Name: Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Impara un metodo di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale. Questa tecnica consente l'espansione a lungo termine e la differenziazione in cellule acinari e duttali.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (n. 31871413) e da due programmi di scienza e tecnologia del Guangdong (2017B020230002 e 2016B030231001). Siamo davvero grati ai ricercatori che ci hanno aiutato durante lo studio e ai membri dello staff che lavorano nel centro animali per il loro supporto nella cura degli animali.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Esistono metodi consolidati per l'isolamento e la coltura in vitro di cellule staminali lacrimali per la coltura di cellule staminali lacrimali e la riparazione delle lesioni LG. Shatos et al.17 e Ackermannet al. 6 cellule staminali lacrimali coltivate e sottocoltate con successo di ratti e topi con metodi di coltura 2D, rispettivamente, rendendo possibile il trapianto di cellule staminali lacrimali per il trattamento di ADDED. Studi su cellule staminali<s...

Le cellule staminali della ghiandola lacrimale (LGSC) mantengono il rinnovamento cellulare della ghiandola lacrimale (LG) e sono la fonte delle cellule acinari e duttali. Pertanto, il trapianto di LGSC è considerato un approccio alternativo per il trattamento di gravi danni infiammatori e malattia dell'occhio secco carente di acqua (ADDED)1,2,3. Diversi metodi di coltura sono stati applicati per arricchire le LGSC. Tiwari et al. hanno separato e coltivato cellule LG primarie utilizzando collagene I e gel di matrice integrato con diversi fattori di crescita; tuttavia, le cellule LG non potevano essere coltivate continuamente4. Utilizzando la coltura bidimensionale (2D), le cellule staminali derivate da LG di topo sono state isolate da You et al.5 e Ackermann et al. 6, trovato per esprimere i geni marcatori delle cellule staminali / progenitrici, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e potrebbe essere sottocoltato. Tuttavia, non vi è alcuna chiara indicazione che queste cellule possano differenziarsi in cellule acinari o duttali e non esiste un esperimento di trapianto per verificare il potenziale di differenziazione in vivo.
Recentemente, le cellule c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- sono state isolate dagli LG di topo mediante citometria a flusso, hanno trovato per esprimere marcatori di cellule progenitrici LG, come Pax6 e Runx1, e differenziate in condotti e acini in vitro. Nei topi con ADDED, l'iniezione ortotopica con queste cellule potrebbe riparare gli LG danneggiati e ripristinare la funzione secretoria degli LG2. Tuttavia, il numero di cellule staminali isolate con questo metodo era piccolo e non ci sono condizioni di coltura adeguate per espandere le LGSC isolate. In sintesi, è necessario stabilire un sistema di coltura appropriato per isolare e coltivare efficacemente le LGSC adulte con un'espansione stabile e continua per lo studio delle LGSC nel trattamento dell'ADDED.
Gli organoidi derivati da cellule staminali o cellule staminali pluripotenti sono un gruppo di cellule che sono istologicamente simili agli organi correlati e possono mantenere il proprio rinnovamento. Dopo che l'organoide intestinale di topo è stato coltivato con successo da Sato et al. nel 20097, gli organoidi di altri organi sono stati coltivati in successione, sulla base del sistema di coltura di Sato, come la cistifellea8, il fegato9, il pancreas10, lo stomaco11, il seno12, il polmone13, la prostata14 e la ghiandola salivare15 . A causa dell'elevata percentuale di cellule staminali adulte prima della differenziazione cellulare in coltura di organoidi, il metodo di coltura organoide tridimensionale (3D) è considerato ottimale per l'isolamento e la coltura di cellule staminali adulte di LG.
Nel presente studio è stato istituito un sistema di coltura LGSC per topi adulti ottimizzando il metodo di coltura 3D senza siero. È dimostrato che le LGSC coltivate da topi sia normali che AGGIUNTI hanno mostrato una capacità stabile di auto-rinnovamento e proliferazione. Dopo il trapianto nei LG di topo AGGIUNTI, le LGSC hanno colonizzato i LG compromessi e migliorato la produzione di lacrime. Inoltre, le LGSC fluorescenti rosse sono state isolate da topi ROSA26mT/mG e coltivate. Questo lavoro fornisce un riferimento affidabile per l'arricchimento LGSC in vitro e l'autoinnesto LGSC in applicazione clinica per la terapia ADDED.

<table><tbody><tr><td>Animal (Mouse)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>Model Animal Research Center dell'Università</td><td></td><td></td>di Nanchino</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Laboratory Animal Center dell'Università</td><td></td><td></td>Sun Yat-sen</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Model Animal Research Center dell'Università</td><td></td><td></td>di Nanjing</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Modello Animal Research Center dell'Università</td><td></td><td></td> di Nanchino</tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore automatico</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio del sangue</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore CO2 a temperatura costante</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Gel sistema di imaging</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno elettrico per bagnomaria</td><td>Tecnologia Yiheng Apparecchio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per elettroforesi</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento di PCR quantitativa a fluorescenza</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice per tessuti congelati</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga orizzontale</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertita</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser micrografo a scansione lamellare</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di azoto liquido</td><td>Thermo Bassa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>temperatura alta centrifuga di velocità</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spettrofotometro ultravioletto</td><td>Thermo</td><td>misura della concentrazione</td><td></td>di RNA</tr><tr><td>Affettatrice per paraffina</td><td>Amplificatore Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tester di pH</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Frigorifero</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscillatore termostatico di coltura</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento di inclusione in paraffina tissutale</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg; C Frigorifero a bassissima temperatura</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&deg; C Frigorifero a bassissima temperatura</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua ultra pura</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Experiment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodio</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Siero Bovino Fetale</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Umano FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Matrix gel)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Noggin murino</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>EGF murino</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondina 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Derivato da Glycine max; può inibire la tripsina, la chimotripsina e la plasminasi in misura minore. Un mg inibisce 1,0-3,0 mg di tripsina.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td> T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049<</td><td></td></tr><tr><td>strong>HE colorazione & Immunocolorazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-Topo IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>Diluizione usata: IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 0,2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21206</td><td>Diluizione usata: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 asino anti-Topo IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>Diluizione usata: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 asino anti-Coniglio IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10042</td><td>Diluizione usata: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 4 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo di coniglio anti-AQP5</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Diluizione utilizzata: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 0,1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-E-caderina Anticorpo di ratto</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Diluizione utilizzata: (IF)&nbsp; 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo di coniglio anti-cheratina14</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Diluizione utilizzata: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo di coniglio Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Diluizione utilizzata: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo di topo Anti-mCherry</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Diluizione utilizzata: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mCherry rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>Diluizione utilizzata: (IF)&nbsp; 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>Kit DAB (20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>Montaggio fluorescente Medio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>Capra anticorpo IgG di topo (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Diluizione usata: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG di capra anti-coniglio (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>Diluizione utilizzata: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel (Idrogel incorporante)</td><td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Guangzhou Chimica</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno al 30%</td><td>Chimica Guangzhou</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Chimica Guangzhou</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>Balsamo neutro</td><td>SHANGHAI YYYANG</td><td>YY-Balsamo</td><td></td>neutro</tr><tr><td>Siero di capra non immunizzato</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Guangzhou Chimica</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio tribasico diidrato</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Guangzhou Chimica</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. Composto</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Tritone X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Guangzhou Chimica</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Alcool</td><td>Guangzhou Chimica</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Guangzhou Chimica</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Guangzhou Chimica</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Verde I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA polimerasi</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (acido nucleico macchia)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>Vector Costruzione & Trasfezione cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td> OXID-Ampicillina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione plasmidico senza endotossine</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 Plasmide Kit di Trasfezione</td><td>Kit</td> di Reazione Thermo <td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR</td><td>Kit</td><td></td> di Estrazione Plasmidi Thermo 11791019 <td></td></tr><tr><td></td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5&alpha; Cellula chimicamente competente</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td></td> <td>OXID OXID-strong</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>OXID</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Primers e Sequenza</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCCTCTCTCTCTCTCT><CTCTT Synbio</td><td>Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequenza: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 lentivirus vettore a vuoto</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Xiaofeng Qin laboratory, Università</td><td></td><td></td> Sun Yat-sen</tr></tbody></table>

sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

La terapia a base di cellule staminali della ghiandola lacrimale (LG) è una strategia promettente per le malattie della ghiandola lacrimale. Tuttavia, la mancanza di un metodo di coltura affidabile e privo di siero per ottenere un numero sufficiente di cellule staminali LG (LGSC) è un ostacolo per ulteriori ricerche e applicazioni. Il metodo di coltura tridimensionale (3D), privo di siero per le LGSC di topo adulto è ben consolidato e mostrato qui. Le LGSC potrebbero essere continuamente passate e indotte a differenziarsi in cellule acinari o duttali.
Per la coltura primaria LGSC, gli LG di topi di 6-8 settimane sono stati digeriti con dispasi, collagenasi I e tripsina-EDTA. Un totale di 1 × 104 cellule singole sono state seminate in 80 μL di matrice di matrice di cellule staminali della ghiandola gel-lacrimale (LGSCM) in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, preclusa con 20 μL di matrice gel-LGSCM della matrice. La miscela è stata solidificata dopo l'incubazione per 20 minuti a 37 °C e sono stati aggiunti 600 μL di LGSCM.
Per il mantenimento della LGSC, le LGSC coltivate per 7 giorni sono state disaggregate in singole cellule mediante dispasi e tripsina-EDTA. Le singole cellule sono state impiantate e coltivate secondo il metodo utilizzato nella coltura primaria LGSC. Le LGSC potrebbero essere passate oltre 40 volte ed esprimere continuamente marcatori di cellule staminali/progenitrici Krt14, Krt5, P63 e nestin. Le LGSC coltivate in LGSCM hanno capacità di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in cellule acinari o duttali in vitro e in vivo.

Stabilire un sistema di coltura 3D privo di siero In questo studio, È stato sviluppato LGSCM contenente EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 per LGSC di topo e le LGSC sono state isolate e coltivate con successo con un metodo di coltura 3D (Figura 1A). Un sistema di coltura 3D 3D privo di siero di successo di LGSC da topi C57BL / 6, topi NOD / ShiLtJ, topi BALB / c e topi ROSA26mT / mG è stato stabilito utilizzando questo metodo16. Per un topo ma...

Il metodo di coltura tridimensionale privo di siero per le cellule staminali adulte della ghiandola lacrimale (LG) è ben consolidato per l'induzione della formazione di organoidi LG e la differenziazione in cellule acinari o duttali.

Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Questo protocollo fornisce una strategia vantaggiosa per arricchire le cellule staminali della ghiandola lacrimale per la rigenerazione e la ricostruzione della ghiandola lacrimale. Le cellule staminali della ghiandola lacrimale mostrano capacità di espansione a lungo termine e il potenziale di differenziazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il terreno di coltura per le cellule staminali della ghiandola lacrimale è privo di siero, il che mostra l'enorme valore per la riparazione della ghiandola lacrimale Inizia ottenendo un topo maschio BALB / c eutanasizzato da sei a otto settimane e tagliando la pelle dietro l'orecchio per esporre la ghiandola lacrimale e il tessuto connettivo intorno ad essa.Staccare il tessuto connettivo mediante dissezione smussata con l'aiuto di una pinzetta e rimuovere la ghiandola lacrimale. Immergere le ghiandole lacrimali in un piatto di sei centimetri con quattro millilitri di etanolo al 75% per 10 secondi e risciacquare immediatamente con una soluzione PBS 10 millimolare due volte. Tagliare le ghiandole lacrimali in piccoli frammenti di circa un millimetro al cubo.Trasferirli in un tubo sterile da 15 millilitri e trattare i tessuti con

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

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Biologia

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

La ghiandola lacrimale (LG) è un organo di ramificazione che produce i componenti acquose di lacrime necessarie per il mantenimento della visione e la salute oculare. Qui si descrive murino LG dissezione ed ex vivo le tecniche di coltura di decifrare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di LG.

Manipolare il murino Ghiandola lacrimale

Qui viene riportato un protocollo per sviluppare un sistema tridimensionale (3-D) da cellule staminali pluripotenziali umane (hiPSCs) chiamate il corpo embrionale libero (SFEB) serico. Questo modello di 3-D può essere utilizzato come una cultura di fetta organotipica per modellare lo sviluppo corticale umano e per l'interrogatorio fisiologico dei circuiti neurali in via di sviluppo.

Sviluppare corpi embrioni liberi del siero derivato da HiPSC per l&#39;interrogazione di colture a cellule staminali a 3 dosi utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti

Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.

Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo descrive come stabilire, mantenere, modificare geneticamente, differenziare, caratterizzare funzionalmente e trapiantare organoidi della ghiandola lacrimale derivati da topi primari e tessuti umani.

Istituzione, mantenimento, differenziazione, manipolazione genetica e trapianto di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana

Qui, presentiamo un protocollo che dimostra l'uso dell'idrogel come struttura di coltura cellulare tridimensionale (3D) per la coltura di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) e introduciamo la fotobiomodulazione (PBM) per migliorare la proliferazione di ADSC all'interno dell'ambiente di coltura 3D.

Colture cellulari tridimensionali di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo in un idrogel con aumento della fotobiomodulazione

Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per dissociare ghiandole lacrimali di topo invecchiati al fine di ottenere singole cellule vitali per il sequenziamento di RNA a singola cellula. La digestione enzimatica sequenziale e la gestione delicata preservano l'integrità cellulare, fornendo sospensioni di alta qualità adatte all'isolamento specifico per tipo cellulare e all'analisi trastrascrittomica dei cambiamenti associati all'invecchiamento nelle popolazioni di ghiandole lacrimali.

Protocollo per la dissociazione a singola cellula, sequenziamento dell'RNA e isolamento delle cellule mioepiteliali e dei fibroblasti dalle ghiandole lacrimali e salivari invecchiate

Descriviamo un chip basato su piattaforma per il tridimensionale coltura di cellule in micro-bioreattori. Un chip in grado di ospitare fino a 10 milioni. cellule che possono essere coltivate in condizioni ben definite in relazione al flusso del fluido, tensione ecc ossigeno in una sterile, la circolazione ad anello chiuso.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

Umano lisato piastrinico è una ricca fonte di fattori di crescita e di un supplemento potente nelle cellule in coltura. Questo protocollo presenta il processo di preparazione di un ampio pool di lisato piastrinico umano partendo da plasma ricco di piastrine, eseguendo numerosi cicli di gelo-disgelo e riducono i frammenti delle piastrine.

Preparazione del pool lisato piastrinico umani (pHPL) come supplemento efficiente per animali siero-Free Culture sulle cellule staminali umane

Impara un metodo di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale. Questa tecnica consente l'espansione a lungo termine e la differenziazione in cellule acinari e duttali.

Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

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