Name: Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Impara a purificare le proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero. Questo metodo consente di studiare il ruolo dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica in biologia cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (81972624) a D.L.

NOTA: Le cellule H1299 sono state gentilmente fornite dalla Banca delle cellule staminali, Accademia cinese delle scienze e si sono dimostrate negative per la contaminazione da micoplasma.
1. Coltura cellulare
<ol><li>Per la coltura iniziale, posizionare 1 x 106 cellule della linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano, H1299 in una capsula di Petri da 10 cm con 10-12 ml di terreno RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 1%, additivo glutamminico all'1%, piruvato di sodio all'1% e antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina). Mantenere le celle a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2. Dividere le celle ogni 2-3 giorni a seconda di quando raggiungono l'80% -90% di confluenza.</li>
	<li>Un giorno prima della trasfezione, preparare 6-9 x 10 6 celle per tre piastre di Petri e placcare 2-3 x 106 celle in un'unica capsula di Petri da 10 cm contenente 10-12 ml di terreno per ottenere una confluenza del 70%-90% durante la trasfezione. NOTA: Le cellule HEK293T possono anche essere utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate grazie alla loro elevata efficienza di trasfezione e al livello di espressione proteica.</li>
</ol>2. Trasfezione plasmidica
<ol><li>Aggiungere 1,5 mL di mezzo sierico ridotto in tre provette da centrifuga da 15 ml.</li>
	<li>Aggiungere DNA plasmidico pronto per la trasfezione a ciascuna provetta per effettuare diluizioni come segue. Tubo 1: 1 μg di plasmide Flag-p53, 12 μg di vettore vuoto; Tubo 2: 1 μg di plasmide Flag-p53, 3 μg di plasmide His-HA-Ub (HH-Ub) e 9 μg di vettore vuoto; Tubo 3: 1 μg di plasmide Flag-p53, 3 μg di plasmide HH-Ub e 9 μg di plasmide Mdm2. Aggiungere un totale di 0,2 μg di plasmide di proteina fluorescente verde (GFP) a ciascun tubo per monitorare l'efficienza di trasfezione. NOTA: È necessario eseguire un esperimento pilota per determinare le quantità ottimali di plasmidi necessarie per ottenere un'espressione efficiente delle proteine bersaglio nelle cellule.</li>
	<li>Aggiungere 78 μL di reagente di trasfezione liposomica a 4,5 ml di mezzo sierico ridotto in un'altra provetta da centrifuga per diluire i liposomi. Mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e lasciare riposare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL della soluzione liposomica diluita in ciascuna provetta del punto 2.2 contenente 1,5 mL della soluzione di DNA diluito. Mescolare accuratamente e reticolare i plasmidi con i liposomi per almeno 20 minuti a RT. Utilizzare un rapporto plasmide DNA: liposoma di 1: 2 (μg: μL) per ogni trasfezione.</li>
	<li>Scartare il mezzo originale dalle piastre di Petri e aggiungere 9 ml di terreno sierico ridotto in ogni piatto. Aggiungere 3 ml della miscela liposoma-DNA a ciascun piatto e mescolare la soluzione agitando delicatamente la piastra avanti e indietro 3x, quindi a sinistra e a destra 3x per una distribuzione uniforme della miscela nella piastra.</li>
	<li>Coltura delle cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. Sostituire il mezzo dopo 4-6 ore e continuare a coltivare le cellule per 24-36 ore.</li>
</ol>3. Raccolta delle cellule
<ol><li>Dopo 24-36 ore, trattare le cellule con MG132 ad una concentrazione finale di 10 μM per 4-6 ore. NOTA: MG132 è un'aldeide peptidica che blocca efficacemente l'attività proteolitica del complesso proteasoma 26S. La quantità di proteine ubiquitinate con catene di poliubiquitina legate alla lisina-48 (K48) può essere aumentata dopo che le cellule sono state trattate con MG132 o altri inibitori del proteasoma.</li>
	<li>Scartare il terreno, lavare le cellule 2 volte (facendo attenzione a non lavare le cellule) con soluzione salina tamponata fosfato ghiacciata (PBS) e aspirare le cellule con pipet sierologici.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS al piatto, rimuovere le cellule raschiando con un raschietto pulito e trasferire la sospensione cellulare in provette di microcentrifuga. Centrifugare a 700 x g per 5 minuti per raccogliere i pellet cellulari.</li>
</ol>4. Purificazione di proteine ubiquitinate in condizioni di non denaturazione
<ol><li>Preparare il tampone di lisi Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM acido etilendiammiamminotetraacetico (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl e 10% glicerolo) appena integrato con cocktail inibitore della proteasi prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 800 μL di tampone di lisi Flag ghiacciato alle celle di ciascuna provetta, mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette, quindi incubare la miscela su un rotatore a 4 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Sottoporre la miscela a 5-10 brevi impulsi di ultrasuoni. Eseguire l'ultrasonicazione sul ghiaccio ad una frequenza di sonicazione di 20 kHZ e 80% di ampiezza con ogni impulso della durata di 1 s. Incubare la miscela su un rotatore a 40 giri al minuto (rpm) a 4 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Centrifugare i campioni ultrasonicati a 8.000 x g per 20-30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.</li>
	<li>Aliquot 80 μL (1/10) dell'estratto cellulare e miscelare con 20 μL di tampone di carico 5x sodio dodecilsolfato (SDS). Far bollire i campioni a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C fino all'uso. Utilizzare questi campioni come gruppo di input per monitorare l'espressione proteica.</li>
	<li>Aggiungere 30 μL di perle anticorpo-coniugate anti-Flag M2 (Flag/M2) agli estratti cellulari rimanenti e incubare su un rotatore a 4 °C per almeno 4 ore o per tutta la notte.</li>
	<li>Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere le perle. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi Flag ghiacciato alle perle e mescolare capovolgendo il tubo più volte.</li>
	<li>Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere le perle. Ripetere il passaggio 4.7 per 4-6 volte.</li>
	<li>Aggiungere 40 μL di peptidi Flag ad una concentrazione finale di 200 ng/μL alle sfere e incubare su un rotatore a 4 °C per 2 ore per eluire le proteine legate.</li>
	<li>Centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di tampone di carico 5x SDS, far bollire la miscela a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C per il Western blotting. In alternativa, conservare l'eluato dal punto 4.10 direttamente a -80 °C per altri esperimenti a valle. NOTA: La quantità di proteine ubiquitinate purificate può essere aumentata aumentando il numero di cellule e la quantità di plasmidi trasfettati. Una strategia di marcatura degli epitopi può essere adattata per purificare i complessi cellulari che si legano specificamente a p53 ubiquitinata in condizioni di purificazione native. Co-esprimendo Flag-p53, mdm2 e HA-ubiquitina, il complesso proteico p53 ubiquitinata può essere immunoprecipitato mediante agarosio sequenziale coniugato con anticorpi Flag e HA da cellule di mammifero. Per mantenere i partner leganti delle proteine p53 ubiquitinate, durante il processo di purificazione deve essere utilizzato il tampone di lisi BC100 meno rigoroso (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glicerolo, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 e 1x inibitore della proteasi). L'eluato del peptide HA viene sottoposto a spettrometria di massa per identificare tutti i partner che si legano specificamente a p53 ubiquitinata.</li>
</ol>5. Purificazione delle proteine ubiquitinate in condizioni di denaturazione
<ol><li>Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato ai pellet cellulari ottenuti al punto 3.3 e mescolare uniformemente. Aliquot 100 μL (1/10 di volume) della sospensione cellulare in una provetta di microcentrifuga come campione di ingresso.</li>
	<li>Centrifugare a 700 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere i pellet cellulari. Aggiungere 80 μL di tampone di lisi Flag al campione di ingresso, mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette e lisare le celle sul ghiaccio per 1 ora.</li>
	<li>Centrifugare a 8.000 x g per 20-30 minuti a 4 °C. Aliquot 80 μL del surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di 5x tampone di carico SDS al surnatante, far bollire a 98 °C per 5-10 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C fino all'uso.</li>
	<li>Centrifugare i restanti 900 μL della sospensione cellulare a 700 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere il pellet cellulare. Aggiungere 1 mL di ubiquitina tampone 1 (tampone UB 1; 6 M guanidina-HCI, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e0,2% Triton X-100, appena integrato con 10 mM β-mercaptoetanolo e 5 mM imidazolo) ai pellet cellulari e mescolare più volte pipettando su e giù per distribuire uniformemente le cellule. NOTA: La concentrazione di imidazolo può variare da 5 mM a 20 mM per ridurre il legame proteico non specifico sulla resina carica di nichel. Il tampone di ubiquitina contiene guanidina cloridrato, che inattiva sia le ligasi che i DUB. β-mercaptoetanolo è un liquido chiaro e incolore con un odore forte e sgradevole simile alle uova marce. Una soluzione ad alta concentrazione causerà gravi danni alla mucosa, al tratto respiratorio superiore, alla pelle e agli occhi. Indossare guanti e occhiali e operare nella cappa aspirante.</li>
	<li>Sottoporre i lisati cellulari a 10-20 cicli di ultrasuoni fino a quando la soluzione non è più viscosa. Eseguire l'ultrasonicazione sul ghiaccio ad una frequenza di sonicazione di 20 kHZ e 80% di ampiezza con ogni impulso della durata di 1 s. Centrifugare a 8.000 x g per 20-30 minuti a RT e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 30 μL di resina carica di nichel al surnatante e incubare su un rotatore impostato a 15 giri / min per 4 ore o durante la notte a RT. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone UB 1, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di ubiquitina tampone 2 (tampone UB 2; 8 M urea, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e 0,2% Triton X-100) alle perle, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per2minuti per raccogliere le perle. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Alle perle, aggiungere 1 mL di PBS, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle. Ripeti ancora una volta.</li>
	<li>Eluire le proteine legate incubando le perle con 40 μL di imidazolo ad una concentrazione finale di 0,5 M per 1 ora a RT. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta di microcentrifuga pulita, aggiungere 10 μL di tampone di carico 5x SDS, far bollire a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C per il Western blotting. In alternativa, conservare l'eluato non trattato a -80 °C per altri esperimenti a valle.</li>
</ol>6. Individuazione di proteine ubiquitinate purificate mediante Western blotting
<ol><li>Risolvere i campioni dei punti 4.11 e 5.12 mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE), quindi trasferirli su una membrana di nitrocellulosa mediante Western blotting per rilevare le proteine bersaglio utilizzando gli anticorpi corrispondenti come descritto18.</li>
	<li>In breve, incubare la membrana immergendola in 20 mL di soluzione bloccante contenente il 5% di latte defat in polvere in tampone TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, appena integrato con 0,1% Tween-20 prima dell'uso) a RT per 1 ora. Quindi, incubare la membrana con anticorpi primari a RT per 2 ore o durante la notte a 4 °C. Utilizzare i seguenti anticorpi per ogni set. Tutti gli anticorpi primari sono stati utilizzati ad una diluizione di 1:1000.<ol><li>Rilevare la proteina p53 totale, inclusa p53 ubiquitinata, con un anticorpo monoclonale anti-p53 dopo immunoprecipitazione con perle di agarosio Flag/M2.</li>
		<li>Rilevare le proteine p53 ubiquitinate con un anticorpo anti-HA o anticorpo anti-ubiquitina dopo immunoprecipitazione con perle di agarosio Flag/M2.</li>
		<li>Rileva le proteine p53 ubiquitinate con un anticorpo monoclonale anti-p53 dopo il pulldown della resina carica di nichel.</li>
		<li>Rilevare la proteina ubiquitinata totale con un anticorpo anti-HA o anticorpo anti-ubiquitina dopo il pulldown della resina carica di nichel.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare la membrana con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) a RT per 1 ora dopo aver lavato 3 volte con tampone TBST per 5 minuti ciascuno. Tutti gli anticorpi secondari sono stati utilizzati ad una diluizione di 1:3000. Quindi, lavare la membrana con tampone TBST 3x per 5 minuti ciascuno con delicata agitazione.</li>
	<li>Avviare il sistema di imaging a chemiluminescenza per rilevare i segnali dal Western blotting. Preparare la soluzione di substrato per HRP miscelando le soluzioni A e B in un rapporto di 1:1.</li>
	<li>Posizionare la membrana di nitrocellulosa nella camera oscura a faccia in su e rivestire uniformemente la soluzione del substrato sulla membrana usando una pistola pipettaggio. Selezionare la procedura di esposizione automatica per acquisire i segnali chemiluminescenti e regolare manualmente il tempo di esposizione fino a quando non viene acquisito un segnale ideale.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

L'ubiquitinazione svolge un ruolo critico in quasi tutti i processi cellulari fisiologici e patologici2. Negli ultimi anni, sono stati fatti grandi progressi nella comprensione del ruolo molecolare dell'ubiquitina nelle vie di segnalazione e di come i cambiamenti nel sistema dell'ubiquitina portino a diverse malattie umane2. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce a fornire informazioni sui ruoli esatti dell'ubiquitinazione in questi processi. Le miscele d...

L'ubiquitina è una proteina evolutivamente conservata di 76 aminoacidi 1,2,3. L'ubiquitina lega covalentemente i residui di lisina sulle proteine bersaglio attraverso cascate che coinvolgono gli enzimi attivanti (E1), coniuganti (E2) e ligasi (E3). L'ubiquitina viene prima attivata dall'enzima E1 e quindi trasferita agli enzimi coniuganti E2. Successivamente, le ubiquitina ligasi E3 interagiscono sia con gli enzimi E2 caricati con ubiquitina che con le proteine del substrato e mediano la formazione di un legame isopeptidico tra il C-terminale dell'ubiquitina e un residuo di lisina nel substrato 1,2,3,4,5. L'ubiquitinazione comporta l'attaccamento delle frazioni di ubiquitina ai residui di lisina sulle proteine del substrato o a se stessa, portando alla monoubiquitinazione o alla poliubiquitinazione delle proteine. Questo processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola una grande varietà di processi biologici. L'ubiquitinazione provoca la degradazione delle proteine del substrato attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Inoltre, l'ubiquitinazione modula la localizzazione subcellulare delle proteine, la formazione di complessi proteici e il traffico proteico nelle cellule 3,5. Le frazioni di ubiquitina legate alle proteine del substrato possono essere rimosse dagli enzimi deubiquitinanti (DUB)6,7. In particolare, i diversi modi in cui le catene di ubiquitina sono assemblate forniscono una miriade di mezzi per regolare vari processi biologici 1,5. I ruoli esatti dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica del substrato rimangono incompletamente compresi fino ad ora. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce alla spiegazione degli effetti dell'ubiquitinazione delle proteine su una varietà di processi cellulari.
La proteina p53 è una delle più importanti proteine oncosoppressori e presenta mutazioni genetiche o inattivazione in quasi tutti i tumori umani 8,9,10,11. La stabilità e l'attività di p53 sono delicatamente regolate in vivo da modificazioni post-traduzionali, tra cui ubiquitinazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione12,13. La proteina p53 ha una breve emivita che va da 6 min a 40 min in varie cellule, che deriva principalmente dalla sua poliubiquitinazione e successiva degradazione proteasomica10,12. Il doppio minuto 2 del topo (Mdm2) è una ubiquitina ligasi E3 di p53 che si lega al N-terminale di p53 per inibire la sua attività trascrizionale12,14,15. Mdm2 promuove la poliubiquitinazione e la degradazione proteasomica di p53 per controllarne la stabilità e induce la monoubiquitinazione di p53 per facilitare la sua esportazione nucleare12,14,15,16. Qui, l'ubiquitinazione di p53 mediata da Mdm2 viene utilizzata come esempio per introdurre in dettaglio un metodo per la purificazione delle proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero. I regolatori che influenzano lo stato di ubiquitinazione delle proteine bersaglio possono essere identificati utilizzando questo test di ubiquitinazione in vivo quando sono sovraespressi o abbattuti / eliminati nelle cellule di mammifero. Inoltre, le proteine ubiquitinate possono essere utilizzate come substrati per il saggio di deubiquitinazione in vitro. È possibile eseguire uno screening ad alto rendimento per identificare DUB specifici per le proteine bersaglio incubando substrati ubiquitinati con singoli DUB. Le proteine ubiquitinate possono agire come un'impalcatura per reclutare proteine di segnalazione a valle nelle cellule. Un complesso proteico bersaglio ubiquitinata può essere purificato mediante immunoprecipitazione sequenziale in condizioni di purificazione native e identificato mediante spettrometria di massa. L'attuale protocollo può essere ampiamente utilizzato per studiare le proteine cellulari regolate dall'ubiquitinazione.
Sono stati stabiliti diversi metodi per purificare le proteine ubiquitinate, che includono l'uso di ubiquitina marcata per affinità, anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e domini isolati leganti l'ubiquitina (UBD)17. Qui, forniamo un protocollo che utilizza ubiquitina marcata di affinità come mediatore per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata offre vantaggi rispetto agli altri metodi. Le proteine ubiquitinate vengono purificate in presenza di forti denaturanti, che riducono il legame non specifico alla resina carica di nichel linearizzando le proteine cellulari e interrompendo le interazioni proteina-proteina. Al contrario, l'uso di anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e UBD isolati come mediatori non può escludere efficacemente i partner leganti dalla proteina bersaglio perché la purificazione deve essere eseguita in condizioni meno rigorose. Inoltre, la purificazione può anche portare ad un maggiore legame di proteine non correlate usando questi mediatori. Inoltre, vi è una propensione al legame per vari tipi di legame dell'ubiquitina e per la mono- e poli-ubiquitinazione da parte di proteine leganti l'ubiquitina o UBD isolate17. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata contribuisce ad abbattere tutte le proteine ubiquitinate cellulari. In alternativa, l'uso di agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag o anti-HA disponibili in commercio rende più facile immunoprecipitare proteine bersaglio marcate con Flag o HA su larga scala in condizioni non denaturanti. Una seconda fase di purificazione, ad esempio, mediante resina carica di nichel mirata all'ubiquitina poli-His-marcata, può essere utilizzata per acquisire proteine bersaglio ubiquitinate con un'elevata purezza per esperimenti a valle. In particolare, una strategia di purificazione dell'epitopo può essere adattata quando un anticorpo specifico non può essere acquisito per immunoprecipitare efficacemente le proteine bersaglio. Infine, la purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero, rispetto alla purificazione in vitro, mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più fisiologiche.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL IgG di topo, Ab intero legato a HRP (da pecore)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>Antibdoy secondario</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rat IgG, Ab intero legato a HRP (da asino)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>Antibdoy secondario</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 beads</td></tr><tr><td>Anticorpo monocolonale anti-GFP</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anti-HA Alta affinità</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anticorpo monocolonale anti-Mdm2 (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anticorpo monocolonale anti-p53 (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG Peptide</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>Preparare il tampone di eluizione</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>integratore</td></tr><tr><td>Guanidina-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>solvente</td></tr><tr><td>H1299</td><td>Banca di cellule staminali, Accademia cinese di Scienze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio di immagini</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Immidazolo</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescente HRP Substrato</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 reagenti</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>Inibitore del proteasoma</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>solvente</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>solvente</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>solvente</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Ni-NTA agarosio</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td><td>resina caricata con nichel</td></tr><tr><td>Membrana di tamponamento in nitrocellulosa</td><td>GE healthcare</td><td>10600002</td><td>0,45 &; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Opti-MEM siero ridotto mezzo</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>mezzo di trasfezione</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>cocktail di</td></tr><tr><td>antibiotici inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1ACS</td><td>medio</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>solvente</td></tr><tr><td>SDS Caricamento Tampone</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>integratore</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Triton Reagente X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Integratore Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging a chemiluminescenza ad altissima sensibilità Bio-rad</td><td></td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td></td></tr></tbody></table> solvente

purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

L'ubiquitinazione è un tipo di modificazione post-traduzionale che regola non solo la stabilità, ma anche la localizzazione e la funzione di una proteina substrato. Il processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola quasi tutti i processi biologici cellulari di base. La purificazione delle proteine ubiquitinate aiuta lo studio del ruolo dell'ubiquitinazione nel controllo della funzione delle proteine substrato. Qui, una procedura passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero è descritta con la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione. La proteina p53 cellulare totale Flag-tagged è stata purificata con agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag in condizioni non denaturanti. In alternativa, la proteina ubiquitinata cellulare totale marcata con His-è stata purificata utilizzando resina carica di nichel in condizioni di denaturazione. Le proteine p53 ubiquitinate negli eluati sono state rilevate con successo con anticorpi specifici. Utilizzando questa procedura, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica.

Il diagramma schematico mostra le proteine p53 marcate con bandiera (Flag-p53) e ubiquitina (HH-Ub) con doppia marcatura His/HA (Figura 1A). Le procedure utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate sono riassunte nella Figura 1B. L'ubiquitina Poly-His-taggata può essere legata alle proteine bersaglio nelle cellule di mammifero. Le proteine ubiquitinate possono essere purificate con sfere Flag/M2 in condizioni di non denaturazione o mediante cromatografia ...

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Utilizzando questo protocollo, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica. La purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero rispetto alla purificazione in vitro mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più radiologiche. Iniziare aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo sierico ridotto in tre provette da centrifuga da 15 millilitri.Aggiungere DNA plasmidico pronto per la trasfezione a ciascun tubo e aggiungere 0,2 microgrammi di plasmide proteico fluorescente verde per monitorare l'efficienza della trasfezione. Aggiungere 78 microlitri di reagente di trasfezione liposomica a 4,5 millilitri di mezzo sierico ridotto in un'altra provetta da centrifuga per diluire i liposomi. Mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e poi lasciarlo riposare per cinque minuti a temperatura ambiente.Aggiungere 1,5 millilitri della soluzione liposomica diluita in ciascuna provetta contenente 1,5 millilitri della soluzione di DNA diluito. Mescolare accuratamente e reticolare i plasm

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Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in...

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Questo video descrive un metodo per estrarre e purificare peptidi ubiquitinilati contenenti residui di peptidi di-glicina da una miscela di peptidi complessi. Il metodo presentato può aiutare a identificare i siti di ubiquitinazione originali nella proteina.

Estrazione basata sull'immunoaffinità di peptidi ubiquitinilati: una tecnica per estrarre selettivamente peptidi marcati con ubiquitina da frazioni peptidiche purificate

Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione dei compartimenti cellulari dove antigeni esogeni vengono elaborati dal reticolo endoplasmatico-collegata di degradazione in cross-presentazione.

Purificazione del compartimento di membrana per la degradazione del reticolo endoplasmatico-collegata di antigeni esogeni in Cross-presentazione

A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

L'ubiquitinazione è un regolatore critico delle funzioni intracellulari delle proteine. Qui descriviamo due metodi di lisi cellulare per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato nelle cellule dei mammiferi e confrontiamo la loro efficacia nell'analisi dei livelli di ubiquitinazione. La sovraespressione proteica nelle cellule di HEK293T è stata indotta tramite trasfezione transitoria, mentre proteine ubiquitinate sono state rilevate tramite analisi western blot.

Strategie comparative per il rilevamento dell'ubiquitinazione nei lisati cellulari di mammiferi utilizzando SMAD2/SMURF2 come modello

Questo protocollo descrive un metodo per ubiquitinare Streptococcus pneumoniae utilizzando lisato cellulare di mammifero o complesso enzimatico puro ubiquidina, seguito da un trattamento con complesso proteico purificato VCP/p97-UFD1-NPLOC4 per valutarne l'attività batteriolitica, consentendo lo studio degli effettori immunitari dipendenti da ubiquidina.

In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

Impara a purificare le proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero. Questo metodo consente di studiare il ruolo dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica in biologia cellulare.

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

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