Name: Assorbimento della dose dellesposizione a composti a base di platino e rutenio in Zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Scopri come quantificare l'assorbimento di metalli in Danio rerio mediante ICP-MS su tessuto digerito. Questa tecnica supera i limiti dell'esposizione acquosa sconosciuta per studi tossicologici.

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Finanziamento: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Inoltre, Brittany Karas è supportata dalla borsa di formazione T32NS115700 di NINDS, NIH. Gli autori riconoscono Andreia Valente e la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) per la fornitura di PMC79.

Il pesce zebra del ceppo AB (Danio rerio) è stato utilizzato per tutti gli esperimenti (vedi la Tabella dei materiali) e il protocollo di allevamento (# 08-025) è stato approvato dal Comitato per la cura e le strutture degli animali della Rutgers University.
1. Allevamento di pesci zebra
<ol><li>Allevare e mantenere il pesce zebra in un sistema di habitat acquatico a ricircolo su un ciclo buio di 14 ore di luce: 10 ore.<ol>
<li>Purificare l'acqua del rubinetto comunale attraverso la filtrazione a sabbia e carbone per ottenere acqua del sistema ittico. Mantenere l'acqua del sistema acquatico a 28 °C, < 0,05 ppm di nitrito, <0,2 ppm di ammoniaca e pH compreso tra 7,2 e 7,7.</li>
		<li>Dai da mangiare al pesce zebra una dieta di cisti di Artemia tratteggiate, gamberetti in salamoia e cibo in scaglie di pesce.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protocollo dose-risposta zebrafish (Figura 1)
<ol><li>Preparare la soluzione di acqua all'uovo di zebrafish, e acqua media E3 o acqua di uova a base di sale marino stock ad una concentrazione di 60 μg/ mL disciolta in acqua deionizzata18. Evitare l'uso del blu di metilene. NOTA: Attraverso iCPMS, è stata identificata l'interferenza isobarica dell'acqua dell'uovo di zebrafish per gli ossidi di stronzio, che si sovrapponevano a un isotopo del rutenio. Un attento risciacquo delle larve prima dell'analisi a valle ha migliorato questo problema. Il mezzo E3 può essere una scelta più facile per alcuni a causa della composizione proprietaria dei sali marini commerciali.</li>
	<li>Sciogliere il metallo o i composti a base di metallo in E3 o acqua di uovo. Vortice per rompere qualsiasi materiale aggregato e omogeneizzare la soluzione. NOTA: Nell'esperimento descritto di seguito, PMC79 e cisplatino sono stati disciolti a concentrazioni massime di 12,4 mg / L e 60 mg / L con una concentrazione massima dello 0,5% di dimetilsolfossido (DMSO) per resistere alle precipitazioni.<ol>
<li>Diluire i metalli pesanti o i composti a base di metalli, come PMC79 e cisplatino, con E3 o acqua di uova, preparando almeno 5 dosi di concentrazione.<ol>
<li>Iniziare con basse concentrazioni di soluzioni stock in veicoli puri (ad esempio, DMSO), quindi diluire con E3 o acqua di uova. Considerare attentamente le concentrazioni finali del veicolo. NOTA: alcuni composti a base di metalli, come il cisplatino, si degradano rapidamente e le loro soluzioni devono essere rese fresche ogni giorno. ATTENZIONE: Maneggiare con cura metalli pesanti e chemioterapici. Rivedere la scheda di dati di sicurezza dei materiali specifici (MSDS) per il metallo di interesse. Il cisplatino può causare irritazione agli occhi e alla pelle, essere fatale se ingerito e può causare tossicità nei reni, nel sangue, negli organi che formano il sangue e nel tessuto fetale. Evitare di respirare fumi e contatto con occhi, pelle e vestiti. Indossare guanti e indumenti impermeabili e occhiali di sicurezza o occhiali19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Allestire vasche di riproduzione il pomeriggio prima dell'esperimento nel rapporto ideale di 2 femmine per 1 maschio con un divisore in posizione tra i sessi20.<ol>
<li>Tirare il divisorio quando le luci si accendono per il ciclo mattutino.</li>
		<li>Lascia che il pesce zebra si riproduca. NOTA: Il periodo di tempo per la riproduzione dipende dalla fase iniziale di esposizione richiesta. Per 3 ore di postfertilizzazione, consentire l'allevamento per circa 2 ore. Le uova raggiungeranno i 3 hpf dopo la pulizia e la segregazione delle uova.</li>
		<li>Spostare il pesce da riproduzione in un serbatoio pulito.</li>
		<li>Raccogliere le uova versando l'acqua del serbatoio attraverso un colino.</li>
		<li>Capovolgere il colino su una capsula di Petri e utilizzare una bottiglia di schizzo piena di acqua E3 o uovo per sciacquare le uova nel piatto.</li>
		<li>Pulire il piatto di cibo e rifiuti prima dell'uso sperimentale.</li>
	</ol></li>
	<li>Randomizzare circa venti embrioni da 3 hpf per dose in singole fiale di vetro utilizzando una pipetta di trasferimento e una piccola quantità di acqua.</li>
	<li>Dopo che tutti gli embrioni sono in fiale, rimuovere tutta l'acqua dell'uovo e sostituire con una soluzione dosatrice sufficiente in modo che ci sia circa 1 pollice di soluzione sopra l'altezza dell'uovo. NOTA: La necessità della deconionezione deve essere attentamente considerata. Vedere la sezione di discussione per maggiori dettagli.</li>
	<li>Osservare gli embrioni ogni giorno per lesioni o letalità. A causa del rapido sviluppo del pesce zebra embrionale, ottenere immagini giornaliere utilizzando qualsiasi microscopio a campo luminoso / configurazione della fotocamera per identificare lesioni minori tra i giorni.</li>
	<li>Al termine della risposta alla dose (4-5 giorni dopo la fecondazione [dpf], secondo le linee guida21 dell'Organizzazione per la Cooperazione e lo Sviluppo Economico [OCSE], combinare 3-5 larve prima dell'eutanasia per il campionamento composito. Eutanasia mediante raffreddamento rapido mediante congelamento a scatto in azoto liquido. NOTA: L'eutanasia attraverso un sovradosaggio di MS-222 o tricaina metanosolfonato può potenzialmente interferire con l'analisi ICPMS a valle. I metodi di eutanasia a raffreddamento rapido sono incoraggiati per questo protocollo per ridurre la possibilità di interferenze.</li>
	<li>Condurre 3 lavaggi di tessuto con acqua ad alta purezza (come l'osmosi inversa) per rimuovere il composto in eccesso dall'esterno del tessuto.</li>
	<li>Spostare i campioni in tubi centrifughi in polipropilene da 15 mL sicuri per acidi e microonde. Fare attenzione a rimuovere tutta l'acqua in eccesso poiché qualsiasi liquido rimanente può diluire l'acido nitrico e, quindi, il potenziale ossidante dell'acido durante la degradazione dei tessuti. NOTA: A questo punto, il tessuto può essere conservato a -20 °C fino a ulteriori analisi. Per i metalli naturalmente abbondanti, la pulizia dei tubi in un bagno di acido nitrico al 5% prima dell'uso migliorerà i livelli di fondo ambientali.</li>
</ol>3. Digestione dei tessuti e valutazione ICPMS (Figura 2)
<ol><li>Aggiungere circa 0,25 ml ai tubi della centrifuga in polipropilene da 15 mL per un massimo di 10 larve (~100 μg) di acido nitrico ad alta purezza (69%). Ultrasuoni per 1 ora per predigerizzare i campioni utilizzando le seguenti impostazioni: uscita bagno ad ultrasuoni: 85 W; 42 kHz ± 6%; intervallo di temperatura: 19-27 °C. ATTENZIONE: Indossare protezioni per le orecchie durante la sonicazione. L'acido nitrico provoca gravi ustioni alle vie respiratorie, agli occhi e alla pelle. Indossare dispositivi di protezione completi e lavorare nella cappa aspirante o in luoghi con adeguata ventilazione. Può essere infiammabile con altri materiali. L'acido nitrico deve essere maneggiato esclusivamente in una cappa aspirante per evitare l'esposizione ai vapori prodotti durante la digestione. Non inalare o ingerire.<ol>
<li>Eseguire brevi cicli di digestione dei tessuti (intervalli di 5 minuti) in un digestore a microonde sicuro per gli acidi fino a quando tutto il tessuto è visibilmente ossidato (cioè una soluzione uniforme, giallo chiaro). NOTA: si consiglia di eseguire il protocollo a microonde nella Tabella 1 tre volte e include un intervallo di raffreddamento di 5 minuti tra ogni fase di riscaldamento.</li>
		<li>Monitorare attentamente l'integrità dei tubi per evitare rotture e condurre brevi giri nella centrifuga (313 × g per 1 min) tra i cicli per spostare la condensa acida sul fondo del tubo. NOTA: Se il tessuto è difficile da digerire (in particolare i cori), il 30% di perossido di idrogeno ad alta purezza può essere utilizzato dopo la digestione acida. Utilizzare il perossido di idrogeno (6,75 ml) per diluire la concentrazione di acido al 3,5% e consentire ai campioni di sedersi durante la notte in una cappa aspirante. Il perossido di idrogeno si decompone a H2O ed è adatto per l'analisi ICPMS. Inoltre, i metalli alternativi possono dissolversi meglio nell'acido cloridrico o in una miscela di acido cloridrico e acido nitrico (cioè aqua regia). Il perossido di idrogeno è dannoso se ingerito e provoca gravi danni agli occhi. Indossare la protezione della pelle e degli occhi22,23.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta che il tessuto è visibilmente ossidato (cioè una soluzione uniforme, giallo chiaro), diluire i campioni in una cappa aspirante al 3,5% di acido nitrico usando 6,75 ml di acqua ad alta purezza e vortice per mescolare accuratamente. NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente. Questo passaggio non è necessario se il perossido di idrogeno è stato aggiunto per aiutare la digestione nel passaggio 3.1.</li>
	<li>Condurre una curva di calibrazione a 7 punti abbinata alla matrice (intervallo di concentrazione di 0,001-10 ppb) utilizzando uno standard elementare certificato (ad esempio, Pt o Ru, a seconda del test) con il metallo di interesse e isotopi ottimali per tenere conto di eventuali potenziali interferenze isobariche.<ol>
<li>Utilizzando una concentrazione di riserva dello standard elementare acquoso e certificato (Ru, Pt = 1000 ppb), prelevare un'aliquota e un pipetto da 0,1 mL in un nuovo tubo centrifugo da 15 mL. Diluire con acido nitrico al 3,5% fino a un volume finale di 10 ml per produrre una soluzione standard da 10 ppb.</li>
		<li>Utilizzando lo stock da 10 ppb, effettuare le seguenti diluizioni seriali: soluzioni standard da 0,1, 1,0 e 5,0 ppb in acido nitrico al 3,5%.</li>
		<li>Utilizzando lo stock 0.1, effettuare le seguenti diluizioni seriali: 0,001, 0,005 e 0,01 ppb soluzioni standard in acido nitrico al 3,5%.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare lo strumento ICPMS (vedere il Tabella dei materiali) per l'analisi del campione come segue:<ol><li>Prima di avviare lo strumento, assicurarsi che la valvola del gas Argon sia aperta, che tutti i tubi siano collegati saldamente e che l'acido nitrico pulito al 5% sia aperto per il risciacquo di tubi e bicchieri tra le analisi dei campioni.</li>
		<li>Controllare le condizioni della torcia e dei coni e assicurarsi che la scatola della torcia sia saldamente bloccata e che il tubo di drenaggio della camera di spruzzatura sia collegato correttamente alla peripompa.</li>
		<li>Aprire il software (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Controllare le letture del vuoto e assicurarsi che tutte le turbopompe funzionino al 100%.</li>
		<li>Fare clic su START nella finestra Stato del sistema di controllo al plasma per avviare la sequenza di avvio, accendere la pompa al plasma, il refrigeratore al plasma, eliminare il nebulizzatore e accendere il plasma. Attendere che il plasma sia acceso e stabile quando la finestra di stato indicherà che la sequenza di avvio è completa. A questo punto, osserva i punti verdi nella finestra Stato del sistema che indicano che tutti gli alimentatori sono accesi.</li>
		<li>Nella barra dei menu, fai clic su Controlla |ampionatore automatico nel menu a discesa. Inserire la posizione del rack dell'autocampionatore per il tubo contenente il 5% di acido nitrico. Lasciare che l'acido entri nel plasma.</li>
		<li>Nella barra dei menu, fare clic su Scansioni | Magnete nel menu a discesa. Nella finestra MagnetScan , digitare 115 nella posizione di massa del marcatore e fare clic su Invio. Consentire al magnete di eseguire la scansione in tutto l'intervallo di massa per 115in (da 114,6083 a 115,3749) per 30 minuti mentre lo strumento si riscalda.</li>
		<li>Dopo 30 minuti, utilizzare il controllo dell'autocampionatore per spostarsi nella posizione di una soluzione di sintonizzazione multielemento da 1 ppb. Aspirare la soluzione di accordatura e sintonizzare lo strumento per ottimizzare la lettura del segnale. Regolare la posizione della torcia (X, Y, Z) in modo che la torcia sia allineata con il centro dei coni e la portata del nebulizzatore (~ 30 psi) nella finestra di controllo al plasma . Effettuare le regolazioni necessarie nella finestra Sintonizzazione ottica ionica per sorgente, rilevatore e analizzatore.</li>
		<li>Una volta ottimizzata la lettura del segnale (~1,2 × 106 conteggi/s per 1 ppb su 115In), fare clic su Stop nella finestra Scansione magnete .<ol>
<li>Fare clic su Calibra magnete e selezionare Bassa risoluzione nella finestra popup.</li>
			<li>Fare clic su OK e aprire il file "Calibrazione di massa (bassa risoluzione).smc" per calibrare il magnete. NOTA: la calibrazione del magnete misurerà i conteggi e calpesterà una curva attraverso il seguente intervallo di massa: da 7Li a 238U.</li>
			<li>Fai clic su Salva | Utilizzare per applicare la calibrazione del magnete corrente alle analisi. Se si misurano campioni sconosciuti con una vasta gamma di concentrazioni, eseguire una calibrazione del rilevatore per confrontare i segnali di conteggio degli impulsi ionici a basse concentrazioni con segnali ionici attenuati prodotti a concentrazioni più elevate. Analizzare i campioni una volta completata la messa a punto e la calibrazione.</li>
		</ol></li>
		<li>Nella barra dei menu, fare clic su Acquisizione dati.<ol>
<li>Fare clic su Impostazione metodo nel menu a discesa. Utilizzare un metodo esistente fornito dal produttore o creare un metodo basato sugli elementi di interesse. Se necessario, regolare la modalità di analisi, il tempo di permanenza, il ritardo dell'interruttore, il numero di sweep/cicli, la risoluzione, la modalità di rilevamento e la massa del parco per le impostazioni del deflettore.</li>
			<li>Fare clic su Salva per registrare le impostazioni del metodo. Ottimizzare i parametri per ogni metallo e isotopo. Vedere la Tabella 2 per i parametri operativi specifici utilizzati in questo studio.</li>
		</ol></li>
		<li>Nella barra dei menu, fare clic su Acquisizione dati.<ol>
<li>Fare clic su Esecuzione batch nel menu a discesa. In alternativa, fare clic sull'icona BATCH sotto la barra dei menu. Importare i parametri batch da un foglio di calcolo o creare una sequenza nella finestra Esecuzione batch . Immettere il tipo di campione, la posizione del rack dell'autocampionatore, il tempo di trasferimento, il tempo di lavaggio, le repliche, l'ID campione e il file di metodo.</li>
		</ol></li>
		<li>Disporre l'esecuzione del lotto nel seguente ordine: soluzioni standard per la curva di calibrazione (0,001-10 ppb Pt o Ru), seguite da uno standard di controllo qualità, quindi campioni sconosciuti. NOTA: le soluzioni standard sono misurate come conteggi sull'ICPMS e una regressione lineare è adatta attraverso gli standard con una deviazione standard relativa (RSD) > 0,999. Le incognite sono anche misurate come conteggi e risolte per la concentrazione in ppb usando la regressione lineare della curva di calibrazione, y = mx + b. L'elaborazione dei dati può essere completata anche utilizzando il software di riferimento.</li>
		<li>Monitorare la deriva dello strumento e la riproducibilità del campione includendo uno standard di controllo qualità di 0,5 ppb ogni 5-10 campioni. NOTA: gli standard di controllo qualità adeguati devono essere un materiale di riferimento standard certificato diverso dallo standard utilizzato nella curva di calibrazione.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Watt</td>
			<td>Potenza</td>
			<td>Verbale</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>50%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>0%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>75%</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Protocollo di digestione a microonde per la massa del tessuto larvale. I campioni larvali di zebrafish sono stati digeriti in 0,25 ml di acido nitrico. Questa tabella è stata modificata da 24.

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 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298">https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298</a> (2014).</li>
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<li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+%28FET%29+with+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%3A+CBP%22%5BJournal%5D)">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li>
<li>Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+alkylating+activity+in+zebrafish+causes+resistance+to+chorionic+degradation+and+inhibition+of+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis.</a> Aquatic Toxicology. 229, 105656(2020).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse che devono essere divulgati da nessuno degli autori.

Il protocollo qui descritto è stato implementato per determinare la somministrazione e l'assorbimento di farmaci antitumorali a base di metalli contenenti Pt o Ru. Sebbene questi metodi siano già stati pubblicati, questo protocollo discute importanti considerazioni e dettagli per adattare questa metodologia a una serie di composti. Il protocollo OCSE abbinato alla digestione dei tessuti e all'analisi ICPMS ci ha permesso di determinare che il PMC79 era più potente del cisplatino e ha provocato un accumulo di tessuto disp...

I metalli e i composti a base di metalli continuano ad avere rilevanza farmacologica e tossicologica. La prevalenza dell'esposizione ai metalli pesanti e il suo impatto sulla salute hanno aumentato esponenzialmente le indagini scientifiche dal 1960 e hanno raggiunto il massimo storico nel 2021. Le concentrazioni di metalli pesanti nell'acqua potabile, nell'inquinamento atmosferico e nell'esposizione professionale superano i limiti normativi in tutto il mondo e rimangono un problema per arsenico, cadmio, mercurio, cromo, piombo e altri metalli. Nuovi metodi per quantificare l'esposizione ambientale e analizzare lo sviluppo patologico continuano ad essere molto richiesti 1,2,3.
Al contrario, il campo medico ha sfruttato le proprietà fisiochimiche di vari metalli per il trattamento clinico. I farmaci a base di metalli o metallofarmaci hanno una ricca storia di scopi medicinali e hanno mostrato attività contro una serie di malattie, con il più alto successo come chemioterapici4. Il più famoso dei metallofarmaci, il cisplatino, è un farmaco antitumorale a base di Pt considerato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come uno dei farmaci essenziali del mondo5. Nel 2010, il cisplatino e i suoi derivati del Pt hanno avuto un tasso di successo fino al 90% in diversi tumori e sono stati utilizzati in circa il 50% dei regimichemioterapici 6,7,8. Sebbene i chemioterapici a base di Pt abbiano avuto un successo inconfutabile, la tossicità dose-limitante ha messo in moto indagini su farmaci alternativi a base di metalli con somministrazione e attività biologica raffinata. Di queste alternative, i composti a base di Ru sono diventati i più popolari 9,10,11,12.
Sono necessari nuovi modelli e metodologie per tenere il passo con il tasso di necessità di studi di farmacocinetica e tossicocinetica sui metalli. Il modello del pesce zebra si trova all'intersezione tra complessità e produttività, essendo un vertebrato ad alta fecondità con il 70% di omologia genica conservata13. Questo modello è stato una risorsa in farmacologia e tossicologia, con ampi screening per vari composti per la scoperta di piombo, l'identificazione del bersaglio e l'attività meccanicistica 14,15,16,17. Tuttavia, lo screening ad alta produttività delle sostanze chimiche si basa in genere sulle esposizioni trasmesse dall'acqua. Dato che l'assorbimento può essere variabile in base alle proprietà fisico-chimiche del composto in soluzione (cioè fotodegradazione, solubilità), questo può essere un importante limite di correlazione tra l'erogazione della dose e la risposta.
Per superare questa limitazione per il confronto della dose con i vertebrati superiori, è stata progettata una metodologia per analizzare le concentrazioni di metalli in tracce nel tessuto larvale del pesce zebra. Qui, le curve dose-risposta degli endpoint letali e subletali sono state valutate per il cisplatino e nuovi composti antitumorali a base di Ru. La letalità e la schiusa ritardata sono state valutate per concentrazioni nominali di 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L di cisplatino. L'accumulo di Pt nel tessuto dell'organismo è stato determinato dall'analisi ICPMS e l'assorbimento da parte dell'organismo delle rispettive dosi è stato di 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 ng (Pt) per organismo. Inoltre, le larve di zebrafish sono state esposte a 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg / L di PMC79. Queste concentrazioni sono state determinate analiticamente per contenere 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 mg/ L di Ru. Questo protocollo consentiva anche la distinzione delle concentrazioni di Pt sequestrate nel coro delle larve rispetto al tessuto del pesce zebra. Questa metodologia è stata in grado di fornire dati affidabili e solidi per il confronto dell'attività farmaco-tossicocinetica tra un chemioterapico ben consolidato e un nuovo composto. Questo metodo può essere applicato a una vasta gamma di metalli e composti a base di metalli.

<table><tbody><tr><td>AB Ceppo Zebrafish (Danio reri)Zebrafish</td> <td>International Resource Center</td><td>Wild-Type AB Wild-Type</td><td>AB Zebrafish</td></tr><tr><td>ACS Grade Acido nitrico</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>BDH3130-2.5LP</td><td>Acido nitrico (68-70%); utilizzato per produrre il 10% di HNO3 soluzione acida per l'ammollo/pre-celamento delle provette da centrifuga</td></tr><tr><td>Aquatox Fish Diet (Flake)</td><td>Zeigler Bros, Inc.</td><td></td><td>Cibo in scaglie da miscelare in un rapporto 1:4 tra Aquatox Fish Diet e TetraMin Tropical Flakes e utilizzato come mangime</td></tr><tr><td>Cisti di artemia, artemia salina</td><td>PentairAES</td><td>BS90</td><td>Uova di artemia salina vendute in lattine da 15 ozz, confezionate sottovuoto per essere covate e utilizzate come mangime</td></tr><tr><td>Autocampionatore ASX-510 per ICPMS</td><td>Teledyne CETAC</td><td></td><td>Campionatore automatico con movimento XYZ configurabile, stazione di risciacquo a flusso e sonda con dimensione interna di 0,3 mm. Compatibile con il software Nu AttoLab per analisi batch programmabili. &nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>CL 2</td><td>Thermo Scientific CL 2 centrifuga compatta da banco con gamma di velocità variabile fino a 5200 giri/min; utilizzata per portare il campione e la condensa acida sul fondo della provetta da centrifuga tra gli intervalli di digestione a microonde; facilita la ritenzione del campione Provette</td></tr> da <tr><td>centrifuga</td><td>VWR</td><td>21008-105</td><td>Provette da centrifuga in polipropilene ad altissime prestazioni con tappo piatto; volume 15 mL; a tenuta stagna con fondo</td></tr> <tr>conico<td>Fiale filettate in vetro trasparente di classe A</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-25B</td><td>Fiale in vetro singole per il contenimento dell'esposizione</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td>Solvente o veicolo per composti idrofobici</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice a velocità fissa</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>Miscelatore a vortice; utilizzato per omogeneizzare il campione dopo la digestione e la diluizione acida Perossido</td></tr><tr><td>di idrogeno ad alta purezza</td><td>Merk KGaA, EDM Millipore</td><td>1.07298.0250</td><td>Suprapur Perossido di idrogeno (30%); utilizzato per la digestione dei campioni</td></tr><tr><td>Acido nitrico ad alta purezza</td><td>EDM Millipore</td><td>NX0408-2</td><td>Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); utilizzato per la digestione dei campioni</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands, Inc.</td><td>Oceano istantaneo La</td><td>soluzione acquosa di uova di sale marino contiene sale marino dell'oceano con una concentrazione finale di 60 & micro; g/ml</td></tr><tr><td>Mars X Microwave Digestion System</td><td>CEM, Matthews, NC</td><td></td><td>Sistema di digestione acida a microonde utilizzato per digerire e omogeneizzare campioni in condizioni uniformi. Per questa metodologia, il metodo di digestione a recipiente aperto è stato completato utilizzando provette da centrifuga monouso in polipropilene a bassa potenza (300 W).</td></tr><tr><td>Soluzione multielemento 3</td><td>SPEX CertiPREP</td><td>CLMS-3</td><td>Contiene 10 mg/L di Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; utilizzato come standard di controllo qualità per le analisi Pt e Ru</td></tr><tr><td>Nu Instruments Spettrometro di massa al plasma accoppiato induttivamente ad alta risoluzione AttoM (HR-ICP-MS)Nu</td> <td>Instruments/Amatek</td><td></td><td>Spettrometro di massa al plasma accoppiato induttivamente a settore magnetico a doppia focalizzazione con sistema di fenditura flessibile a bassa e alta risoluzione e sistema di rivelatori a gamma dinamica. L'elaborazione e la quantificazione dei dati vengono eseguite utilizzando il software complementare NuQuant.</td></tr><tr><td>Soluzione standard di platino (Pt), NIST 3140</td><td>National Institute of Standards and Technology</td><td>3140</td><td>Preparato da fiale contenenti 9,996 mg/g di Pt in 10% di HCl; ; utilizzato come standard di controllo qualità per le analisi Pt</td></tr><tr><td>Soluzione standard di platino (Pt), singolo elemento</td><td>Standard di elevata purezza</td><td>100040-2</td><td>Contiene 1000 mg/L di Pt in</td></tr><tr><td>soluzione standard di HCl rutenio (Ru)</td> al 5%, <td>singolo elemento Standard</td> <td>di elevata purezza100046-2</td><td>Contiene 1000 mg/L di Ru in 2% di HCl</td></tr><tr><td>TetraMin Tropical Flakes</td><td>Tetra</td><td>77101</td><td>Mangime in scaglie da miscelare in un rapporto 1:4 di Aquatox Fish Diet a TetraMin Tropical Flakes e da utilizzare come mangime</td></tr><tr><td>Trace Metal Grade Nitric Acid</td><td>VWR BDH Chemicals</td><td>87003-261</td><td>Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); utilizzato per la soluzione di risciacquo in ASX-510 Autocampionatore</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua ad ultrasuoni</td><td>VWR</td><td>B2500A-DTH</td><td>Bagnomaria ad ultrasuoni utilizzato per favorire la digestione acida prima della digestione a microonde</td></tr></tbody></table>

assorbimento della dose dell'esposizione a composti a base di platino e rutenio in zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie

Dose Uptake of Platinum- and Ruthenium-based Compound Exposure in Zebrafish by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry with Broader Applications

I metalli e i composti a base di metalli comprendono molteplici xenobiotici farmacoattivi e tossicologici. Dalla tossicità dei metalli pesanti ai chemioterapici, la tossicocinetica di questi composti ha rilevanza sia storica che moderna. I pesci zebra sono diventati un organismo modello attraente nel chiarire la farmacocinetica e la tossicocinetica negli studi di esposizione ambientale e traduzione clinica. Sebbene gli studi sui pesci zebra abbiano il vantaggio di avere un rendimento più elevato rispetto ai modelli di roditori, ci sono diversi vincoli significativi al modello.
Una di queste limitazioni è inerente al regime di dosaggio a base acquosa. Le concentrazioni di acqua da questi studi non possono essere estrapolate per fornire dosaggi interni affidabili. Le misurazioni dirette dei composti a base di metalli consentono una migliore correlazione con le risposte molecolari e biologiche correlate ai composti. Per superare questa limitazione per i metalli e i composti a base di metalli, è stata sviluppata una tecnica per digerire il tessuto larvale del pesce zebra dopo l'esposizione e quantificare le concentrazioni di metalli all'interno dei campioni di tessuto mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICPMS).
I metodi ICPMS sono stati utilizzati per determinare le concentrazioni metalliche di platino (Pt) da cisplatino e rutenio (Ru) da diversi nuovi chemioterapici a base di Ru nel tessuto zebrafish. Inoltre, questo protocollo distingueva le concentrazioni di Pt che venivano sequestrate nel coro della larva rispetto al tessuto del pesce zebra. Questi risultati indicano che questo metodo può essere applicato per quantificare la dose di metallo presente nei tessuti larvali. Inoltre, questo metodo può essere adattato per identificare metalli specifici o composti a base di metalli in una vasta gamma di studi di esposizione e dosaggio.

Questi risultati sono stati precedentemente pubblicati24. Sono stati condotti studi sull'assorbimento dei tessuti con esposizioni trasmesse dall'acqua di cisplatino e un nuovo composto antitumorale a base di Ru, PMC79. La letalità e la schiusa ritardata sono state valutate per le concentrazioni nominali di cisplatino 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L di cisplatino. L'accumulo di Pt nel tessuto dell'organismo è stato determinato mediante analisi ICPMS e il tessuto dell'organismo conteneva le rispettiv...

L'aumento del tasso di analisi farmaco-e tossicocinetiche di metalli e composti a base di metalli nel pesce zebra può essere vantaggioso per gli studi di traduzione ambientale e clinica. La limitazione dell'assorbimento sconosciuto dell'esposizione all'acqua è stata superata conducendo analisi di metalli in tracce su tessuto zebrafish digerito utilizzando la spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente.

Assorbimento della dose dell'esposizione a composti a base di platino e rutenio in Zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie

Metals and metal-based compounds comprise multifarious pharmaco-active and toxicological xenobiotics. From heavy metal toxicity to chemotherapeutics, the ...

I pesci zebra sono un modello attraente, ma gli scienziati non sanno quanto l'organismo stia assorbendo con il dosaggio per via d'acqua. Abbiamo sviluppato una tecnica per digerire il tessuto dopo l'esposizione e quantificare i metalli tramite ICPMS. Questa tecnica ci consente di quantificare e convalidare con precisione la risposta alla dose utilizzando ICPMS.Questo metodo ha un grande potenziale. Le esposizioni farmacologiche o ambientali ai metalli possono essere applicate dal livello cellulare fino a interi sistemi di organi in modelli animali. Aggiungere circa 0,25 millilitri di acido nitrico ad alta purezza ai tubi della centrifuga in polipropilene da 15 millilitri per un massimo di 10 larve.Ultrasuoni per un'ora per predigestare i campioni. Per l'ultrasonicazione, eseguire brevi cicli di digestione dei tessuti con intervalli di cinque minuti in un digestore a microonde sicuro per l'acido fino a quando tutto il tessuto è visibilmente ossidato, producendo una soluzione gialla uniforme e chiara. Monitorare attentamente l'integrità dei tubi per evitare rotture e condurre brevi giri nella centrifuga tra un ciclo e l'altro.Una volta che il tessuto è visibilmente ossidato, diluire i campioni in una cappa aspirante al 3,5% di acido nitrico usando 6,75 millilitri di acqua ad alta purezza e vortice per mescolare accuratamente. Quindi condurre una curva di calibrazione a 7 punti abbinata alla matrice per tenere conto di eventuali potenziali interferenze isobariche. Utilizzando una concentrazione di stock dello standard elementare certificato acquoso, prendere un'aliquota di 0,1 millilitri e per pipetto in un nuovo tubo centrifugo da 15 millilitri.Diluire con acido nitrico al 3,5% per un volume finale di 10 millilitri per produrre 10 parti per miliardo di soluzioni standard. Utilizzando le 10 parti per miliardo di stock, effettuare le diluizioni seriali 0,1, 1,0 e 5,0 parti per miliardo di soluzioni standard in acido nitrico al 3,5%. Utilizzando lo stock 0.1, effettuare le diluizioni seriali 0.001, 0.005 e 0.01 parti per miliardo di soluzioni standard in acido nitrico al 3,5%.Quindi, prima di preparare lo strumento ICPMS per l'analisi del campione, assicurarsi che la valvola del gas argon sia aperta, che tutti i tubi siano collegati e puliti in modo sicuro, che l'acido nitrico al 5% sia aperto per il risciacquo di tubi e bicchieri tra le analisi dei campioni. Controllare le condizioni della torcia e dei coni e assicurarsi che la scatola della torcia sia saldamente bloccata. E il tubo di drenaggio della camera di spruzzatura è collegato correttamente alla peripompa.Aprire il software, controllare le letture del vuoto e assicurarsi che tutte le turbopompe funzionino al 100% Fare clic su START nella finestra di stato del sistema di controllo al plasma per avviare la sequenza di avvio. Accendere la pompa al plasma e il refrigeratore al plasma, appollaiare il nebulizzatore e accendere il plasma. Attendere che il plasma sia acceso e stabile quando la finestra Stato indica che la sequenza di avvio è completa.A questo punto, osserva i punti verdi sulla finestra dello stato del sistema che indicano che tutti gli alimentatori sono accesi. Nella barra dei menu, fai clic su Controllo, Autocampionatore nel menu a discesa. Inserire la posizione del rack dell'autocampionatore per il tubo contenente il 5% di acido nitrico, consentire all'acido di entrare nel plasma.Nella barra dei menu, fai clic su Scansioni, Magnete nel menu a discesa. Nella finestra MagnetScan, digitare 115 nella posizione di massa del marcatore e fare clic su Invio. Lasciare che il magnete esegua la scansione attraverso l'intervallo di massa per 30 minuti mentre lo strumento si riscalda.Dopo 30 minuti, utilizzare il controllo autocampionatore per spostarsi nella posizione di una soluzione di ottimizzazione multielemento di una parte per miliardo. Aspirare la soluzione di accordatura e sintonizzare lo strumento per ottimizzare la lettura del segnale. Regolare la posizione della torcia per le coordinate X, Y, Z, in modo che la torcia si allinei con il centro dei coni e la portata del nebulizzatore nella finestra Controllo plasma.Effettuare le regolazioni necessarie nella finestra Sintonizzazione ottica ionica per sorgente, rilevatore e analizzatore. Una volta ottimizzata la lettura del segnale, fare clic su Stop nella finestra Scansione magnete, fare clic su Calibra magnete e selezionare una bassa risoluzione nella finestra popup. Fare clic su OK e aprire il file smc di calibrazione di massa per calibrare il magnete.Fare clic su Salva, Usa per applicare la calibrazione del magnete corrente alle analisi. Quando si misurano campioni sconosciuti con una vasta gamma di concentrazioni, eseguire una calibrazione del rilevatore per confrontare i segnali di conteggio degli impulsi ionici a basse concentrazioni con segnali ionici attenuati prodotti a concentrazioni più elevate. Avviare l'analisi del campione facendo clic su Acquisizione dati, quindi fare clic su Impostazione metodo nel menu a discesa.Utilizzare un metodo esistente fornito dal produttore o creare un metodo basato sugli elementi di interesse. Se necessario, regolare la modalità di analisi, il tempo di permanenza, il ritardo dell'interruttore, il numero di sweep e cicli, la risoluzione, la modalità di rilevamento e la massa del parco per le impostazioni del deflettore. Fare clic su Salva per registrare le impostazioni del metodo.Ottimizzare i parametri per ogni metallo e isotipo. Nella barra dei menu, fare clic su Acquisizione dati. Fare clic su Esecuzione batch nel menu a discesa.In alternativa, fare clic sull'icona BATCH sotto la barra dei menu, importare i parametri batch da un foglio di calcolo o creare una sequenza nella finestra Esecuzione batch. Immettere il tipo di campione, la posizione del rack dell'autocampionatore, il tempo di trasferimento, il tempo di lavaggio, le repliche, l'ID campione e il file di metodo. Disporre l'esecuzione del batch per soluzioni standard per la curva di calibrazione, seguita da uno standard di controllo qualità, quindi campioni sconosciuti.Monitora la deriva dello strumento e la riproducibilità del campione includendo uno standard di controllo qualità di 0,5 parti per miliardo ogni 5-10 campioni. Sono stati condotti studi sull'assorbimento dei tessuti con esposizioni a base acquosa di cisplatino e un nuovo composto antitumorale a base di rutenio PMC79. La letalità e la schiusa ritardata sono state valutate per le concentrazioni nominali di cisplatino.0, 3,75, 7,5 15, 30 e 60 milligrammi per litro di cisplatino. L'accumulo di platino nel tessuto dell'organismo è stato determinato dall'analisi ICPMS e il tessuto dell'organismo conteneva rispettive dosi di 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 nanogrammi per organismo. La schiusa ritardata è stata osservata a tutte le concentrazioni di cisplatino.Dopo la deconionezione, i cori sono stati raccolti e analizzati separatamente per il platino. Dosi non letali di cisplatino utilizzate per studi di decoernia hanno determinato che dal 93 al 96% della dose totale di cisplatino erogata si era accumulata nel corion, con la dose rimanente all'interno del tessuto larvale. Le larve di zebrafish sono state esposte a 0, 3,1, 6,2, 9,2 e 12,4 milligrammi per litro di PMC79.Queste concentrazioni sono state determinate analiticamente per contenere 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 milligrammi per litro di rutenio. A differenza di questo cisplatino, la schiusa ritardata non è stata osservata nelle larve esposte a PMC79. I corioni non sono stati inclusi nell'analisi del rutenio in quanto si degradavano naturalmente prima della raccolta larvale.Il metallo massiccio all'interno dei tessuti larvali analizzati ad ogni concentrazione era di 0,19, 0,41 e 0,68 nanogrammi di rutenio per larva. Tutti i reagenti aggiunti al protocollo di esposizione danno il potenziale per interferenze isobariche. Quando possibile, prendere in considerazione alternative come il raffreddamento rapido rispetto alla tricaina.Questo metodo consente di quantificare la dose di metallo per tossicità, efficacia, esperimenti da confrontare tra vertebrati superiori. Eravamo particolarmente entusiasti del fatto che la nostra dose soglia fosse entro un ordine di grandezza somministrato ai pazienti.

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