Analisi della dinamica del microbiota fecale in topi inclini al lupus utilizzando un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico
May 2nd, 2022
Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo della malattia autoimmune.
Il metodo di isolamento del DNA proposto può servire a studiare le dinamiche del microbiota intestinale in modelli murini di malattie autoimmuni. Viene proposto un metodo più versatile, economico ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali paragonabili ai kit disponibili in commercio. Per iniziare, prendi ogni topo individualmente fuori dalla sua gabbia, raccogli un pellet fecale direttamente dall'ano e conservalo a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene elaborato.
Elaborare i campioni con pinze, tubi e guanti sterili e puliti. Aggiungere un pellet congelato a un tubo a vite pre-pesato da due millilitri e registrare il peso fecale in grammi, che dovrebbe essere compreso tra 0,02 e 0,05 grammi per pellet fecale. Aggiungere al pellet uno strato sottile di perle di vetro da 0,1 millimetri, 500 microlitri di tampone di lisi e 200 microlitri di solfato di dodecile di sodio al 20%.
Bead ha battuto il tubo per quattro minuti in un omogeneizzatore, seguito da tre a cinque minuti di vortice. Centrifugare i tubi per un breve periodo per eliminare le bolle e la schiuma. Per estrarre il DNA dai campioni di microbiota, trasferire 350 microlitri di surnatante del campione in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri, senza detriti.
Aggiungere 500 microlitri di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico, in un rapporto di 25:24:1, e vortice per un minuto. Dopo la centrifugazione, trasferire 180 microlitri della fase acquosa superiore in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri. Aggiungere 180 microlitri di cloroformio, capovolgere e mescolare.
Da questo, trasferire 180 microlitri della fase acquosa in un nuovo tubo a scatto. In un armadio di biosicurezza, aggiungere 180 microlitri di isopropanolo freddo e 36 microlitri di acetato di ammonio a cinque molari. Capovolgere un paio di volte per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.
Scartare il surnatante, seguito dal lavaggio del pellet più volte con 500 microlitri di etanolo freddo al 70%. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il tubo capovolto su carta velina per 20 minuti, fino a quando il pellet diventa chiaro. Sospendi il pellet in 50 microlitri di acqua molecolare e riscalda il liquido a 37 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere completamente grandi pellet di DNA.
Dopo il riscaldamento, centrifugare questi tubi a 3.400 volte G per un minuto per recuperare le goccioline di condensa dal coperchio. Misurare la concentrazione e ottenere il rapporto 260/280 utilizzando uno spettrofotometro. Un rapporto per il DNA di buona qualità è generalmente compreso tra 1,8 e due.
Centrifugare i campioni preparati a 600 volte G per un minuto a temperatura ambiente, prima di congelare a meno 80 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, inviare 20 microlitri di campioni con concentrazioni comprese tra uno e 50 nanogrammi per microlitri all'Argonne National Laboratory per il sequenziamento. Il ceppo murino privo del recettore CX3CR1 ha una diversa composizione del microbiota intestinale rispetto ai topi MRL / LPR wild-type, MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP, mostra differenze significative in alcuni generi, rilevanti per batteri potenzialmente patogeni come quelli nel phylum Proteobacteria.
Fare attenzione a contaminare il campione. Deve essere sterile. Inoltre, è importante pipettare con precisione quando si trasferisce il surnatante in un nuovo tubo.
Questo metodo è adatto per l'analisi molecolare come la PCR, la digestione enzimatica di restrizione o la costruzione di librerie genomiche. Nel lupus, abbiamo dimostrato una forte relazione tra il microbiota intestinale e la progressione del lupus.
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Panoramica
Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo di malattie autoimmuni. Il metodo è progettato per studiare le dinamiche del microbiota intestinale nei modelli murini di malattie autoimmuni.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Autoimmunità
Contesto
- Comprendere il microbiota intestinale è cruciale nella ricerca sulle malattie autoimmuni.
- I metodi attuali per l'isolamento del DNA possono essere costosi e complessi.
- Questo studio propone un'alternativa più efficiente ed economica.
- I campioni fecali vengono utilizzati per analizzare i cambiamenti del microbiota.
Obiettivo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'estrazione del DNA dai campioni fecali.
- Facilitare lo studio del microbiota intestinale nei modelli di malattie autoimmuni.
- Confrontare l'efficienza del nuovo metodo con i kit commercialmente disponibili.
Metodi utilizzati
- Raccolta individuale di pallini fecali dai topi.
- Conservazione dei campioni a -80 gradi Celsius.
- Utilizzo di strumenti sterili per la lavorazione dei campioni.
- Preparazione dei campioni con tampone di lisi e perline di vetro.
Risultati principali
- Il metodo proposto produce una qualità del DNA paragonabile ai kit commerciali.
- È economico ed efficiente per l'analisi del microbiota.
- Facilita ulteriori ricerche sui meccanismi delle malattie autoimmuni.
Conclusioni
- Questo metodo di isolamento del DNA è uno strumento prezioso per i ricercatori.
- Supporta l'indagine del microbiota intestinale nei contesti di malattia.
- Incoraggia una ricerca più accessibile nel campo dell'autoimmunità.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reliable analysis of gut microbiota dynamics in autoimmune disease models is critical for understanding environmental and genetic contributions to disease progression. This cost-effective DNA isolation protocol enables scalable, reproducible extraction of microbial DNA from murine fecal samples, supporting high-throughput microbiome studies in preclinical research. The method enhances predictive confidence in linking microbiota shifts to autoimmune phenotypes, informing early discovery and translational strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbiota-immune system interactions in disease-relevant mouse models.
- Supports functional validation of candidate pathways influenced by gut microbial composition.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking microbial shifts to autoimmune progression.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible DNA samples for downstream sequencing and molecular assays.
- Ensures quantitative, high-quality DNA suitable for PCR and next-generation sequencing workflows.
- Enables scalable sample processing for comparative microbiome studies across experimental cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical microbiota profiling with disease progression and biomarker discovery efforts.
- Supports continuity from discovery-stage findings to translational validation in autoimmune models.
- Reduces biological ambiguity in linking environmental triggers to disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This DNA isolation protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling robust microbiome analysis in lupus-prone mouse models and supporting lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on microbiota-driven immune modulation in autoimmunity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative DNA outputs for sequencing-based microbiome profiling.
- Analytics: Provides high-quality input for statistical comparison of microbial community shifts between genotypes or treatments.
- Translational Research: Bridges preclinical microbiome findings to potential biomarker development in autoimmune disease.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective protocol adaptable to diverse murine models and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiota-disease associations and target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA extraction, improving reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by clarifying microbiome contributions to disease mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbiome-modulating interventions in autoimmune pipelines.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in sterile sample handling and molecular biology workflows.
- Needs access to homogenizers, centrifuges, and spectrophotometers for quality control.
- Demands rigorous cross-team standardization to minimize contamination and variability.
- Adaptable to various murine models but may require optimization for different sample types.
- Dependent on accurate pipetting and sterile technique to ensure data integrity.
