Name: Zebrafish Corneal Wound Healing: dallabrasione allanalisi di imaging della chiusura della ferita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Scopri la tecnica di abrasione corneale in Danio rerio per studiare la guarigione delle ferite oculari. Questo metodo permette di analizzare i cambiamenti cellulari tramite microscopia elettronica a scansione.

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Gli autori ringraziano Pertti Panula per l'accesso all'unità Zebrafish e Henri Koivula per la guida e l'aiuto con gli esperimenti di zebrafish. Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia di Finlandia, dalla Fondazione Jane e Aatos Erkko, dalla Fondazione culturale finlandese e dal programma ATIP-Avenir. L'imaging è stato eseguito presso l'unità di microscopia elettronica e l'unità di microscopia ottica, Istituto di biotecnologia, supportato da HiLIFE e Biocenter Finland.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal consiglio nazionale per gli esperimenti sugli animali.
1. Preparativi
<ol><li>Preparare in anticipo la soluzione madre di tricaina utilizzata per l'anestesia26 (soluzione madre allo 0,4% utilizzata in questo protocollo). Utilizzare guanti e tenere i materiali in una cappa aspirante quando possibile.<ol>
<li>Per 50 ml di una soluzione allo 0,4%, pesare 200 mg di polvere di tricaina in un tubo da 50 ml. Sciogliere la polvere in circa 45 ml di acqua a doppio distillato.</li>
		<li>Regolare il pH della soluzione madre di tricaina a 7 con 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 mL). Aggiungere la soluzione di Tris allo stock di tricaina in aliquote, mescolare accuratamente il brodo dopo ogni aliquota e controllare il pH dopo ogni aggiunta di Tris.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima dell'esperimento, preparare una soluzione di lavoro allo 0,02% di tricaina.<ol>
<li>Scongelare 2 mL di soluzione madre allo 0,4% e aggiungere a 40 mL di acqua di sistema (concentrazione finale 0,02%). Posizionare la soluzione in un piccolo contenitore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima dell'esperimento, preparare l'acqua di recupero contenente analgesico. Utilizzare guanti e tenere i materiali nel cappuccio dei fumi quando possibile.<ol>
<li>Per un litro di acqua di recupero, pesare 2,5 mg di lidocaina cloridrato in polvere e scioglierlo in acqua dolce del sistema. Controllare il pH e regolare a 7 se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima dell'esperimento, preparare la soluzione fissante (glutaraldeide al 2,5% in soluzione di fosfato di sodio 0,1 M (Na-PO4) a pH 7,4). Utilizzare guanti e tenere i materiali in una cappa aspirante.<ol>
<li>Per 10 mL della soluzione di fissaggio, pipettare 5 mL di 0,2 M Na-PO4 in un tubo. Aggiungere 0,5 ml di glutaraldeide al 50% e aggiungere acqua a doppio distillato per ottenere il volume finale di 10 ml. Proteggere la soluzione dalla luce e conservarla sul ghiaccio o in frigorifero prima dell'uso. NOTA: se i campioni devono essere raccolti per diverse ore dopo l'avvolgimento, preparare la soluzione fissante appena prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare l'attrezzatura per il ferimento (Figura 1).<ol>
<li>Riempire i serbatoi di recupero o i contenitori più piccoli con acqua di sistema.</li>
		<li>Avere la bava oftalmica pronta. Controllare che la punta della bava sia pulita. Se necessario, rimuovere i detriti cellulari con un batuffolo di cotone umido.</li>
		<li>Fai un'incisione sul lato di una spugna morbida e inumidisci la spugna con acqua di sistema. Posizionare la spugna sulla base/ stadio di un microscopio di dissezione. Garantire uno spazio di lavoro sufficiente per l'utilizzo della bava e un'illuminazione sufficiente dai lati e/o dall'alto per vedere correttamente la superficie dell'occhio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Trasferire un pesce dall'acquario alla soluzione di tricaina allo 0,02% con una rete il più delicatamente possibile.</li>
	<li>Monitorare l'anestesia, verificando la mancanza di risposta allo stimolo meccanico della luce. NOTA: per un'anestesia coerente, viene utilizzata un'esposizione di 2 minuti alla tricaina prima dell'abrasione con pesci AB selvatici adulti. Con pesci di altro background genetico, potrebbe essere necessaria una durata diversa.</li>
</ol>3. Abrasione
<ol><li>Posizionare delicatamente il pesce anestetizzato con un cucchiaio nell'incisione sulla spugna, con la testa sporgente dalla superficie della spugna.</li>
	<li>Accendere la bava e focalizzare la vista del microscopio sulla superficie dell'occhio.</li>
	<li>Avvicinarsi con attenzione alla superficie dell'occhio con la punta della bava. Quando tocchi la superficie dell'occhio, inizia a muovere la punta della bava sulla superficie dell'occhio con un movimento circolare. Evitare movimenti improvvisi, in quanto potrebbero portare all'inclinazione dell'occhio nella presa e alla punta della bava per scivolare.</li>
	<li>Quando l'abrasione è fatta, posizionare con cura il pesce nell'acqua di sistema contenente l'analgesico per il recupero.</li>
	<li>Pulire la bava subito dopo l'uso con un batuffolo di cotone umido.</li>
</ol>4. Raccolta di campioni
<ol><li>Nel momento desiderato, raccogliere il pesce con una rete e metterlo in soluzione di tricaina allo 0,02%. Tenere l'animale nella soluzione fino a quando il movimento opercolare non è cessato completamente e il pesce non reagisce al tatto.</li>
	<li>Metti il pesce su una capsula di Petri con un cucchiaio e tienilo con una pinzetta. Decapitare il pesce con le forbici sezionanti. Evitare di fare graffi sulla superficie dell'occhio durante la manipolazione del campione.</li>
	<li>Mettere il tessuto in una provetta contenente 0,1 M Na-PO4.<ol>
<li>Risciacquare il tessuto sostituendo il Na-PO4 0,1 M con un tampone pulito in modo che non rimanga sangue nella soluzione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Elaborazione del campione per microscopia elettronica
<ol><li>Fissare il tessuto in glutaraldeide al 2,5%/0,1 M Na-PO4 (pH 7,4) per ~24 h a +4 °C. Tenere il campione su un portacampioni rotante/tremante per garantire una corretta fissazione.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione fissante e risciacquare il campione più volte con 0,1 M Na-PO4.</li>
	<li>Sezionare il campione a questo punto.<ol>
<li>Posizionare il campione su una goccia di 0,1 M Na-PO4 su una piastra di dissezione. Se entrambi gli occhi dello stesso pesce devono essere ripresi, tagliare il campione di testa in due con forbici da dissezione fine.</li>
		<li>In alternativa, raccogliere gli occhi solo posizionando con cura le punte delle pinzette sottili nell'orbita oculare dal lato dell'occhio, facendo particolare attenzione a non graffiare la superficie dell'occhio. Quindi, estrarre l'occhio dalla presa.</li>
		<li>Trasferire il campione sezionato in una provetta contenente 0,1 M Na-PO4. Assicurarsi che non vi sia tessuto extra nella provetta del campione, in quanto potrebbe aderire alla parte superiore dell'occhio durante l'elaborazione del campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conservare il campione in 0,1 M Na-PO4 (massimo una settimana) a +4 °C.</li>
	<li>Elaborare i campioni per l'imaging al microscopio elettronico.<ol>
<li>Postfiggere i campioni in tetrossido di osmio al 2% in tampone Na-PO4 da 0,1 M per 1 ora a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Lavare i campioni 3 volte per 5 minuti ogni lavaggio in 0,1 M Na-PO4 a RT.</li>
		<li>Disidratare i campioni successivamente in etanolo al 30%, 50% e 70% per 1 ora in ogni soluzione a RT.</li>
		<li>Immergere i campioni in etanolo al 96% per 2-3 ore a RT.</li>
		<li>Successivamente, incubare i campioni due volte in etanolo al 100%, prima per 1 ora e poi in etanolo fresco al 100% durante la notte a +4 °C.</li>
		<li>Sottoporre i campioni a 30 cicli in un essiccatore automatico a punti critici.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporare e rivestire in platino i campioni.<ol>
<li>Posizionare una linguetta adesiva su un supporto. Se il campione deve essere contrassegnato sulla parte superiore del supporto, lasciare un pezzo di carta da copertina della scheda sulla scheda e scrivere l'ID del campione sulla carta.</li>
		<li>Posizionare il supporto con la linguetta sulla base di un microscopio di dissezione.</li>
		<li>Posizionare delicatamente il campione di tessuto sul supporto con una pinzetta fine, la cornea rivolta verso l'alto.</li>
		<li>Rivestire il campione con platino utilizzando il dispositivo appropriato. Dopo il rivestimento, conservare i campioni a temperatura ambiente fino all'imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Imaging (Figura 2)
<ol><li>Utilizzare i dispositivi come consigliato nel manuale dell'utente e dagli esperti di imaging.</li>
	<li>Acquisisci immagini dell'ingrandimento desiderato e utilizza immagini 2.000-2.500x per l'analisi.</li>
	<li>Regola la luminosità e il contrasto in modo che non ci siano aree sovraesposte nell'immagine e i bordi delle celle e le microridge siano visti nel modo più chiaro possibile. NOTA: la posizione e l'angolo del tessuto influiscono sulle impostazioni di luminosità e contrasto. Potrebbe essere necessario regolarli da campione a campione e tra diverse regioni del tessuto.</li>
</ol>7. Misurazione della forma, delle dimensioni e del modello di microridge della cella
<ol><li>Aprire l'immagine TIFF in Fiji ImageJ 1.5327. Impostate la scala utilizzando la barra della scala dell'immagine: create una linea di dimensioni uguali alla barra della scala con lo strumento linea . Seleziona Analizza | Impostare la scala e digitare la distanza nota. Aprire il ROI manager dal | Analizza Menu Strumenti .</li>
	<li>Per le dimensioni e l'rotondità della cella, selezionate Analizza | Impostare le misure | Descrittori di forma. Utilizzare lo strumento Lente di ingrandimento per visualizzare le celle in ingrandimento. Selezionare le celle con lo strumento Poligono e aggiungere ogni selezione al gestore del ROI. Infine, misurare le celle selezionate e salvare la misurazione.</li>
	<li>Analisi di Microridge (Figura 3 e Figura 4)<ol>
<li>Assicurarsi che l'immagine sia in formato a 8 bit dal | Menu Tipo .</li>
		<li>Selezionate una cella con lo strumento Poligono e cancellate lo sfondo da Modifica | Chiaro all'esterno.</li>
		<li>Smussate l'immagine da una a tre volte selezionando Elabora | Fluida e regola la luminosità e il contrasto da Image | Regolare | Luminosità / Contrasto in modo che le microridge si distinguano nel modo più chiaro possibile.</li>
		<li>Convolvere l'immagine da Process | Filtri | Convolvere, trasforma in binario da Process | | binaria Crea binario e scheletra l'immagine in bianco e nero selezionando Elabora | | binaria Scheletrare.</li>
		<li>Utilizzare la funzione Analizza ossatura nel | Analizza Menu Scheletro per misurare i parametri microridge e salvare i valori. NOTA: in SEM, le singole immagini possono differire in termini di luminosità e contrasto. Pertanto, i passaggi dell'analisi potrebbero richiedere regolazioni da un'immagine all'altra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li>
<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li>
<li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Le lesioni fisiche corneali sono la causa più comune di visite dei pazienti oftalmologici in ospedale. Pertanto, è importante stabilire modelli pertinenti per lo studio di diversi aspetti della fisiopatologia corneale. Finora, il topo è il modello più comunemente usato per lo studio della guarigione delle ferite corneali. Tuttavia, l'aggiunta di colliri sugli occhi feriti murini per convalidare l'impatto di farmaci specifici sulla guarigione delle ferite corneali può essere difficile. A questo proposito, il modello zebra...

Poiché la maggior parte degli epiteli sono a contatto con l'ambiente esterno, sono soggetti a lesioni fisiche, rendendoli adatti per lo studio dei processi di guarigione delle ferite. Tra i tessuti ben studiati, la cornea è un modello estremamente utile nello studio degli aspetti cellulari e molecolari della guarigione delle ferite. Come superficie esterna trasparente, fornisce protezione fisica all'occhio ed è il primo elemento a focalizzare la luce sulla retina. Mentre la struttura e la composizione cellulare della retina differiscono tra la specie1, questi elementi della cornea sono generalmente simili in tutti gli occhi di tipo camera, indipendentemente dalla specie.
La cornea è composta da tre strati principali2. Il primo e più esterno strato è l'epitelio, che viene costantemente rinnovato per garantirne la trasparenza. Il secondo strato è lo stroma, che contiene cellule sparse, chiamate cheratociti, all'interno di uno spesso strato di fibre di collagene rigorosamente organizzate. Il terzo e più interno strato è l'endotelio, che consente la diffusione di nutrienti e liquidi dalla camera anteriore agli strati esterni. Le cellule epiteliali e stromali interagiscono attraverso fattori di crescita e citochine3. Questa interazione è evidenziata dalla rapida apoptosi e dalla successiva proliferazione dei cheratociti dopo danno epiteliale 4,5. In caso di una ferita più profonda, come una puntura, i cheratociti prendono parte attiva al processo di guarigione6.
Essendo a contatto con l'ambiente esterno, le lesioni fisiche corneali sono comuni. Molti di loro sono causati da piccoli oggetti estranei7, come sabbia o polvere. Il riflesso dello sfregamento degli occhi può portare a estese abrasioni epiteliali e rimodellamento corneale8. Secondo le dimensioni e la profondità della ferita, queste lesioni fisiche sono dolorose e richiedono diversi giorni per guarire9. Le caratteristiche ottimali di guarigione delle ferite di un modello facilitano la comprensione degli aspetti cellulari e molecolari della chiusura della ferita. Inoltre, tali modelli si sono dimostrati utili anche per testare nuove molecole con il potenziale di accelerare la guarigione corneale, come precedentemente dimostrato10,11.
Il protocollo qui descritto mira a utilizzare il pesce zebra come modello rilevante per studiare le lesioni fisiche corneali. Questo modello è molto conveniente per gli studi di screening farmacologico in quanto consente di aggiungere molecole direttamente all'acqua del serbatoio e, quindi, di entrare in contatto con una cornea curativa. I dettagli forniti qui aiuteranno gli scienziati a eseguire i loro studi sul modello di zebrafish. La lesione in vivo viene eseguita con una bava oculare opaca. L'impatto sulle cellule epiteliali adiacenti o a distanza da esso può essere analizzato rimuovendo specificamente l'epitelio corneale centrale. Negli ultimi anni, numerosi rapporti si sono concentrati su tale metodo sulla cornea dei roditori 12,13,14,15,16,17; tuttavia, ad oggi, solo un singolo rapporto ha applicato questo metodo al pesce zebra18.
A causa della sua semplicità, la ferita fisica è utile per delineare il ruolo delle cellule epiteliali nella chiusura della ferita. Un altro modello ben consolidato di danno corneale è l'ustione chimica, in particolare l'ustione alcalina 19,20,21. Tuttavia, un tale approccio danneggia indirettamente l'intera superficie oculare, compresa la cornea periferica e lo stroma corneale19. In effetti, le ustioni alcaline potenzialmente inducono ulcere corneali, perforazioni, opacizzazione epiteliale e rapida neovascolarizzazione22, e l'esito incontrollabile delle ustioni alcaline squalifica tale approccio per gli studi generali di guarigione delle ferite. Numerosi altri metodi sono utilizzati anche per studiare la guarigione delle ferite corneali secondo il particolare focus dello studio in questione (ad esempio, debridement epiteliale completo23, la combinazione di lesioni chimiche e meccaniche per ferite a spessore parziale24, ablazione laser ad eccimeri per ferite che si estendono allo stroma25). L'uso di una bava oculare limita il punto focale alla risposta epiteliale alla ferita e fornisce una ferita altamente riproducibile.
Come con ogni metodo di inflizione della ferita, l'uso di una bava oculare presenta vantaggi e svantaggi. Lo svantaggio principale è che la risposta essendo per lo più epiteliale, non riflette perfettamente le abrasioni osservate in ambito clinico. Tuttavia, questo metodo presenta numerosi vantaggi, tra cui la facilità con cui può essere impostato ed eseguito, la sua precisione, la sua riproducibilità e il fatto che non sia invasivo, rendendolo un metodo ben tollerato dagli animali.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Na-PO4 (tampone fosfato di sodio), pH 7,4</td> La soluzione <td>interna</td><td></td><td>è preparata da 1 M di tampone fosfato di sodio (1 M Na2 HPO4 regolato a pH 7,4 con 1 M NaH2 PO4 ).</td></tr><tr><td>0,2 M Na-PO4 (tampone fosfato di sodio), pH 7,4</td><td>La soluzione interna</td><td></td><td>è preparata da 1 M di tampone fosfato di sodio (1 M Na2 HPO4 regolato a pH 7,4 con 1 M NaH2 PO4 ).</td></tr><tr><td>Punte di fresa da 0,5 mm</td><td>Alger Equipment Company</td><td>BU-5S</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris, pH 8,8</td><td></td> linguette adesive interne <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Fresa Algerbrush, strumento completo</td><td>Alger Equipment Company</td><td>BR2-5</td><td></td></tr><tr><td>Scambi di cotone</td><td>Heinz Herenz Amburgo</td><td>1030128</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td> <td>di dissezionestrumenti</td> di dissezione interni <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr> acqua <tr><td>distillata doppia</td> provette <td>Eppedorf interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 2ml</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato metansolfonato sale</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Attenzione: provoca irritazione.</td></tr><tr><td>Glutaraldeide, soluzione acquosa al 50%, grado I</td><td>Sigma</td><td>G7651</td><td>Attenzione: tossico.</td></tr><tr><td>Lidocaina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>L5647</td><td>Attenzione: tossico.</td></tr><tr><td>monta</td><td>Agar Scientific</td><td>G301P</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20</td><td></td></tr><tr><td>Strisce indicatrici di pH</td><td>Macherey-Nagel</td><td>92110</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiai di plastica</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi di plastica, 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di plastica, 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>FEI</td><td>Quanta 250 FEG</td><td></td></tr><tr><td>Spugna morbida</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Quorum Technologies</td><td>GQ150TS</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish corneal wound healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

Come la superficie trasparente dell'occhio, la cornea è strumentale per la visione chiara. A causa della sua posizione, questo tessuto è soggetto a insulti ambientali. In effetti, le lesioni oculari più frequentemente riscontrate clinicamente sono quelle alla cornea. Mentre la guarigione delle ferite corneali è stata ampiamente studiata nei piccoli mammiferi (cioè topi, ratti e conigli), gli studi di fisiologia corneale hanno trascurato altre specie, incluso il pesce zebra, nonostante il pesce zebra sia un classico modello di ricerca.
Questo rapporto descrive un metodo per eseguire un'abrasione corneale sul pesce zebra. La ferita viene eseguita in vivo su pesci anestetizzati utilizzando una bava oculare. Questo metodo consente una ferita epiteliale riproducibile, lasciando intatto il resto dell'occhio. Dopo l'abrasione, la chiusura della ferita viene monitorata nel corso di 3 ore, dopo di che la ferita viene rielettileializzata. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, seguita dall'elaborazione delle immagini, la forma della cellula epiteliale e le protrusioni apicali possono essere studiate per studiare i vari passaggi durante la chiusura della ferita epiteliale corneale.
Le caratteristiche del modello zebrafish consentono lo studio della fisiologia del tessuto epiteliale e del comportamento collettivo delle cellule epiteliali quando il tessuto viene sfidato. Inoltre, l'uso di un modello privato dell'influenza del film lacrimale può produrre nuove risposte per quanto riguarda la risposta corneale allo stress. Infine, questo modello permette anche la delineazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti in qualsiasi tessuto epiteliale sottoposto ad una ferita fisica. Questo metodo può essere applicato alla valutazione dell'efficacia del farmaco nei test preclinici.

Questo studio descrive un metodo che utilizza una bava oftalmica in esperimenti di guarigione delle ferite corneali zebrafish. Il metodo è stato modificato da studi precedenti sui topi, dove la bava ha dimostrato di rimuovere gli strati cellulari epiteliali in modo efficiente13. Le sfide nel ferimento corneale del pesce zebra includono le dimensioni relativamente piccole dell'occhio e, nel caso di esperimenti che richiedono tempo, la necessità di mantenere un flusso d'acqua costante attraverso le ...

Questo protocollo si concentra sul danneggiamento della superficie oculare del pesce zebra attraverso l'abrasione per valutare la successiva chiusura della ferita a livello cellulare. Questo approccio sfrutta una bava oculare per rimuovere parzialmente l'epitelio corneale e utilizza la microscopia elettronica a scansione per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare durante la chiusura della ferita.

Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

La trasparenza corneale è strumentale alla visione chiara. In un contesto patologico, questa trasparenza può essere una sfida. Studiare il meccanismo di patogenesi richiede modelli semplici che abbiano un'elevata somiglianza con l'organo umano.In questi aspetti, il pesce zebra è un modello eccellente. E questa è la prima descrizione dettagliata dell'abrasione corneale nel pesce zebra. Questa tecnica è un modo semplice e veloce per indurre l'ingresso superficiale all'occhio.La chiusura della ferita può essere seguita facilmente dopo l'abrasione. Inoltre, sostanze chimiche, o fattori specifici, possono essere aggiunti all'acqua del serbatoio per studiare il loro impatto sulla chiusura della ferita. Poiché la ferita viene creata manualmente, il metodo richiede un po 'di pratica per ottenere risultati coerenti.Prima dell'esperimento, preparare una soluzione di lavoro allo 0,02% di tricaina. Scongelare 2 ml di soluzione madre allo 0,4%. Aggiungere a 40 ml di acqua di sistema.E metti la soluzione in un piccolo contenitore. Avere la bava oftalmica pronta controllando se la punta della bava è pulita. E se necessario, rimuovere i detriti cellulari con un batuffolo di cotone umido.Fai un'inc

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Questo video mostra una procedura per indurre la degenerazione retinica in zebrafish adulti utilizzando lesioni laser. Il laser prende di mira le cellule fotorecettrici della retina, innescando la morte cellulare e un processo degenerativo. Questo danno attiva le cellule della glia di Müller (MG), portando alla loro dedifferenziazione in progenitori di cellule staminali che aiutano nella rigenerazione retinica.

Modellazione della degenerazione e della rigenerazione retinica nel pesce zebra utilizzando una lesione laser focale

Per far luce sui meccanismi cellulari e molecolari della neurogenesi e della rigenerazione adulta del pesce zebra, abbiamo sviluppato un protocollo per la chirurgia invasiva che causa lesioni meccaniche nel telencefalo adulto del pesce zebra e il successivo monitoraggio dei cambiamenti nell'emisfero pugnalato mediante immunoistochimica o ibridazione in situ.

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Presentiamo un protocollo per catturare la dinamica della rigenerazione della pinna caudale larvale del pesce zebra su una scala dell'intero tessuto utilizzando la stereomicroscopia basata sul campo chiaro. Questa tecnica consente di catturare le dinamiche di rigenerazione con la risoluzione di una singola cella. Questa metodologia può essere adattata a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCD e di un software time-lapse.

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Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto delle malattie.

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Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

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Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.

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Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

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