Analisi quantitativa delle proprietà viscoelastiche dei globuli rossi mediante pinzetta ottica e microscopia di defocalizzazione

Questa metodologia consente di esplorare il comportamento meccanico degli eritrociti, caratterizzando i loro parametri viscoelastici e le caratteristiche vetrose morbide per diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Il nostro metodo basato su singola cella verifica i riferimenti video utilizzando i valori dei metalli per il fattore di forma che mette in relazione forze e spostamenti, sollecitazioni e graffi nella superficie degli eritrociti. Inizia versando grasso siliconico sulla superficie dell'anello di gomma in modo da coprire l'intero perimetro.

Quindi, posizionare l'anello di gomma sul coperchio con il lato grasso rivolto verso il coperchio. Attendere cinque minuti per il corretto fissaggio e i supporti del campione sono pronti per ricevere la coltura cellulare. Successivamente, con la soluzione di cellule precedentemente preparate seguendo il protocollo scritto, seminare le cellule nel supporto del campione.

Aggiungere 0,2 microlitri di una soluzione di sfere di polistirene al 10%volume per volume al campione. Posizionare il secondo coprislip sopra l'anello di gomma. Chiudere l'installazione e completare la preparazione del campione.

Infine, spostare l'intero campione al microscopio. Per iniziare con la sperimentazione, utilizzare il sistema OT, intrappolare la sfera con il laser OT e quindi attaccarla al coprifoglio, vicino alla cella. Quindi, intrappolare un'altra sfera e ripetere la stessa procedura di attacco premendo la sfera contro la superficie della cella, vicino alla superficie superiore e vicino al bordo della cella.

Aggiungere una funzione sinusoidale di ampiezza e frequenze variabili. Quindi, premere il pulsante di avvio, utilizzando lo stadio piezoelettrico per consentire lo spostamento piezoelettrico. Mantenere la sfera RBC nella trappola e sottoporre il campione a un ciclo di movimenti utilizzando la funzione sinusoidale precedentemente impostata.

Per l'analisi, aprire il software ImageJ e importare l'intero filmato ottenuto durante i movimenti sinusoidali. Fare clic su Regola, quindi selezionare la soglia dell'opzione. Regolare la soglia con entrambe le barre di scorrimento e selezionare la sfera di riferimento facendo clic su file, seguita da rettangolo.

Quindi nella scheda Analizza, fai clic su imposta misure"e seleziona il centro di massa"opzione. Fare nuovamente clic sulla scheda Analizza e selezionare Analizza particelle. Apparirà una nuova finestra contenente una tabella con le coordinate xy per il centro della massa.

Ripetete la procedura per l'altra sfera attaccata alla superficie RBC. Aprire il software di analisi e importare i file txt precedentemente ottenuti. Generate un plottaggio con i centri di massa sull'asse y e il tempo sull'asse x.

Tracciare i risultati su un grafico utilizzando l'asse x per la costante di perdita, indicato da K doppio primo, e l'asse y per la costante di memorizzazione, indicato con K primo. Innanzitutto, per l'acquisizione video, spostare lo stadio piezoelettrico nella direzione xy, utilizzando il software per cercare una cella isolata attaccata al coprivetrino. Intrappolare e attaccare una sfera di polistirene di diametro noto alla superficie dei globuli rossi.

Quindi, utilizzando lo stadio piezoelettrico, spostare la perlina intrappolata attaccata alla superficie RBC per deformare la cellula, quindi attaccare la perlina al labbro di copertura. Ora, cambia la posizione dell'asse z per trovare l'immagine messa a fuoco. Dopo aver fissato la posizione, utilizzare il software della fotocamera per creare un filmato dell'intera cella.

Quindi, spostare la posizione dell'asse z di due micrometri verso il basso o verso l'alto per ottenere un'immagine sfocata per la cella scelta. Infine, senza modificare la posizione dell'asse z, cercate una regione senza celle per ripetere la stessa procedura e create un filmato dello sfondo dell'immagine. Per l'acquisizione di immagini di contrasto, trova prima il valore di N zero, fai clic sull'icona di selezione del poligono, quindi fai clic sulla scheda Analizza e seleziona misura.

Quindi, usa l'equazione di contrasto per determinare N immagine meno N zero ed esegui questo selezionando math "sotto processo", seguito da sottrai. Successivamente, dividi il risultato per N zero meno B.Infine, trova il contrasto per le immagini focalizzate e sfocate. Ora utilizzate la trasformata di Hartley per ottenere lo spessore RBC.

In ImageJ, fare clic su processo, seguito da FFT" e opzioni FFT, quindi scegliere FHT. Quindi eseguire la trasformazione inversa FHT selezionando il processo, seguito da FFT"e FFT. Utilizzare l'immagine risultante per ottenere il profilo dell'altezza.

Dopo aver trovato l'immagine che contiene il profilo di altezza RBC, utilizzare il contrasto sfocato di due micrometri per creare un set di due immagini in ImageJ. Per trovare il fattore di forma, utilizzare una macro personalizzata ImageJ per analizzare lo stack. La macro fornirà una tabella con la posizione del bordo, il perimetro, l'inverso del perimetro e un'immagine della cella analizzata.

Verificate se i bordi di questa immagine sono simili ai bordi della figura di riferimento. In caso contrario, ripetere la procedura e utilizzare la somma dell'inversa del perimetro per trovare il fattore di forma. Iniziare organizzando i dati sperimentali in una tabella.

Creare una nuova tabella nel software di analisi facendo clic sulla scheda file. Determinare 10 colonne diverse per i parametri. Per tracciare la curva G primo e G doppio primo nel software di analisi, utilizzare i dati della tabella precedente e fare clic sul pulsante "plot".

Per ottenere i parametri Gamma e GM, fare clic sulla scheda curve fit e selezionare fit1" per aprire una nuova finestra. Selezionare il quadrato, fare clic sul pulsante Definisci e digitare l'equazione. Fare clic sul pulsante "ok" in entrambe le finestre e verrà visualizzato il raccordo.

Quindi, create altri due grafici, vale a dire G primo e G doppio primo in funzione di omega. Posizionare le barre di errore solo sull'asse y, come illustrato in precedenza. Ripetete la procedura di adattamento della curva, selezionate l'opzione G".

Fare clic su definizione curva" in adattamento generale, quindi scrivere l'equazione interessata. Infine, fai clic su OK e apparirà un adattamento della curva insieme ai valori per Alfa e G zero. Anche in questo caso, eseguire un'altra procedura di adattamento della curva.

Selezionare l'opzione G", fare clic su definizione curva "in adattamento generale, quindi scrivere l'equazione interessata. Infine, fai clic su OK e apparirà un adattamento della curva. La figura mostra la costante elastica di stoccaggio in funzione della costante elastica di perdita.

La dipendenza lineare osservata dimostra che la superficie dei globuli rossi può essere considerata un materiale vetroso morbido. Applicando i valori per il fattore di forma complessivo della cella e lo spessore superficiale dei globuli rossi, è possibile determinare i valori per l'esponente alfa. Questa tecnica può fornire la base per nuovi metodi diagnostici che correlano i cambiamenti nelle proprietà viscoelastiche degli eritrociti con le modifiche nel flusso sanguigno di individui con diverse patologie.