Valutazione di un biomarcatore affidabile in un modello murino di sepsi indotta da legatura cecale e puntura
9 dicembre 2022
Questo protocollo presenta i dettagli operativi della legatura e puntura cecale (CLP) in un modello murino di sepsi. Il CLP è una delle tecniche più utilizzate per creare un modello animale di sepsi. Pertanto, è necessario un protocollo CLP standardizzato per il raggiungimento di risultati di ricerca affidabili.
Lo scopo principale di questo studio è quello di utilizzare il modello murino di legatura cecale e sepsi indotta da puntura per valutare biomarcatori ematici affidabili della sepsi. La legatura e la puntura cecale, o CLP in breve, sono un modello clinicamente rilevante di sepsi. Il CLP è un modello comunemente usato nella ricerca sulla sepsi.
L'istone citrullinato H3, o CitH3, ha origine dalla NETosi indotta dalla sepsi. Il nostro studio precedente dimostra che CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi. Seleziona topi maschi C57BL / 6.
Pesare il topo e anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano all'1,5%. Fissare il mouse su una piastra riscaldante. Applicare la crema depilatoria sull'addome e lasciare per non più di un minuto prima di rimuovere la crema e i capelli.
Preparare strumenti chirurgici sterili adatti alla chirurgia degli animali roditori. Disinfettare la pelle addominale con iodio almeno tre volte. Coprire l'area chirurgica operatoria con il giusto panno chirurgico sterile.
Utilizzare forbici chirurgiche sterili per fare un'incisione di circa due centimetri nella parete addominale, lungo la linea alba. Identificare e isolare il cieco dalla cavità peritoneale con pinzette sterili. Ligate 75 volume del cieco con sutura di seta 4-0.
Non ligare i vasi sanguigni mesenterici. Da notare, una diversa percentuale di cieco legato determina la gravità della sepsi. Il 25% porta a una sepsi di basso grado, il 50% porta alla sepsi di medio grado e il 75% porta a una sepsi di alto grado.
Forare il cieco con una perforazione passante con un ago di calibro 21 nel punto medio tra l'estremità della coda e la legatura. Spremere delicatamente le feci dal cieco attraverso i fori di penetrazione. Da notare, la quantità di feci schiacciate nella cavità peritoneale dovrebbe essere coerente, poiché le feci determinano anche la gravità della sepsi.
Sostituire delicatamente il cieco e le feci nella cavità addominale. Chiudere lo strato muscolare addominale e lo strato di pelle con sutura di seta 6-0. Disinfettare l'incisione con iodio.
L'iniezione di ketoprofene, cinque milligrammi per chilogrammo, deve essere eseguita sul quadrante inferiore sinistro dell'addome per evitare il cieco. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante fino al completo recupero. Il topo è alloggiato in una stanza a temperatura controllata e ha libero accesso a cibo e acqua.
Gli animali saranno sottoposti a eutanasia per overdose di anidride carbonica con sintomi di sepsi, rilevanti per i nostri endpoint predefiniti sulla base del nostro studio presentato. I topi sono divisi casualmente nel gruppo sham, nel gruppo CLP e nel gruppo di trattamento CLP più Cl-amidina o YW3-56. I topi nel gruppo fittizio ricevono tutte le procedure CLP tranne la legatura e la puntura del cieco.
Prelevare il sangue periferico a 24 ore dopo l'intervento e preparare il siero mediante centrifugazione. La concentrazione di CitH3 è stata determinata mediante western blotting e un kit ELISA auto-sviluppato. Come mostrato nella figura due, nessun CitH3 è stato rilevato nel gruppo fittizio.
I livelli di CitH3 erano elevati dopo l'inserimento di CLP, che è stato attenuato dall'inibizione della PAD in modo significativo. Sulla base dei nostri dati, concludiamo che CitH3 circolante è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi.
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Panoramica
Questo protocollo presenta i dettagli operativi della legatura e puntura del cieco (CLP) in un modello murino di sepsi. La CLP è una delle tecniche più utilizzate per creare un modello animale di sepsi, rendendo necessario un protocollo standardizzato per ottenere risultati di ricerca affidabili.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ricerca sulla sepsi
Sfondo
- La legatura e puntura del cieco (CLP) è un modello clinicamente rilevante di sepsi.
- La CLP è comunemente utilizzata nella ricerca sulla sepsi.
- I biomarcatori affidabili sono essenziali per la diagnosi della sepsi.
- L'istone H3 citrullinato (CitH3) è associato alla NETosi indotta da sepsi.
Scopo dello studio
- Valutare biomarcatori ematici affidabili della sepsi utilizzando un modello murino.
- Stabilire un protocollo standardizzato di CLP per garantire coerenza nella ricerca.
- Indagare il potenziale diagnostico della CitH3 nella sepsi.
Metodi Utilizzati
- Selezione di topi maschi C57BL/6 per lo studio.
- Induzione della sepsi mediante legatura e puntura del ceco.
- Valutazione dei biomarcatori ematici dopo l'induzione.
- Confronto dei livelli di CitH3 per valutare l'affidabilità diagnostica.
Risultati principali
- Dimostrazione di CitH3 come biomarcatore diagnostico affidabile.
- Protocollo CLP standardizzato che fornisce risultati costanti.
- Identificazione della NETosi indotta da sepsi nel modello.
- Convalida del modello murino per future ricerche sulla sepsi.
Conclusioni
- Il modello CLP è efficace per lo studio della sepsi.
- CitH3 si rivela un biomarcatore promettente per la diagnosi della sepsi.
- I protocolli standardizzati aumentano l'affidabilità della ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I biomarcatori precoci affidabili sono fondamentali per ridurre i rischi nella scoperta di farmaci contro la sepsi e per garantire una continuità traslazionale dai modelli preclinici alla ricerca clinica. Il modello murino indotto da CLP, abbinato alla misurazione quantitativa di CitH3, fornisce una piattaforma standardizzata per la validazione degli obiettivi e l'analisi meccanicistica nella sepsi. Questo approccio sostiene la previsione e il triage del portafoglio in punti critici del percorso di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un rigoroso test delle ipotesi sulla fisiopatologia della sepsi mediante un modello animale clinicamente rilevante.
- Consente la validazione funzionale degli obiettivi quantificando CitH3 come biomarcatore meccanicistico della NETosi.
- Facilita la riduzione del rischio biologico e la selezione degli obiettivi candidati per ulteriori sviluppi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema riproducibile per valutare terapie sperimentali mirate ai meccanismi della sepsi.
- Standardizza la quantificazione dei biomarcatori mediante saggi ELISA e western blot validati per CitH3.
- Consente un confronto affidabile degli effetti delle interventi tra gruppi sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le risposte dei biomarcatori preclinici alle esigenze diagnostiche cliniche per la sepsi.
- Supporta la continuità dai risultati ottenuti nei modelli animali alle strategie traslazionali sui biomarcatori umani.
- Riduce il rischio traslazionale stabilendo endpoint robusti e pertinenti alla malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello e flusso di lavoro sui biomarcatori collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la validazione preclinica nella ricerca sulla sepsi.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi meccanicistiche e la chiarificazione dei percorsi coinvolti nella NETosi indotta da sepsi.
- Screening: Fornisce letture quantitative dell’H3 citrullinata per lo sviluppo standardizzato di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni riproducibili di biomarcatori per confrontare l’efficacia delle interazioni e la gravità della malattia.
- Ricerca traslazionale: Facilita l’allineamento dei dati preclinici sui biomarcatori con le strategie diagnostiche cliniche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per la ricerca continua sulla sepsi e la valutazione di terapie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi nel settore della sepsi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra gruppi di ricerca e studi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale, consentendo un triage precoce guidato da biomarcatori.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di programmi per la sepsi adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia animale, sviluppo di saggi per biomarcatori e analisi quantitative.
- Necessita dell'accesso a kit ELISA validati, infrastrutture per il western blotting e strutture animali standardizzate.
- Richiede una rigorosa standardizzazione intersettoriale delle variabili della procedura CLP e dei protocolli di misurazione dei biomarcatori.
- L'adattamento ad altri modelli di malattia o specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione e una validazione del protocollo.
- Le limitazioni includono la variabilità del modello legata alla tecnica chirurgica e la necessità di criteri di fine sperimentazione costanti.
