Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Questo protocollo fornisce una strategia vantaggiosa per arricchire le cellule staminali della ghiandola lacrimale per la rigenerazione e la ricostruzione della ghiandola lacrimale. Le cellule staminali della ghiandola lacrimale mostrano capacità di espansione a lungo termine e il potenziale di differenziazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il terreno di coltura per le cellule staminali della ghiandola lacrimale è privo di siero, il che mostra l'enorme valore per la riparazione della ghiandola lacrimale Inizia ottenendo un topo maschio BALB / c eutanasizzato da sei a otto settimane e tagliando la pelle dietro l'orecchio per esporre la ghiandola lacrimale e il tessuto connettivo intorno ad essa.

Staccare il tessuto connettivo mediante dissezione smussata con l'aiuto di una pinzetta e rimuovere la ghiandola lacrimale. Immergere le ghiandole lacrimali in un piatto di sei centimetri con quattro millilitri di etanolo al 75% per 10 secondi e risciacquare immediatamente con una soluzione PBS 10 millimolare due volte. Tagliare le ghiandole lacrimali in piccoli frammenti di circa un millimetro al cubo.

Trasferirli in un tubo sterile da 15 millilitri e trattare i tessuti con 500 microlitri da 25 unità per millilitro dispasi e 500 microlitri da 0,1% collagenasi I per un'ora a 37 gradi Celsius. Trattare i frammenti della ghiandola lacrimale con un millilitro di 0,05% di tripsina EDTA per 10 minuti a 37 gradi Celsius e dissociare i frammenti in singole cellule mediante pipettaggio ripetuto. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 70 micrometri, raccogliere il filtro in un tubo centrifugo sterile da 15 millilitri e centrifugare a 150 volte G per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, aggiungere 10 millilitri di soluzione PBS da 10 millimolari per lavare il pellet cellulare e centrifugare la sospensione a 150 volte G per cinque minuti. Ripetere il lavaggio del pellet cellulare. Quindi, rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di un rapporto 1: 1 di Dulbecco Modified Eagles Medium e F-12 di Ham per risospescere i pellet di cella.

Aggiungere 20 microlitri di matrice gel lacrimale ghiandola staminale matrice media al centro del pozzo di una piastra a 24 pozzetti. Utilizzare una punta della pipetta per espanderla in un cerchio di circa sei-otto millimetri di diametro e incubare la miscela per 20 minuti a 37 gradi Celsius per pre-rivestire il pozzo. Utilizzare un contatore di cellule per determinare il numero di cellule e aggiungere 40 microlitri di mezzo di cellule staminali della ghiandola lacrimale, o LGSCM, con un totale di 10.000 cellule in 40 microlitri del gel della matrice.

Mescolarli delicatamente con una pipetta. Utilizzare una pipetta per far cadere con cura 80 microlitri della miscela sull'area pre-rivestita in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Incubare la miscela per 20 minuti a 37 gradi Celsius e aggiungere 600 microlitri di LGSCM.

Cambia il terreno di coltura in ogni pozzo una volta ogni due giorni. Dopo sette giorni di cultura, cerca sfere LGSC che hanno un diametro da 100 a 300 micrometri al microscopio invertito. Utilizzare questo protocollo per isolare e coltivare cellule staminali primarie della ghiandola lacrimale di topi Rosa26 e NOD.

Dopo sette giorni di cultura, rimuovi bene il mezzo culturale dalla sfera della cultura. Disaggregare le sfere LGSC mediante incubazione in 20 microlitri di 10 unità per millilitro dispasi e 100 microlitri di PBS 10 millimolari per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 150 volte G per quattro minuti.

Rimuovere il surnatante. Trattare le sfere con un millilitro di 0,05% tripsina EDTA per cinque minuti a 37 gradi Celsius Aggiungere un millilitro di inibitore della tripsina allo 0,05% e pipettare ripetutamente per neutralizzare la tripsina e dissociare le sfere in singole cellule. Centrifugare a 150 volte G per cinque minuti e rimuovere il surnatante per pellettare le LGSC.

Aggiungere un millilitro di LGSCM per risospese il pellet di cellule staminali della ghiandola lacrimale e placcare le cellule come precedentemente dimostrato. Se si esegue la procedura uno, estendere il tempo di coltura delle LGSC da sette a 14 giorni con il sistema di coltura di cellule staminali della ghiandola lacrimale per la differenziazione casuale. Per la procedura due, modificare il rapporto tra il gel della matrice e LGSCM da 1: 1 a 1: 2 all'inizio della coltura di cellule staminali della ghiandola lacrimale per la differenziazione delle cellule duttali.

Seminare le cellule staminali della ghiandola lacrimale nella matrice per l'induzione per 14 giorni. Per la procedura tre, dopo il passaggio, sostituire LGSCM con LGSCM 10%FBS per la differenziazione delle cellule acinari. Indurre la differenziazione per 14 giorni.

Dopo una settimana di coltura, Kr14 e Ki67 sono stati espressi in tutte le sfere formate da cellule staminali della ghiandola lacrimale. Le sfere hanno raggiunto un diametro di 100 micrometri. La colorazione di ematossilina ed eosina ha mostrato cellularità al settimo giorno.

I fattori di arricchimento delle cellule staminali della ghiandola lacrimale ottenute dopo sette giorni di coltura primaria e sottocoltura indicavano che le cellule arricchite da questo metodo avevano una forte capacità proliferativa. In questo sistema, le cellule staminali della ghiandola lacrimale potrebbero essere passate oltre 40 volte e mantenere ancora le caratteristiche delle cellule staminali. Le cellule staminali della ghiandola lacrimale sono state indotte a formare più gemme dal siero bovino fetale e da una bassa percentuale di gel della matrice.

La colorazione di ematossilina ed eosina ha indicato che il siero bovino fetale potrebbe indurre le sfere a produrre più strutture cavitanti. Dopo l'iniezione ortotopica di cellule staminali della ghiandola lacrimale di Rosa nei topi NOD, si sono formati nuovi lobuli lacrimali adiacenti alle ghiandole lacrimali. La maggior parte dei lobuli erano composti da cellule acinari mature con alta espressione di AQP5 e c'era formazione di dotti intralobulari con bassa espressione di AQP5.

La quantità di secrezione lacrimale sul lato di iniezione delle cellule staminali della ghiandola lacrimale Rosa era superiore a quella sul lato di controllo, ma inferiore rispetto ai topi wild-type Il gel della matrice e la sua miscela correlata devono sempre essere tenuti sul ghiaccio prima dell'uso e il tubo e le punte del microcentrifuga a contatto con il gel della matrice devono essere pre-raffreddati. Il sistema fornisce un modello ideale per ulteriori studi sulle cellule staminali della ghiandola lacrimale, la riparazione della ghiandola lacrimale e lo screening farmacologico per le malattie della ghiandola lacrimale.