Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

La trasparenza corneale è strumentale alla visione chiara. In un contesto patologico, questa trasparenza può essere una sfida. Studiare il meccanismo di patogenesi richiede modelli semplici che abbiano un'elevata somiglianza con l'organo umano.

In questi aspetti, il pesce zebra è un modello eccellente. E questa è la prima descrizione dettagliata dell'abrasione corneale nel pesce zebra. Questa tecnica è un modo semplice e veloce per indurre l'ingresso superficiale all'occhio.

La chiusura della ferita può essere seguita facilmente dopo l'abrasione. Inoltre, sostanze chimiche, o fattori specifici, possono essere aggiunti all'acqua del serbatoio per studiare il loro impatto sulla chiusura della ferita. Poiché la ferita viene creata manualmente, il metodo richiede un po 'di pratica per ottenere risultati coerenti.

Prima dell'esperimento, preparare una soluzione di lavoro allo 0,02% di tricaina. Scongelare 2 ml di soluzione madre allo 0,4%. Aggiungere a 40 ml di acqua di sistema.

E metti la soluzione in un piccolo contenitore. Avere la bava oftalmica pronta controllando se la punta della bava è pulita. E se necessario, rimuovere i detriti cellulari con un batuffolo di cotone umido.

Fai un'incisione sul lato di una spugna morbida. E inumidire la spugna con acqua di sistema. Posizionare la spugna sul palco di un microscopio di dissezione.

Garantire uno spazio di lavoro sufficiente per l'utilizzo della bava. E abbastanza illuminazione dal lato e sopra per vedere correttamente la superficie dell'occhio. Posizionare delicatamente il pesce anestetizzato con un cucchiaio nell'incisione sulla spugna con la testa sporgente dalla superficie della spugna.

Avvicinarsi con attenzione alla superficie dell'occhio con la punta della bava. E inizia a muovere la punta sulla superficie dell'occhio con un movimento circolare. Quando l'abrasione è fatta, posizionare con cura il pesce nell'acqua del sistema fresco contenente analgesico per il recupero.

Pulire la bava immediatamente dopo l'uso con un batuffolo di cotone umido. Raccogliere il pesce nel punto temporale desiderato e metterlo in soluzione di tricaina allo 0,02%. Tenere l'animale nella soluzione fino a quando il movimento opercolare non è cessato completamente e il pesce non reagisce al tatto.

Metti il pesce su una capsula di Petri con un cucchiaio e tienilo con una pinzetta. Decapitare il pesce con le forbici sezionanti. Evitare di fare graffi sulla superficie dell'occhio.

Mettere il tessuto in una provetta contenente 0,1 M fosfato di sodio. E risciacquarlo con un tampone pulito in modo che non rimanga sangue nella soluzione. Fissare il tessuto in glutaraldeide al 2,5% in 0,1 M di fosfato di sodio per 24 ore a 4 C.Rimuovere la soluzione fissante e risciacquare il campione più volte con 0,1 M di fosfato di sodio.

Sezionare il campione posizionandolo su una goccia di 0,1 M di fosfato di sodio su una piastra di dissezione. Tagliare il campione di testa in due con forbici da dissezione fine. In alternativa, raccogliere gli occhi posizionando con cura le punte delle pinzette sottili nelle orbite oculari dal lato dell'occhio.

Quindi, estrarre l'occhio dall'orbita e rimuovere il tessuto extra. Trasferire il campione sezionato in un tubo contenente 0,1 M fosfato di sodio. Assicurarsi che non vi sia tessuto extra nella provetta del campione, in quanto potrebbe aderire alla parte superiore dell'occhio durante l'elaborazione del campione.

Posizionare il supporto con la linguetta su un supporto. E il supporto alla base di un microscopio sezionante. Posizionare delicatamente il campione di tessuto sul supporto con una pinzetta fine, la cornea rivolta verso l'alto.

Rivestire il campione con platino utilizzando il dispositivo appropriato. E conservare i campioni a temperatura ambiente fino all'imaging. Acquisisci immagini dell'ingrandimento desiderato.

E usa immagini da 2000 a 2500x per l'analisi. Regola la luminosità e il contrasto per vedere chiaramente tutti i bordi delle celle e le microridge. Ed evita le aree sovraesposte nell'immagine.

Aprire l'immagine TIFF con Fiji ImageJ 1.53. E usa una barra della scala per impostare la scala. Create una linea uguale alla barra di scala con lo strumento linea.

Seleziona Analizza. Quindi, imposta la scala. E digita la distanza nota.

Quindi, apri il ROI manager utilizzando il menu Analizza, Strumenti. Per le dimensioni e la rotondità della cella, selezionate Analizza (Analyze), Imposta misure (Set Measurements), Descrittori forma (Shape desintors). E usa lo strumento Lente di ingrandimento per vedere le celle sotto ingrandimento.

Selezionare le celle con lo strumento Poligono e aggiungere ogni selezione al gestore del ROI. Infine, misurare le celle selezionate e salvare la misurazione. Per procedere con l'analisi microridge, assicurarsi che l'immagine sia in formato a 8 bit facendo clic sul menu Immagine, Tipo.

Quindi, selezionate la cella con lo strumento Poligono. E cancella lo sfondo facendo clic su Modifica, quindi su Cancella all'esterno. Smussate l'immagine da una a tre volte selezionando Elabora, Liscia .

E regola la luminosità e il contrasto da Immagine, Regola, Luminosità / Contrasto, in modo che le microridge si distinguano nel modo più chiaro possibile. Convolvere l'immagine cliccando su Processo, Filtri, Convolve. E trasformalo in binario facendo clic su Processo, Binario, Crea binario.

Quindi, scheletrare l'immagine in bianco e nero selezionando Elabora, Binario, Scheletra. Utilizzare la funzione Scheletro analizzato per misurare i parametri microridge e salvare i valori. L'area della ferita è chiusa a tre ore dopo la ferita.

Ma il sito in cui si uniscono i bordi delle ferite rimane visibile. I risultati hanno mostrato che sull'epitelio corneale abraso le microridge possono essere osservate in alcune cellule allungate vicino al sito della ferita. In alcune regioni periferiche, le microridge vengono perse dal centro della cellula.

Un confronto tra le due regioni periferiche, ha mostrato cellule allungate con microridge medie più corte, indicando riarrangiamenti cellulari come reazione alla ferita. Questi risultati suggeriscono che i cambiamenti della forma cellulare sono correlati alla modifica della microridge e sottolineano l'eterogeneità all'interno dell'epitelio corneale nella risposta della ferita. Ricorda che l'operazione richiede un allenamento per eseguire una ferita omogenea e riproducibile.

Oltre alla microscopia elettronica, il tessuto può essere utilizzato per l'istologia, le colorazioni immunologiche e l'ibridazione in situ. Questi forniranno ulteriori informazioni sui cambiamenti cellulari e molecolari durante la guarigione delle ferite. L'uso di zebrafish amplia le nostre conoscenze sulla biologia corneale.

Inoltre, questo modello è eccellente per gli studi farmacologici e può essere utilizzato per capire di più sull'evoluzione degli occhi.