Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit

Ciao, mi chiamo Linda e lavoro nel laboratorio del dottor Edwin Niki presso l'Università della California di Irvine. Oggi vi mostrerò come utilizzo il kit di estrazione tissutale PCR con cyber green di Stigma per genotipizzare rapidamente topi transgenici. Di solito uso questo kit per genotipizzare i nostri topi embrionali quando eseguo colture cellulari acutamente dissociative e ho bisogno di determinare rapidamente il genotipo del topo.

Ma per i nostri scopi odierni, abbiamo delle code di topi adulti con cui posso mostrarvi come utilizzo questo kit. Questo protocollo prevede una digestione con ale rapida ed estrazione del DNA, seguita da un rapido passaggio di neutralizzazione. Successivamente, utilizziamo il DNA estratto in una PCR in tempo reale, nella quale possiamo monitorare gli ampliconi della PCR.

Quindi, se siete pronti, iniziamo. Prima di cominciare, dobbiamo assicurarci che il blocco termico sia impostato a 95 gradi Celsius, che il cyber green sia scongelato e venga mantenuto sul ghiaccio fino al momento dell'uso, e che gli altri reagenti si stiano scongelando a temperatura ambiente. Nel mio contenitore per ghiaccio ho i due primer che utilizzeremo per il genotipaggio, progettati specificamente per il nostro gene di interesse e validati per la QPCR.

Ho anche il mio controllo positivo per il gene di interesse, il mio controllo negativo e un campione di tessuto che ho già raccolto da un topo adulto. Ora, quando raccogliete il vostro campione di tessuto, è molto importante essere estremamente rigorosi. Quando raccogliamo code di topo embrionale, sciacquiamo sempre la pinzetta con etanolo al 70% prima e immediatamente prima di ogni prelievo del tessuto.

E sciacquiamo sempre i campioni di coda in TBS prima; dovete preparare un mix master della soluzione di preparazione del tessuto ed estrazione del DNA per ogni coda: vi serviranno 100 microlitri di soluzione di estrazione e 25 microlitri di soluzione di preparazione del tessuto. Userò la mia pipetta P200 e punte filtranti per misurare 100 microlitri di soluzione di estrazione e 25 microlitri di soluzione di preparazione del tessuto in un nuovo tubo eppendorf. Dovrete mescolare il vostro mix master aspirando e dispensando con la pipetta.

E quindi dovrai aggiungere 125 microlitri del tuo mix master nel tuo campione di interesse, assicurandoti che, se si tratta della coda di un topo adulto, l'estremità tagliata sia completamente immersa nella soluzione del mix master; puoi mescolare con un vortex manuale e poi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Durante l'incubazione di 10 minuti, preparerò il mio mix master verde preferito, che comprende il mix master verde cider incluso nel kit, acqua milli Q o di grado PCR e i nostri primer, un po' di acqua di grado PCR e i primer forward e reverse. E questo è tutto.

Ora che l'incubazione di 10 minuti è terminata, dobbiamo riscaldare e attivare la reazione a 95 gradi per tre minuti. I tre minuti di inattivazione sono terminati e ora dobbiamo aggiungere la soluzione di neutralizzazione fornita nel kit, aggiungendo cento microlitri per ogni reazione, e dovrete mescolare il tutto mediante vortex. Dopo aver aggiunto il tampone di neutralizzazione, i campioni di DNA possono essere conservati a quattro gradi Celsius fino al momento in cui si è pronti per utilizzarli.

In realtà vogliamo subito il nostro genotipo. Quindi passiamo immediatamente alla QPCR; le mie code sono state neutralizzate e sono pronte. Il mio mix master PCR con cyber green è pronto e ho predisposto le provette PCR su un blocco freddo.

Tutto ciò che farò ora è aggiungere 16 microlitri del mio mix master in ogni pozzetto, quindi aggiungerò 4 microlitri dell'estratto neutralizzato oppure 4 microlitri del controllo positivo o negativo a ciascuno. In pratica, sto aggiungendo 16 microlitri di mix master a ciascuno dei pozzetti. Successivamente, aggiungerò 4 microlitri dell'estratto neutralizzato ai 60 microlitri di mix master presenti nel pozzetto, ottenendo un volume totale di reazione di 20 microlitri.

E farò la stessa cosa per il controllo positivo e negativo. Aggiungendo quattro microlitri a 16 microlitri di un mix master PPR. Una volta aggiunti tutti, è possibile chiuderli con una striscia di otto tappi otticamente trasparenti.

È necessario fare attenzione a non toccare la parte otticamente trasparente dei tappi posti sopra i campioni. Sto quindi utilizzando un fazzoletto Kim per premere sui tappi, assicurandomi che siano ben sigillati. Ho quindi vortexato delicatamente la miscela di PCR e DNA e l'ho centrifugata; ora siamo pronti per inserirla nel termociclatore QPCR.

Ciò che faremo è prima caricare i nostri campioni nel termociclatore Opticon e creare una nuova configurazione della piastra, in cui il primo pozzetto sarà il nostro campione, il secondo pozzetto sarà il nostro controllo positivo e il terzo pozzetto il nostro controllo negativo. Specifichiamo che il volume della reazione è di 20 microlitri in totale. Successivamente caricherò un protocollo progettato per la genotipizzazione rapida.

Questo protocollo prevede una fase di denaturazione della durata di tre minuti, seguita da un ciclo costituito da 15 secondi di denaturazione, 15 secondi di appaiamento primario e 20 secondi di estensione primaria. La fase di estensione primaria può effettivamente essere ridotta fino a circa 10 secondi, per un tempo totale di soli 40 secondi. Per ogni ciclo, queste tre fasi vengono ripetute circa 40 volte, come in una normale PCR, e al termine si esegue una curva di denaturazione.

Abbiamo quindi preparato la nostra piastra e caricato il protocollo. Ora dobbiamo semplicemente eseguire la nostra QPCR, che inizia con la fase di denaturazione di tre minuti. Per esperienza, utilizzando i primer che sto usando e i campioni di coda, cercando i geni che sto analizzando, so che i risultati positivi inizieranno a comparire intorno al ciclo 25, superando la soglia significativa del ciclo di amplificazione.

Ora, il momento in cui si verifica l'incrocio dipende fortemente dal campione di tessuto, da ciò che si sta cercando e dalla quantità iniziale di DNA presente. Possiamo già osservare che il nostro controllo positivo è già risultato positivo e sembra che anche il nostro campione sia positivo. Come si vede, inizia a emergere leggermente dopo il nostro controllo positivo.

Dovremo comunque aspettare ancora perché siamo solo a 27 cicli, ma sperabilmente tra qualche ciclo in più potremo essere certi che il nostro campione è positivo e a quel punto potrò proseguire con il mio esperimento. A questo punto, si può notare che il controllo negativo sta appena iniziando a comparire, e ciò è dovuto al fatto che ho prelevato un eccesso di coda. Questo vi aiuta a essere certi che qualsiasi segnale che appaia prima di questo eccesso di coda negativa sarà positivo.

Quindi, a questo punto, qualsiasi segnale che appaia prima del campione negativo verrà considerato positivo e potrò proseguire con il mio esperimento. Al termine del ciclo di PCR, l'apparecchio esegue un'analisi della curva di denaturazione, che permette di determinare la composizione e la purezza del prodotto ottenuto.

In questo modo, è possibile verificare se i campioni positivi e negativi sono stati scelti correttamente. Ad esempio, il campione positivo presenterà un picco specifico e ben definito di temperatura di fusione, corrispondente a un prodotto PCR specifico amplificato. I campioni negativi mostreranno invece un picco ampio e non specifico di temperatura di fusione, corrispondente al DNA non specifico amplificato durante la PCR.

Quindi vi ho appena mostrato come utilizziamo l'amplicone Cyber Green di Sigma per genotipizzare rapidamente le code di topi adulti. Tuttavia, questo kit può essere utilizzato con diversi tessuti animali, capelli, saliva, e io lo uso per il genotipaggio delle code di embrioni murini. Preferiamo utilizzare questo kit perché è rapido.

Posso ottenere il mio genotipo entro un'ora, ed è molto comodo e semplice. Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna.