante</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

Lo studio del reclutamento e della funzione delle cellule immunitarie nei tessuti è stato un campo molto attivo negli ultimi due decenni. I neutrofili sono tra le prime cellule immunitarie a raggiungere il sito dell'infiammazione e a partecipare alla risposta immunitaria innata durante l'infezione o il danno tissutale. Finora, la migrazione dei neutrofili è stata visualizzata con successo utilizzando vari sistemi sperimentali in vitro basati sulla stimolazione uniforme, o sulla migrazione confinata sotto agarosio o canali microfluidici. Tuttavia, questi modelli non ricapitolano il complesso microambiente che i neutrofili incontrano in vivo. Lo sviluppo di tecniche basate sulla microscopia multifotone (MPM), come la microscopia subcellulare intravitale (ISMic), offre uno strumento unico per visualizzare e studiare la dinamica dei neutrofili a risoluzioni subcellulari in condizioni fisiologiche. In particolare, l'orecchio di un topo anestetizzato vivo fornisce un vantaggio sperimentale per seguire la migrazione interstiziale dei neutrofili in tempo reale grazie alla sua facilità di accessibilità e alla mancanza di esposizione chirurgica. ISMic fornisce la risoluzione ottica, la velocità e la profondità di acquisizione necessarie per tracciare i processi cellulari e, soprattutto, subcellulari in 3D nel tempo (4D). Inoltre, l'imaging multimodale del microambiente interstiziale (cioè vasi sanguigni, cellule residenti, matrice extracellulare) può essere facilmente realizzato utilizzando una combinazione di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti selezionati, marcatura esogena tramite sonde fluorescenti, fluorescenza intrinseca tissutale e segnali generati da seconda/terza armonica. Questo protocollo descrive 1) la preparazione dei neutrofili per il trasferimento adottivo nell'orecchio del topo, 2) diverse impostazioni per l'imaging subcellulare ottimale, 3) strategie per ridurre al minimo gli artefatti da movimento mantenendo una risposta fisiologica, 4) esempi di rimodellamento di membrana osservati nei neutrofili utilizzando ISMic e 5) un flusso di lavoro per l'analisi quantitativa del rimodellamento di membrana nei neutrofili in migrazione in vivo.

Qui, vengono presentati due diversi set di risultati per illustrare l'IVM classico e l'ISMic che forniscono rispettivamente una risoluzione cellulare e sub-cellulare. Nel primo esempio, i neutrofili sono stati purificati da un topo wild-type (WT), marcati con Cell Tracker Green per colorare il citoplasma e iniettati in un topo transgenico che esprime una proteina fluorescente che ha come bersaglio la membrana plasmatica (topo mTomato, noto anche come mT/mG33, Figura 1 e Movie 1 e Movie 2). Questo topo ricevente ha permesso la visualizzazione delle caratteristiche strutturali del tessuto dell'orecchio come i vasi sanguigni, le cellule residenti e i follicoli piliferi (Figura 1C e Filmato 1) tramite un approccio basato su IVM (passaggio 6.8.1). Le fibre di collagene, rivelate tramite SHG (rilevate a metà della lunghezza d'onda dell'eccitazione), erano disposte in una rete intricata nel derma, dove venivano iniettati i neutrofili. Lungo il bordo dei follicoli piliferi (HF), è stato osservato uno strato di cellule epiteliali (cioè cheratinociti). Occasionalmente, sono stati visualizzati artefatti da peli residui con conseguente depressione locale della pelle (H). Le lesioni indotte dal laser sono state facilmente visualizzate grazie alla loro forte autofluorescenza rilevata in tutti i canali e alle alterazioni della disposizione del collagene (Figura 1D). Una visione più completa dell'architettura 3D della pelle e della localizzazione dei neutrofili iniettati può essere apprezzata nel filmato 1, che ritrae una pila Z della pelle dagli strati esterni a quelli interni e un rendering del volume 3D. L'imaging time-lapse ha mostrato che i neutrofili campionavano la pelle dell'orecchio e interagivano con la ECM e il tessuto ospite (Filmato 2). L'imaging a questa risoluzione e l'acquisizione di uno stack Z ogni 30 s consentono di eseguire il tracciamento cellulare e la misurazione dei parametri di motilità (cioè velocità e direzionalità), ma un'analisi precisa e dettagliata del rimodellamento della membrana è impegnativa a questa risoluzione.
Nel secondo esempio, il rimodellamento della membrana è stato valutato tramite l'approccio ISMic (passaggio 6.8.2) utilizzando neutrofili che esprimono mGFP purificati da topi LyzM-cre mT/mG e iniettati in animali WT (Figura 2A, diagramma di flusso sperimentale). Utilizzando il protocollo ISMic (Filmato 3 e immagini fisse nella Figura 2B) e in caso di lesione laser, si osserva un rimodellamento dinamico della membrana plasmatica durante la migrazione e la formazione di sporgenze di membrana sul bordo anteriore e la retrazione della parte posteriore delle cellule sono chiaramente visualizzate (Figura 2 e Filmato 3). Le sequenze time-lapse evidenziate nel filmato 3 rivelano la complessità delle interazioni con l'ECM. Infatti, i neutrofili migravano attraverso lo spazio interstiziale muovendosi lungo le fibre o negli spazi tra di loro. Infine, per ogni punto temporale sono stati quantificati aspetti quantitativi come i cambiamenti di curvatura e i cambiamenti di area nella parte anteriore e posteriore delle celle. Utilizzando la cellula descritta nella Figura 2B come esempio, la dinamica locale della membrana plasmatica è stata analizzata utilizzando una pipeline di algoritmi (vedi passaggio 7) basata sull'identificazione di 100 punti di confine sottostanti la superficie cellulare (Figura 3A). Le variazioni della curvatura locale (Figura 3B) e dell'area sottolineata dalle sporgenze della membrana plasmatica (Figura 3C) sono state calcolate per ogni punto di confine e riportate per ogni intervallo di tempo come chimografi (Figura 3D, E). Sia la parte anteriore che quella posteriore delle celle mantengono una curvatura maggiore rispetto al lato delle celle (Figura 3D); Le variazioni negative dell'area (retrazioni, regioni blu) sono più evidenti nella parte posteriore delle celle che sul bordo anteriore, dove le variazioni positive dell'area sono più evidenti (sporgenze, regioni rosse) (Figura 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> Figura 1: IVM dei neutrofili nella pelle dell'orecchio del topo. (A) Disegno schematico dell'impostazione dell'orecchio sul tavolino del microscopio. (B) Diagramma di flusso sperimentale. (C) Immagine rappresentativa della pelle dell'orecchio di un topo mTomato iniettato con neutrofili marcati in fluorescenza, con diverse proiezioni. Follicolo pilifero (HF), vaso sanguigno (BV), epidermide (E), derma (D), strato di cellule basali (BCL) e artefatto dei capelli (a causa di un residuo di peli sulla superficie della pelle, H). (D) Immagine rappresentativa della pelle del topo dopo una lesione laser sterile: canale blu (a destra), canali verdi e rossi (al centro), immagine unita (a sinistra). La lesione è visibile a sinistra dell'immagine da una forte emissione di autofluorescenza in entrambi i canali verde e rosso, nonché da una rottura della ECM osservata dalla formazione di un foro nelle fibre di collagene-I. In C e D, Verde: neutrofili; Rosso: tessuto ospite di topo; Ciano: Collagene-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> Figura 2: Time-lapse della migrazione del neutrofilo mGFP in un orecchio di topo WT. (A) Diagramma di flusso sperimentale. (B) Immagini fisse rappresentative del filmato 3. (C) Rendering del volume della stessa cella per visualizzare l'organizzazione 3D della membrana. L'area dell'alta dinamica della membrana è illustrata da una freccia (rossa per la retrazione e blu per la protrusione). (D) Visualizzazione ravvicinata e inclinata del volume della cella renderizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> Figura 3: Pipeline di analisi per la quantificazione della dinamica di membrana raccolta utilizzando ISMic. (A) Determinazione del contorno cellulare e ripartizione dei punti di confine (100 punti di confine) tra due frame consecutivi per il neutrofilo mGFP descritto nella Figura 2B. (B) I contorni colorati rappresentano la curvatura locale della membrana determinata per ogni punto di contorno. (C) L'area locale cambia tra due fotogrammi consecutivi (corrente: blu e successivo: rosso). Le aree verdi rappresentano i risultati di tracciamento del movimento locale della membrana. Le frecce gialle indicano la direzione generale dello spostamento della membrana. (D) Chimografo della curvatura al contorno della cella nel tempo. L'asse verticale rappresenta gli indici dei punti di contorno, dove 1 e 100 rappresentano la parte posteriore della cella in base alla sua direzione di migrazione. (E) Chimografo a cambiamento di area locale che riflette la sporgenza della membrana (rosso) e la retrazione della membrana (blu) della cellula nel tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Filmato 1: Neutrofili marcati in verde visualizzati in un orecchio di topo mTomato utilizzando IVM. Rosso: tessuto di topo ospite mTomato. Ciano: Collagene-I SHG; Verde: neutrofilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 2: IVM di neutrofili che migrano nella pelle dell'orecchio di un topo mTomato. I video sono proiezioni di massima intensità di una pila di immagini acquisite per ͂27 min con un frame rate di 5 fotogrammi/s. Rosso: tessuto di topo ospite mTomato. Ciano: Collagene-I SHG; Verde: neutrofilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 3: ISMic del rimodellamento della membrana durante la migrazione dei neutrofili in un orecchio di topo WT. I video sono proiezioni di massima intensità di una pila di immagini acquisite per ͂8 min con una frequenza fotogrammi di 10 fotogrammi/s. Rosso: tessuto di topo ospite mTomato. Ciano: Collagene-I SHG; Verde: neutrofilo mGFP; Verde chiaro: neutrofilo reso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>

La migrazione dei neutrofili si basa sul rapido e continuo rimodellamento della membrana plasmatica in risposta al chemioattrattivo e alle sue interazioni con il microambiente extracellulare. Qui descritta è una procedura basata sulla microscopia subcellulare intravitale per studiare la dinamica del rimodellamento della membrana nei neutrofili iniettati nell'orecchio di topi anestetizzati.

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Questo metodo descrive una tecnica per studiare il rimodellamento della membrana durante la migrazione dei neutrofili nell'animale vivo utilizzando la microscopia subcellulare intravitale. Questo protocollo fornisce un approccio unico per studiare la dinamica della membrana durante la migrazione animale in condizioni fisiche e per non coinvolgere il microambiente tissutale. Questa tecnica può essere personalizzata per affrontare il rimodellamento della membrana e il riposizionamento dinamico degli organi del citoscheletro e il traffico di membrana in diversi tipi di cellule e cellule migratorie.Per iniziare, aggiungere il colorante fluorescente verde alla sospensione neutrofila, purificato dal topo wild-type in 1,5 millilitri di tubo rivestito di BSA. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente in un rotatore di provette. Somministrare tre lavaggi con HBSS, seguiti da centrifugazione a 400 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti e risospendere il pellet in un millilitro di soluzione salina bilanciata di Hanks.Posizionare questa sospensione nel tubo rivestito di BSA in un rotatore di tubi agitando delicatamente fino alla procedura di iniezione. Prima dell'iniezione, risospendere il pellet cellulare in soluzione salina per raggiungere una densità compresa tra 2 milioni e 5 milioni di cellule per 20 microlitri. Trasferisci l'animale anestetizzato su un cuscinetto riscaldante a 37 gradi Celsius per mantenere la sua temperatura corporea.Dopo aver testato il riflesso di ritiro della zampa, rimuovere i peli dall'orecchio utilizzando un rifinitore fine per ottimizzare la qualità dell'immagine. Posizionare l'animale su un fianco, tenere il bordo dell'orecchio e appiattirlo lungo il cuscinetto riscaldante utilizzando il nastro chirurgico, quindi riempire una siringa dotata di ago calibro 33 con la sospensione di neutrofili e montarla su un micromanipolatore. Muovi delicatamente l'ago verso l'orecchio e perfora lentamente la pelle.Una volta che l'ago è all'interno della pelle, spingere lentamente il pistone ed erogare due o tre microlitri di sospensione cellulare. Dopo aver ripetuto attentamente l'iniezione per due o tre diverse aree dell'orecchio, rimuovere con cura il nastro chirurgico e lasciare che l'animale riprenda conoscenza sotto supervisione. Lasciare riposare l'animale per un'ora prima dell'imaging per consentire al tessuto e alle cellule di riprendersi dalla procedura di iniezione.Assicurarsi che il microscopio sia acceso e che il tavolino e le lenti siano preriscaldati a 37 gradi Celsius prima di posizionare l'animale anestetizzato sul tavolino del microscopio. Copri il foro nel palco con un vetrino coprioggetti. Spostare con cautela l'animale anestetizzato sul tavolino.Se l'imaging è pianificato per più di un'ora, applicare l'unguento oftalmico e fissare il sistema di perfusione alato basato sull'infusione. Posizionare una goccia di soluzione salina al centro del vetrino coprioggetti e posizionare sopra di esso l'orecchio iniettato con neutrofili. Appiattire delicatamente l'orecchio utilizzando un batuffolo di cotone sterile al centro del vetrino coprioggetti per rimuovere le sacche d'aria.Fissa l'orecchio premendo delicatamente un bastoncino di legno sul lato dell'orecchio più vicino alla testa dell'animale e bloccandolo con del nastro adesivo. Quindi trova un'area di interesse utilizzando l'oculare del microscopio e passa alla modalità di acquisizione multi-fotone. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser da 900 a 930 nanometri per consentire l'acquisizione simultanea di colorante fluorescente verde, mTomato e collagene-I.Quindi impostare il set appropriato di specchi e combinazioni di filtri sui rilevatori per raccogliere la luce emessa. Determinare l'impostazione più appropriata per la configurazione hardware. Anche se le cellule in migrazione possono essere tracciate con intervalli da 30 secondi a un minuto, l'imaging degli eventi subcellulari con una velocità maggiore di almeno meno di dieci secondi.Nell'approccio classico della microscopia intravitale, utilizzare una lente 30X e uno scanner Galvo con una dimensione dell'immagine di 512 x 512 pixel per tracciare la migrazione cellulare e studiare il tessuto del topo ospite, e impostare lo spostamento dell'asse Z utilizzando il tavolino motorizzato con una dimensione del passo di due micrometri per consentire l'imaging di un volume profondo 30 micrometri ogni 30 secondi. Nell'approccio di microscopia subcellulare intravitale, utilizzare una lente 40X e uno scanner di risonanza con media tre volte per visualizzare il rimodellamento della membrana altamente dinamico a un ingrandimento e una risoluzione più elevati. È inoltre possibile impostare lo spostamento dell'asse Z utilizzando un piezo con una dimensione del passo di un micrometro, consentendo l'imaging di volumi profondi 20 micrometri ogni quattro o cinque secondi.Indurre una lesione laser sterile per innescare la migrazione dei neutrofili focalizzando un laser di eccitazione ad alta potenza su un'area ristretta di 20 per 20 micrometri per 10 secondi. Identificare le lesioni indotte dal laser dai suoi forti segnali autofluorescenti che appaiono in tutti i canali e dalla conseguente alterazione della disposizione del collagene. Salvare i dati al termine della sperimentazione per ulteriori analisi.Il topo ricevente ha permesso di visualizzare le caratteristiche strutturali del tessuto dell'orecchio come i vasi sanguigni, le cellule residenti e i follicoli piliferi tramite un approccio basato sulla microscopia intravitale. Le lesioni indotte dal laser sono state facilmente visualizzate grazie alla loro forte autofluorescenza rilevata in tutti i canali e alle alterazioni della disposizione del collagene. Una visione completa dell'architettura tridimensionale della pelle e della localizzazione dei neutrofili iniettati ritrae una pila Z della pelle dagli strati esterni a quelli interni IN una resa tridimensionale del volume.L'imaging time-lapse ha mostrato che i neutrofili campionavano la pelle dell'orecchio e interagivano con la matrice intracellulare e il tessuto ospite. Utilizzando la microscopia subcellulare intravitale, vengono chiaramente visualizzati il rimodellamento dinamico della membrana plasmatica durante la migrazione, la formazione di sporgenze di membrana sul bordo anteriore e la retrazione della parte posteriore delle cellule. Le sequenze time-lapse rivelano la complessità delle interazioni con la matrice intracellulare.La dinamica locale della membrana plasmatica è stata analizzata utilizzando un algoritmo basato sull'identificazione di 100 punti di confine sottostanti la superficie cellulare. Le variazioni della curvatura locale e dell'area sottolineata dalle sporgenze della membrana plasmatica sono state calcolate per ogni punto di confine e riportate per ogni intervallo di tempo come chimografi. Sia la parte anteriore che quella posteriore delle celle mantengono una curvatura maggiore rispetto al lato delle celle.Le variazioni negative dell'area sono più evidenti nella parte posteriore delle celle rispetto al bordo anteriore, dove le variazioni positive dell'area sono più evidenti. Dopo l'imaging, il tessuto può essere raccolto, fissato e processato per la colorazione per valutare ulteriormente il bersaglio di interesse e chiarire i meccanismi. Questa procedura progettata per l'imaging della dinamica della membrana può essere adattata per affrontare una questione più ampia di biologia cellulare in diversi tipi di cellule e cellule in migrazione nei rispettivi ambienti.

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Qui, descriviamo un non-invasiva a due fotoni (2P) approccio microscopia per lo studio dei leucociti homing nella zampa del mouse. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione dei tessuti di imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

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Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche (Video) | JoVE Journal

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

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