Analisi della dinamica del microbiota fecale in topi inclini al lupus utilizzando un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico
2 maggio 2022
Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo della malattia autoimmune.
Il metodo di isolamento del DNA proposto può servire a studiare le dinamiche del microbiota intestinale in modelli murini di malattie autoimmuni. Viene proposto un metodo più versatile, economico ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali paragonabili ai kit disponibili in commercio. Per iniziare, prendi ogni topo individualmente fuori dalla sua gabbia, raccogli un pellet fecale direttamente dall'ano e conservalo a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene elaborato.
Elaborare i campioni con pinze, tubi e guanti sterili e puliti. Aggiungere un pellet congelato a un tubo a vite pre-pesato da due millilitri e registrare il peso fecale in grammi, che dovrebbe essere compreso tra 0,02 e 0,05 grammi per pellet fecale. Aggiungere al pellet uno strato sottile di perle di vetro da 0,1 millimetri, 500 microlitri di tampone di lisi e 200 microlitri di solfato di dodecile di sodio al 20%.
Bead ha battuto il tubo per quattro minuti in un omogeneizzatore, seguito da tre a cinque minuti di vortice. Centrifugare i tubi per un breve periodo per eliminare le bolle e la schiuma. Per estrarre il DNA dai campioni di microbiota, trasferire 350 microlitri di surnatante del campione in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri, senza detriti.
Aggiungere 500 microlitri di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico, in un rapporto di 25:24:1, e vortice per un minuto. Dopo la centrifugazione, trasferire 180 microlitri della fase acquosa superiore in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri. Aggiungere 180 microlitri di cloroformio, capovolgere e mescolare.
Da questo, trasferire 180 microlitri della fase acquosa in un nuovo tubo a scatto. In un armadio di biosicurezza, aggiungere 180 microlitri di isopropanolo freddo e 36 microlitri di acetato di ammonio a cinque molari. Capovolgere un paio di volte per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.
Scartare il surnatante, seguito dal lavaggio del pellet più volte con 500 microlitri di etanolo freddo al 70%. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il tubo capovolto su carta velina per 20 minuti, fino a quando il pellet diventa chiaro. Sospendi il pellet in 50 microlitri di acqua molecolare e riscalda il liquido a 37 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere completamente grandi pellet di DNA.
Dopo il riscaldamento, centrifugare questi tubi a 3.400 volte G per un minuto per recuperare le goccioline di condensa dal coperchio. Misurare la concentrazione e ottenere il rapporto 260/280 utilizzando uno spettrofotometro. Un rapporto per il DNA di buona qualità è generalmente compreso tra 1,8 e due.
Centrifugare i campioni preparati a 600 volte G per un minuto a temperatura ambiente, prima di congelare a meno 80 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, inviare 20 microlitri di campioni con concentrazioni comprese tra uno e 50 nanogrammi per microlitri all'Argonne National Laboratory per il sequenziamento. Il ceppo murino privo del recettore CX3CR1 ha una diversa composizione del microbiota intestinale rispetto ai topi MRL / LPR wild-type, MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP, mostra differenze significative in alcuni generi, rilevanti per batteri potenzialmente patogeni come quelli nel phylum Proteobacteria.
Fare attenzione a contaminare il campione. Deve essere sterile. Inoltre, è importante pipettare con precisione quando si trasferisce il surnatante in un nuovo tubo.
Questo metodo è adatto per l'analisi molecolare come la PCR, la digestione enzimatica di restrizione o la costruzione di librerie genomiche. Nel lupus, abbiamo dimostrato una forte relazione tra il microbiota intestinale e la progressione del lupus.
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Panoramica
Questo protocollo fornisce un metodo semplice ed economico per l'isolamento del DNA, finalizzato all'analisi delle alterazioni della microbiota intestinale murina durante lo sviluppo di malattie autoimmuni. Il metodo è stato ideato per studiare la dinamica della microbiota intestinale in modelli murini di malattie autoimmuni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Autoimmunità
Sfondo
- Comprendere la microbiota intestinale è fondamentale nella ricerca sulle malattie autoimmuni.
- I metodi attuali per l'isolamento del DNA possono essere costosi e complessi.
- Questo studio propone un'alternativa più efficiente ed economica.
- Campioni fecali vengono utilizzati per analizzare i cambiamenti della microbiota.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'estrazione del DNA da campioni fecali.
- Facilitare lo studio della microbiota intestinale in modelli di malattie autoimmuni.
- Confrontare l'efficienza del nuovo metodo con kit commercialmente disponibili.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento individuale dei pellet fecali dai topi.
- Conservazione dei campioni a -80 gradi Celsius.
- Utilizzo di strumenti sterili per l'elaborazione dei campioni.
- Preparazione dei campioni con buffer di lisi e perle di vetro.
Risultati principali
- Il metodo proposto fornisce una qualità del DNA paragonabile a quella dei kit commerciali.
- È economico ed efficiente per l'analisi della microbiota.
- Facilita ulteriori ricerche sui meccanismi delle malattie autoimmuni.
Conclusioni
- Questo metodo di isolamento del DNA è uno strumento prezioso per i ricercatori.
- Permette lo studio della microbiota intestinale in contesti patologici.
- Promuove ricerche più accessibili nel campo dell'autoimmunità.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi affidabile della dinamica del microbiota intestinale nei modelli di malattie autoimmuni è fondamentale per comprendere i contributi ambientali e genetici alla progressione della malattia. Questo protocollo economico di isolamento del DNA consente un'estrazione scalabile e riproducibile del DNA microbico da campioni fecali di topi, sostenendo studi ad alto rendimento sul microbioma nella ricerca preclinica. Il metodo migliora la sicurezza predittiva nell'associare modifiche del microbiota a fenotipi autoimmuni, fornendo indicazioni per la scoperta precoce e le strategie traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi delle interazioni tra microbiota e sistema immunitario in modelli murini rilevanti per le malattie.
- Consente la validazione funzionale di percorsi candidati influenzati dalla composizione microbica intestinale.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando le variazioni microbiche alla progressione delle malattie autoimmuni.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce campioni di DNA standardizzati e riproducibili per sequenziamento successivo e saggi molecolari.
- Garantisce DNA quantitativo e di alta qualità, adatto ai protocolli di PCR e di sequenziamento di nuova generazione.
- Permette l'elaborazione scalabile dei campioni per studi comparativi del microbioma tra diversi gruppi sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il profilo del microbiota preclinico al progresso della malattia e agli sforzi di scoperta di biomarcatori.
- Supporta la continuità dai risultati della fase di scoperta alla validazione traslazionale in modelli autoimmuni.
- Riduce l'ambiguità biologica nell'associare i fattori scatenanti ambientali ai fenotipi della malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di isolamento del DNA si inserisce nel continuum tra la fase iniziale di scoperta e quella preclinica, consentendo analisi robuste del microbioma in modelli murini predisposti al lupus e supportando l'identificazione dei composti promettenti e gli studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sulla modulazione immunitaria mediata dalla microflora nell'autoimmunità.
- Screening: Fornisce output quantitativi riproducibili di DNA per il profilo del microbioma basato sul sequenziamento.
- Analisi: Fornisce dati di alta qualità per il confronto statistico delle variazioni della comunità microbica tra genotipi o trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati preclinici sul microbioma allo sviluppo potenziale di biomarcatori nelle malattie autoimmuni.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo scalabile ed economico, adattabile a diversi modelli murini e disegni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle associazioni tra microbiota e malattie e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza l'estrazione del DNA, migliorando la riproducibilità e la scalabilità tra studi.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione chiarificando il contributo del microbioma ai meccanismi delle malattie.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio di interventi che modulano il microbioma nei percorsi per malattie autoimmuni.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche nella manipolazione sterile dei campioni e nei protocolli di biologia molecolare.
- Necessita dell'accesso a omogeneizzatori, centrifughe e spettrofotometri per il controllo della qualità.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per minimizzare contaminazioni e variabilità.
- Adattabile a diversi modelli murini, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per tipi di campione differenti.
- Dipende da una pipettaggio accurato e da una tecnica sterile per garantire l'integrità dei dati.
