Name: Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-22T18:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Impara la genotipizzazione rapida di campioni di coda di topo con il kit Extract-N-Amp Tissue PCR. Questo metodo consente di ottenere risultati accurati in circa un'ora e mezza utilizzando PCR in tempo reale.

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit&lt;/a&gt;</td><td>Kit di reagenti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">XNATG&lt;/a&gt;</td><td>Include: Soluzione di estrazione, Soluzione di neutralizzazione B, Soluzione di preparazione dei tessuti, Extract-N-Amp SYBR Green PCR ReadyMix</td></tr></tbody></table>

genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando sigma extract-n-amp pcr tissue kit

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Il rilevamento del DNA genomico tramite PCR e rivelazione su un gel elettroforesi è un metodo standard che il genotipo di un campione di tessuto è determinata. La preparazione tradizionale dei tessuti per PCR-ready DNA spesso richiedere diverse ore o giorni, a seconda del campione di tessuto. Il genotipo del campione può quindi essere ritardata per diversi giorni, che non è un&#39;opzione per i diversi tipi di esperimenti. Qui mostriamo la genotipizzazione completa di un campione coda di topo, tra cui la digestione dei tessuti e la lettura di PCR, in un&#39;ora e mezza con Sigma SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue kit. In primo luogo, dimostriamo i quindici minuti di estrazione del DNA dal campione di tessuto. Poi, dimostriamo il tempo reale lettura della amplificazione del campione, che consente l&#39;individuazione di un campione positivo in quanto è di essere amplificati. Insieme, la lettura rapida estrazione e in tempo reale permettono una immediata identificazione del genotipo di numerosi tipi differenti di tessuti attraverso il metodo affidabile di PCR.

La genotipizzazione completa di un campione coda di topo, tra cui la digestione dei tessuti e la lettura della PCR, è fatto in un&#39;ora e mezza con Sigma SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue kit.

Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit

La rilevazione genomica del DNA tramite amplificazione PCR e successiva analisi su gel elettroforetico è un metodo standard per determinare il genotipo di un campione tissutale...

Ciao, mi chiamo Linda e lavoro nel laboratorio del dottor Edwin Niki presso l'Università della California di Irvine. Oggi vi mostrerò come utilizzo il kit di estrazione tissutale PCR con cyber green di Stigma per genotipizzare rapidamente topi transgenici. Di solito uso questo kit per genotipizzare i nostri topi embrionali quando eseguo colture cellulari acutamente dissociative e ho bisogno di determinare rapidamente il genotipo del topo.Ma per i nostri scopi odierni, abbiamo delle code di topi adulti con cui posso mostrarvi come utilizzo questo kit. Questo protocollo prevede una digestione con ale rapida ed estrazione del DNA, seguita da un rapido passaggio di neutralizzazione. Successivamente, utilizziamo il DNA estratto in una PCR in tempo reale, nella quale possiamo monitorare gli ampliconi della PCR.Quindi, se siete pronti, iniziamo. Prima di cominciare, dobbiamo assicurarci che il blocco termico sia impostato a 95 gradi Celsius, che il cyber green sia scongelato e venga mantenuto sul ghiaccio fino al momento dell'uso, e che gli altri reagenti si stiano scongelando a temperatura ambiente. Nel mio contenitore per ghiaccio ho i due primer che utilizzeremo per il genotipaggio, progettati specificamente per il nostro gene di interesse e validati per la QPCR.Ho anche il mio controllo positivo per il gene di interesse, il mio controllo negativo e un campione di tessuto che ho già raccolto da un topo adulto. Ora, quando raccogliete il vostro campione di tessuto, è molto importante essere estremamente rigorosi. Quando raccogliamo code di topo embrionale, sciacquiamo sempre la pinzetta con etanolo al 70% prima e immediatamente prima di ogni prelievo del tessuto.E sciacquiamo sempre i campioni di coda in TBS prima; dovete preparare un mix master della soluzione di preparazione del tessuto ed estrazione del DNA per ogni coda: vi serviranno 100 microlitri di soluzione di estrazione e 25 microlitri di soluzione di preparazione del tessuto. Userò la mia pipetta P200 e punte filtranti per misurare 100 microlitri di soluzione di estrazione e 25 microlitri di soluzione di preparazione del tessuto in un nuovo tubo eppendorf. Dovrete mescolare il vostro mix master aspirando e dispensando con la pipetta.E quindi dovrai aggiungere 125 microlitri del tuo mix master nel tuo campione di interesse, assicurandoti che, se si tratta della coda di un topo adulto, l'estremità tagliata sia completamente immersa nella soluzione del mix master; puoi mescolare con un vortex manuale e poi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Durante l'incubazione di 10 minuti, preparerò il mio mix master verde preferito, che comprende il mix master verde cider incluso nel kit, acqua milli Q o di grado PCR e i nostri primer, un po' di acqua di grado PCR e i primer forward e reverse. E questo è tutto.Ora che l'incubazione di 10 minuti è terminata, dobbiamo riscaldare e attivare la reazione a 95 gradi per tre minuti. I tre minuti di inattivazione sono terminati e ora dobbiamo aggiungere la soluzione di neutralizzazione fornita nel kit, aggiungendo cento microlitri per ogni reazione, e dovrete mescolare il tutto mediante vortex. Dopo aver aggiunto il tampone di neutralizzazione, i campioni di DNA possono essere conservati a quattro gradi Celsius fino al momento in cui si è pronti per utilizzarli.In realtà vogliamo subito il nostro genotipo. Quindi passiamo immediatamente alla QPCR; le mie code sono state neutralizzate e sono pronte. Il mio mix master PCR con cyber green è pronto e ho predisposto le provette PCR su un blocco freddo.Tutto ciò che farò ora è aggiungere 16 microlitri del mio mix master in ogni pozzetto, quindi aggiungerò 4 microlitri dell'estratto neutralizzato oppure 4 microlitri del controllo positivo o negativo a ciascuno. In pratica, sto aggiungendo 16 microlitri di mix master a ciascuno dei pozzetti. Successivamente, aggiungerò 4 microlitri dell'estratto neutralizzato ai 60 microlitri di mix master presenti nel pozzetto, ottenendo un volume totale di reazione di 20 microlitri.E farò la stessa cosa per il controllo positivo e negativo. Aggiungendo quattro microlitri a 16 microlitri di un mix master PPR. Una volta aggiunti tutti, è possibile chiuderli con una striscia di otto tappi otticamente trasparenti.È necessario fare attenzione a non toccare la parte otticamente trasparente dei tappi posti sopra i campioni. Sto quindi utilizzando un fazzoletto Kim per premere sui tappi, assicurandomi che siano ben sigillati. Ho quindi vortexato delicatamente la miscela di PCR e DNA e l'ho centrifugata; ora siamo pronti per inserirla nel termociclatore QPCR.Ci&ograve; che faremo &egrave; prima caricare i nostri campioni nel termociclatore Opticon e creare una nuova configurazione della piastra, in cui il primo pozzetto sar&agrave; il nostro campione, il secondo pozzetto sar&agrave; il nostro controllo positivo e il terzo pozzetto il nostro controllo negativo. Specifichiamo che il volume della reazione &egrave; di 20 microlitri in totale. Successivamente caricher&ograve; un protocollo progettato per la genotipizzazione rapida.Questo protocollo prevede una fase di denaturazione della durata di tre minuti, seguita da un ciclo costituito da 15 secondi di denaturazione, 15 secondi di appaiamento primario e 20 secondi di estensione primaria. La fase di estensione primaria può effettivamente essere ridotta fino a circa 10 secondi, per un tempo totale di soli 40 secondi. Per ogni ciclo, queste tre fasi vengono ripetute circa 40 volte, come in una normale PCR, e al termine si esegue una curva di denaturazione.Abbiamo quindi preparato la nostra piastra e caricato il protocollo. Ora dobbiamo semplicemente eseguire la nostra QPCR, che inizia con la fase di denaturazione di tre minuti. Per esperienza, utilizzando i primer che sto usando e i campioni di coda, cercando i geni che sto analizzando, so che i risultati positivi inizieranno a comparire intorno al ciclo 25, superando la soglia significativa del ciclo di amplificazione.Ora, il momento in cui si verifica l'incrocio dipende fortemente dal campione di tessuto, da ciò che si sta cercando e dalla quantità iniziale di DNA presente. Possiamo già osservare che il nostro controllo positivo è già risultato positivo e sembra che anche il nostro campione sia positivo. Come si vede, inizia a emergere leggermente dopo il nostro controllo positivo.Dovremo comunque aspettare ancora perché siamo solo a 27 cicli, ma sperabilmente tra qualche ciclo in più potremo essere certi che il nostro campione è positivo e a quel punto potrò proseguire con il mio esperimento. A questo punto, si può notare che il controllo negativo sta appena iniziando a comparire, e ciò è dovuto al fatto che ho prelevato un eccesso di coda. Questo vi aiuta a essere certi che qualsiasi segnale che appaia prima di questo eccesso di coda negativa sarà positivo.Quindi, a questo punto, qualsiasi segnale che appaia prima del campione negativo verrà considerato positivo e potrò proseguire con il mio esperimento. Al termine del ciclo di PCR, l'apparecchio esegue un'analisi della curva di denaturazione, che permette di determinare la composizione e la purezza del prodotto ottenuto.In questo modo, è possibile verificare se i campioni positivi e negativi sono stati scelti correttamente. Ad esempio, il campione positivo presenterà un picco specifico e ben definito di temperatura di fusione, corrispondente a un prodotto PCR specifico amplificato. I campioni negativi mostreranno invece un picco ampio e non specifico di temperatura di fusione, corrispondente al DNA non specifico amplificato durante la PCR.Quindi vi ho appena mostrato come utilizziamo l'amplicone Cyber Green di Sigma per genotipizzare rapidamente le code di topi adulti. Tuttavia, questo kit può essere utilizzato con diversi tessuti animali, capelli, saliva, e io lo uso per il genotipaggio delle code di embrioni murini. Preferiamo utilizzare questo kit perché è rapido.Posso ottenere il mio genotipo entro un'ora, ed è molto comodo e semplice. Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna.

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Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l'isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

L'approccio qui presentato PCR diretta facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di piante non purificato e tessuto animale.

Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima

Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.

Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per un'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testis del topo

Qui abbiamo presentato un metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula multiplexed per profilare l'espressione genica nei tessuti embrionali del topo. Il metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) basato su droplet in combinazione con strategie di multiplexing può profilare singole cellule da più campioni contemporaneamente, riducendo significativamente i costi del reagente e riducendo al minimo gli effetti batch sperimentali.

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Il presente protocollo descrive una singola mutazione M213L in Gja1 che mantiene la generazione di Connexin43 a lunghezza intera ma impedisce la traduzione della più piccola isoforma GJA1-20k tradotta internamente.

Rimozione di un sito di partenza traslazionale interno dall'mRNA pur mantenendo l'espressione della proteina a lunghezza intera

L'efficienza del metodo I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) è paragonabile alla microiniezione tradizionale, che richiede la raccolta di zigoti da femmine donatrici e il trasferimento a femmine pseudo-gravide. Questo protocollo dimostra la sua efficacia introducendo mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel locus ROSA26 sul cromosoma 6.

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

Impara la genotipizzazione rapida di campioni di coda di topo con il kit Extract-N-Amp Tissue PCR. Questo metodo consente di ottenere risultati accurati in circa un'ora e mezza utilizzando PCR in tempo reale.

Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit

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