Assorbimento della dose dell'esposizione a composti a base di platino e rutenio in Zebrafish mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente con applicazioni più ampie

I pesci zebra sono un modello attraente, ma gli scienziati non sanno quanto l'organismo stia assorbendo con il dosaggio per via d'acqua. Abbiamo sviluppato una tecnica per digerire il tessuto dopo l'esposizione e quantificare i metalli tramite ICPMS. Questa tecnica ci consente di quantificare e convalidare con precisione la risposta alla dose utilizzando ICPMS.

Questo metodo ha un grande potenziale. Le esposizioni farmacologiche o ambientali ai metalli possono essere applicate dal livello cellulare fino a interi sistemi di organi in modelli animali. Aggiungere circa 0,25 millilitri di acido nitrico ad alta purezza ai tubi della centrifuga in polipropilene da 15 millilitri per un massimo di 10 larve.

Ultrasuoni per un'ora per predigestare i campioni. Per l'ultrasonicazione, eseguire brevi cicli di digestione dei tessuti con intervalli di cinque minuti in un digestore a microonde sicuro per l'acido fino a quando tutto il tessuto è visibilmente ossidato, producendo una soluzione gialla uniforme e chiara. Monitorare attentamente l'integrità dei tubi per evitare rotture e condurre brevi giri nella centrifuga tra un ciclo e l'altro.

Una volta che il tessuto è visibilmente ossidato, diluire i campioni in una cappa aspirante al 3,5% di acido nitrico usando 6,75 millilitri di acqua ad alta purezza e vortice per mescolare accuratamente. Quindi condurre una curva di calibrazione a 7 punti abbinata alla matrice per tenere conto di eventuali potenziali interferenze isobariche. Utilizzando una concentrazione di stock dello standard elementare certificato acquoso, prendere un'aliquota di 0,1 millilitri e per pipetto in un nuovo tubo centrifugo da 15 millilitri.

Diluire con acido nitrico al 3,5% per un volume finale di 10 millilitri per produrre 10 parti per miliardo di soluzioni standard. Utilizzando le 10 parti per miliardo di stock, effettuare le diluizioni seriali 0,1, 1,0 e 5,0 parti per miliardo di soluzioni standard in acido nitrico al 3,5%. Utilizzando lo stock 0.1, effettuare le diluizioni seriali 0.001, 0.005 e 0.01 parti per miliardo di soluzioni standard in acido nitrico al 3,5%.

Quindi, prima di preparare lo strumento ICPMS per l'analisi del campione, assicurarsi che la valvola del gas argon sia aperta, che tutti i tubi siano collegati e puliti in modo sicuro, che l'acido nitrico al 5% sia aperto per il risciacquo di tubi e bicchieri tra le analisi dei campioni. Controllare le condizioni della torcia e dei coni e assicurarsi che la scatola della torcia sia saldamente bloccata. E il tubo di drenaggio della camera di spruzzatura è collegato correttamente alla peripompa.

Aprire il software, controllare le letture del vuoto e assicurarsi che tutte le turbopompe funzionino al 100% Fare clic su START nella finestra di stato del sistema di controllo al plasma per avviare la sequenza di avvio. Accendere la pompa al plasma e il refrigeratore al plasma, appollaiare il nebulizzatore e accendere il plasma. Attendere che il plasma sia acceso e stabile quando la finestra Stato indica che la sequenza di avvio è completa.

A questo punto, osserva i punti verdi sulla finestra dello stato del sistema che indicano che tutti gli alimentatori sono accesi. Nella barra dei menu, fai clic su Controllo, Autocampionatore nel menu a discesa. Inserire la posizione del rack dell'autocampionatore per il tubo contenente il 5% di acido nitrico, consentire all'acido di entrare nel plasma.

Nella barra dei menu, fai clic su Scansioni, Magnete nel menu a discesa. Nella finestra MagnetScan, digitare 115 nella posizione di massa del marcatore e fare clic su Invio. Lasciare che il magnete esegua la scansione attraverso l'intervallo di massa per 30 minuti mentre lo strumento si riscalda.

Dopo 30 minuti, utilizzare il controllo autocampionatore per spostarsi nella posizione di una soluzione di ottimizzazione multielemento di una parte per miliardo. Aspirare la soluzione di accordatura e sintonizzare lo strumento per ottimizzare la lettura del segnale. Regolare la posizione della torcia per le coordinate X, Y, Z, in modo che la torcia si allinei con il centro dei coni e la portata del nebulizzatore nella finestra Controllo plasma.

Effettuare le regolazioni necessarie nella finestra Sintonizzazione ottica ionica per sorgente, rilevatore e analizzatore. Una volta ottimizzata la lettura del segnale, fare clic su Stop nella finestra Scansione magnete, fare clic su Calibra magnete e selezionare una bassa risoluzione nella finestra popup. Fare clic su OK e aprire il file smc di calibrazione di massa per calibrare il magnete.

Fare clic su Salva, Usa per applicare la calibrazione del magnete corrente alle analisi. Quando si misurano campioni sconosciuti con una vasta gamma di concentrazioni, eseguire una calibrazione del rilevatore per confrontare i segnali di conteggio degli impulsi ionici a basse concentrazioni con segnali ionici attenuati prodotti a concentrazioni più elevate. Avviare l'analisi del campione facendo clic su Acquisizione dati, quindi fare clic su Impostazione metodo nel menu a discesa.

Utilizzare un metodo esistente fornito dal produttore o creare un metodo basato sugli elementi di interesse. Se necessario, regolare la modalità di analisi, il tempo di permanenza, il ritardo dell'interruttore, il numero di sweep e cicli, la risoluzione, la modalità di rilevamento e la massa del parco per le impostazioni del deflettore. Fare clic su Salva per registrare le impostazioni del metodo.

Ottimizzare i parametri per ogni metallo e isotipo. Nella barra dei menu, fare clic su Acquisizione dati. Fare clic su Esecuzione batch nel menu a discesa.

In alternativa, fare clic sull'icona BATCH sotto la barra dei menu, importare i parametri batch da un foglio di calcolo o creare una sequenza nella finestra Esecuzione batch. Immettere il tipo di campione, la posizione del rack dell'autocampionatore, il tempo di trasferimento, il tempo di lavaggio, le repliche, l'ID campione e il file di metodo. Disporre l'esecuzione del batch per soluzioni standard per la curva di calibrazione, seguita da uno standard di controllo qualità, quindi campioni sconosciuti.

Monitora la deriva dello strumento e la riproducibilità del campione includendo uno standard di controllo qualità di 0,5 parti per miliardo ogni 5-10 campioni. Sono stati condotti studi sull'assorbimento dei tessuti con esposizioni a base acquosa di cisplatino e un nuovo composto antitumorale a base di rutenio PMC79. La letalità e la schiusa ritardata sono state valutate per le concentrazioni nominali di cisplatino.

0, 3,75, 7,5 15, 30 e 60 milligrammi per litro di cisplatino. L'accumulo di platino nel tessuto dell'organismo è stato determinato dall'analisi ICPMS e il tessuto dell'organismo conteneva rispettive dosi di 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 nanogrammi per organismo. La schiusa ritardata è stata osservata a tutte le concentrazioni di cisplatino.

Dopo la deconionezione, i cori sono stati raccolti e analizzati separatamente per il platino. Dosi non letali di cisplatino utilizzate per studi di decoernia hanno determinato che dal 93 al 96% della dose totale di cisplatino erogata si era accumulata nel corion, con la dose rimanente all'interno del tessuto larvale. Le larve di zebrafish sono state esposte a 0, 3,1, 6,2, 9,2 e 12,4 milligrammi per litro di PMC79.

Queste concentrazioni sono state determinate analiticamente per contenere 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 milligrammi per litro di rutenio. A differenza di questo cisplatino, la schiusa ritardata non è stata osservata nelle larve esposte a PMC79. I corioni non sono stati inclusi nell'analisi del rutenio in quanto si degradavano naturalmente prima della raccolta larvale.

Il metallo massiccio all'interno dei tessuti larvali analizzati ad ogni concentrazione era di 0,19, 0,41 e 0,68 nanogrammi di rutenio per larva. Tutti i reagenti aggiunti al protocollo di esposizione danno il potenziale per interferenze isobariche. Quando possibile, prendere in considerazione alternative come il raffreddamento rapido rispetto alla tricaina.

Questo metodo consente di quantificare la dose di metallo per tossicità, efficacia, esperimenti da confrontare tra vertebrati superiori. Eravamo particolarmente entusiasti del fatto che la nostra dose soglia fosse entro un ordine di grandezza somministrato ai pazienti.