Preparazione e caratterizzazione di bioink idrogel bioibrido 3D a base di grafene per la neuroingegneria periferica

Il sistema delle cellule staminali è sotto l'influenza dei suoi componenti importanti. La conservazione e la differenziazione delle cellule staminali è impensabile senza la presenza del loro microambiente. Questo microambiente, chiamato nicchia delle cellule staminali, è costituito da cellule e scaffold.

La neuropatia periferica può essere e occasionalmente, possono come lesioni al plesso brachiale, vari traumi, tumori, anomalie autonomiche, definizione immunitaria e malattia metabolica. Sono stati sviluppati vari metodi di coltura 3D per fornire una nicchia migliore e più naturale per le cellule staminali. La formazione di sferoidi e il bioprinting 3D sono metodi relativamente nuovi e promettenti per le colture 3D.

Il bioprinting 3D può essere utilizzato anche negli studi di neuroingegneria. Di conseguenza, all'interno di questo studio, sono stati sviluppati e studiati bioink a base di grafene e alginato / gelatina per le loro caratteristiche rigenerative. Per iniziare, colture di cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton o WJMSC in terreno DMEM F12 contenente il 10% di siero fetale di vitello o FBS, 1% penna / streptococco e 1% L-glutammina sotto un flusso laminare sterile a temperatura ambiente.

Quando le cellule coltivate sono confluenti all'80% nel pallone, versare il mezzo e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS. Quindi aggiungere cinque millilitri di 0,25% tripsina e 2,21 millimolari di sodio EDTA e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, aggiungere 10 millilitri di terreno DMEM F12 contenente il 10% FBS alle cellule.

Sospendere le cellule, raccogliere il mezzo e trasferirlo in una provetta da centrifuga. Quindi, centrifugare le cellule e scartare il surnatante prima di riseminare le cellule in un nuovo pallone con un mezzo nutritivo fresco contenente il 10% di FBS. Per preparare il bioink del gruppo di controllo senza grafene, pesare 4,5 milligrammi di alginato e 1,5 milligrammi di gelatina e trasferirli in una provetta da centrifuga.

Quindi aggiungere 50 millilitri di mezzo DMEM F12 contenente il 10% FBS al tubo. Ancora una volta, pesare 4,5 milligrammi di alginato e 1,5 milligrammi di gelatina e trasferirli in una provetta da centrifuga. Quindi aggiungere 50 microlitri di 0,1% di grafene al tubo e rendere il volume 50 millilitri con DMEM F12 mezzo contenente 10% FBS.

Mescolare i bioink mediante pipettaggio e vortice prima di autoclavare a 121 gradi Celsius sotto 1,5. pressione atmosferica per 20 minuti. Dopo l'autoclave, centrifugare la soluzione per rimuovere le bolle formate e posizionare i bioink a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non sono pronte.

Per l'interazione bioink cellulare, creare i gruppi bioink. Il primo gruppo include 3D-B e 3D-G stampati con bioink per il bioprinting. Il secondo gruppo comprende bioink 3D-BS e 3D-GS su cui si sono formati sferoidi dopo il bioprinting.

Per il gruppo uno, contare le cellule a una da 10 alla settima cella in 0,5 millilitri di mezzo. Quindi aggiungere 4,5 millilitri di bioink. Trasferire la miscela nelle cartucce nell'armadio sterile usando siringhe.

Installare le cartucce nella sezione estrusore corrispondente del bioprinter. Per il secondo gruppo, prendere cinque millilitri di bioink da ciascuno dei gruppi di bioink e trasferirli in cartucce sterili con l'aiuto di un iniettore. Utilizzare la bioprinter con due testine di stampa coassiali e la tecnologia di estrusione pneumatica.

Impostare la risoluzione XYZ per micropasso su 1,25 micrometri, la larghezza di estrusione su 400 micrometri e l'altezza di estrusione su 200 micrometri. Utilizzare una griglia di 20 x 20 x 5 millimetri per creare modelli 3D. Crea modelli 3D utilizzando programmi CAD open source basati sul web.

Per il processo di bioprinting 3D, impostare la pressione media della stampante su 7,5 psi. Quindi impostare la temperatura della cartuccia e del letto a 37 gradi Celsius e la velocità al 60%Posizionare il sistema nella posizione iniziale durante la fase di scrittura. Posizionare automaticamente gli assi e selezionare e impostare l'estrusore prima di iniziare il processo di bioprinting.

Dopo la stampa, rimuovere il campione e posizionarlo sotto un armadio a flusso laminare. Quindi, spruzzare i bioink con una soluzione normale di cloruro di calcio 0,1 o aggiungere una soluzione da un millilitro con una pipetta a temperatura ambiente e attendere da 10 a 20 secondi. Quindi lavare i modelli stampati due volte con PBS contenente calcio e magnesio.

Aggiungere due millilitri di terreno DMEM F12 con il 10% FBS sopra ogni cellula contenente il gruppo bioink e incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi, aggiungere due millilitri di mezzo di sospensione contenente uno per 10 alle cellule sesta per ciascun gruppo e incubare le piastre. Dopo 24 ore, osservare e fotografare tutti i lotti di bioink per la formazione di sferoidi al microscopio invertito per la differenziazione delle WJMSC in cellule simili ai neuroni ad eccezione del gruppo di controllo.

Aggiungere due millilitri di mezzo di differenziazione neurogena per pozzetto e aggiornare ogni due giorni. Seguire per sette giorni per osservare la differenziazione neurale. Successivamente, utilizzando l'imaging timelapse, esaminare gli effetti del grafene sulle cellule staminali e monitorare le interazioni cellulari all'interno del bioink.

L'effetto della concentrazione di grafene sulla proliferazione cellulare è dimostrato qui. Rispetto al controllo, è stata osservata una diminuzione significativa per la concentrazione di grafene dello 0,001%. Non ci sono state differenze significative tra gli altri gruppi e il controllo.

Le interazioni del grafene cellulare hanno mostrato che il grafene è stato tollerato nel sistema 2D ed è stato assunto dalle cellule attraverso l'endocitosi. L'imaging timelapse ha mostrato che le cellule sopravvissute nel mezzo di grafene 3D hanno mantenuto le loro vitalità attraverso la luminosità GFP fino alla fine dell'incubazione. Le immagini SEM e l'analisi FIIR dei gruppi di bioink 3D-B e 3D-G sono mostrate qui.

Le interazioni cellulari di Bioink sono state dimostrate sia sulla superficie che internamente. Le cellule erano morfologicamente rotonde e attaccate al materiale. Nella differenziazione neuronale 3D, è stato considerato che i bordi delle cellule sferoidi in entrambi i gruppi erano trasparenti e vivaci, e gli sferoidi nel gruppo del grafene erano relativamente più grandi e intrappolavano il grafene all'interno della cellula.

L'immunocolorazione delle cellule 2D e 3D è mostrata qui. Le immagini verdi rappresentano strutture simili a neuroni. Il campione di controllo positivo 2D ha espresso meno marcatori di struttura simili a neuroni rispetto ai campioni 3D.

Abbiamo scoperto che i bioink a base di grafene avevano più successo in termini di differenziazione delle cellule staminali in cellule simili ai neuroni. Proponiamo che i bioink a base di grafene sarebbero strumenti eccellenti per il trattamento dei disturbi dei nervi periferici in ulteriori studi. Oggi, il sistema delle cellule staminali può essere creato dall'ingegneria tissutale con biomateriali naturali e sintetici La creazione di tessuti artificiali che possono sostituire i tessuti viventi che possono essere utilizzati nella rigenerazione di questi tessuti, rimuovendo il danno e fornendo la funzione è fornita dall'ingegneria tissutale.