Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Questo protocollo consente la creazione coerente di micro modelli proteici ad alta fedeltà di qualsiasi forma si desideri, in particolare isole isolate di pattern per lo studio dei cluster cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata per creare micro modelli di isole isolate di qualsiasi forma e dimensione in un solo passaggio, mentre in precedenza la realizzazione di tali modelli richiedeva due passaggi separati. Iniziare mescolando PDMS nel corretto rapporto agente polimerizzante/base come descritto nelle istruzioni del produttore.

Incubare a temperatura ambiente e pressione per 15 minuti, quindi degasare la miscela sotto vuoto per 15 minuti. Versare il PDMS nello stampo principale e trasferirlo in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius per polimerizzare durante la notte. Rimuovere lo stampo master dall'incubatore e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.

Mentre lo stampo master si sta raffreddando, sonicare 25 millimetri coverslips in etanolo per 10 minuti. Usa tante copertine quante sono le etichette che vengono preparate. Risciacquare accuratamente i coverslips con acqua DI e asciugarli utilizzando una pistola ad aria compressa filtrata.

Trattare i coverslip con plasma per un minuto usando il detergente al plasma sotto un alto vuoto. Rilasciare lentamente il vuoto dopo il trattamento per evitare che i coverslip si muovano all'interno della camera. Rivestire ogni coverslip con 100 microlitri della soluzione proteica marcata fluorescente in una stanza priva di luce solare diretta o illuminazione dall'alto.

Coprire i campioni per una maggiore protezione dalla luce e incubarli per 20 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare accuratamente ogni coverslip con acqua DI. Rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie picchiettando delicatamente i lati di ciascun coperchio su un tovagliolo di carta o un materiale assorbente simile.

Lasciare asciugare completamente le coperture lasciandole scoperte al buio per almeno 30 minuti. Mentre le coperture rivestite di proteine si asciugano, rimuovere il timbro PDMS dallo stampo principale tagliandolo con un bisturi o una lama affilata. Trattare i timbri PDMS con plasma per due minuti sotto un alto vuoto.

Posizionare i timbri in un contenitore con un coperchio sotto la cappa aspirante, quindi rivestire ogni timbro con uno strato sottile di 10%3-APTMS diluito in etanolo al 100%. Coprire il contenitore con i timbri e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Risciacquare accuratamente ogni timbro su entrambi i lati con acqua DI.

Mettere i timbri in un contenitore pulito e rivestirli con glutaraldeide al 2,5% preparata in acqua DI. Coprire i francobolli e incubarli a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare accuratamente i timbri con acqua DI.

Rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie come descritto in precedenza e lasciare asciugare i timbri scoperti per 30 minuti. Se dopo 30 minuti le coperture rivestite di proteine o i timbri non sono completamente asciutti, utilizzare una pistola ad aria compressa filtrata per asciugarli completamente. Spingere il lato del modello dei timbri sui coperchi con una pressione sufficiente per consentire loro di entrare in contatto completo.

Lasciare indisturbato per 15 minuti. Quindi staccare con cura i timbri PDMS dalle copertine. Utilizzando un microscopio fluorescente con l'apposito filtro, verificare la fedeltà delle coverslip modellate.

Utilizzare immediatamente le coperture modellate o conservarle al riparo dalla luce diretta fino a un ulteriore utilizzo. Prima di preparare il precursore dell'idrogel PAA, rimuovere l'estere di acido acrilico NHS dal frigorifero per raggiungere la temperatura ambiente prima di essere aperto. Preparare un set di piatti intercambiabili sterilizzandolo con etanolo al 70%, quindi incubarlo sotto luce UV in un armadio di biosicurezza per almeno 30 minuti prima dell'uso.

Sotto la cappa aspirante, aggiungere 1,25 millilitri di acrilammide al 40% preparato in acqua DI a un tubo conico da 15 millilitri. Allo stesso tubo, aggiungere 175 microlitri di soluzione di bis-acrilammide preparata in acqua DI. Quindi aggiungere 500 microlitri di 10X PBS, seguiti da 2.915 millilitri di acqua DI.

Pipettare 969 microlitri di questo precursore in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservare il resto a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Misurare da 50 a 100 milligrammi di APS in un tubo di microcentrifuga fresca e diluirlo a 100 milligrammi per millilitro in acqua DI. Aprire l'estere NHS nel cofano e misurare attentamente fino a tre milligrammi di NHS in un tubo di microcentrifuga.

Diluire l'estere NHS a un milligrammo per millilitro in 1X PBS. Sotto la cappa aspirante, aggiungere due microlitri di TEMED al tubo microcentrifuga contenente l'aliquota di microlitri 969 del precursore PAA. Aggiungere 15 microlitri di un HCL molare per ridurre il pH della soluzione di idrogel ed evitare l'idrolisi dell'estere NHS.

Aggiungere 10 microlitri della soluzione estere NHS al tubo. Eseguire i seguenti passaggi in un armadio di biosicurezza. Posizionare con attenzione il coverslip da 30 millimetri all'interno della parte centrale del set di piatti coverslip con il lato trattato con 3-APTMS e glutaraldeide e avvitare l'anello di plastica sulla parte superiore.

Imposta il coverslip modellato con un'esposizione minima alla luce per prepararti al passaggio successivo. Pipettare cinque microlitri della soluzione di APS nel tubo aliquota precursore PAA, quindi invertire e miscelare. Pipettare immediatamente 35 microlitri di questa soluzione sul coperchio da 30 millimetri.

Posizionare il coverslip modellato sulla soluzione con il lato proteico verso il basso. Fare attenzione a non creare bolle d'aria nell'idrogel. Proteggere l'idrogel dalla luce e lasciarlo polimerizzare per 90 minuti.

Una volta che l'idrogel si è polimerizzato, utilizzare una lama di rasoio o un bisturi per rimuovere il coverslip superiore, assicurarsi che il coverslip non ricada o scivoli via dal gel una volta rimosso per evitare di rovinare il modello sulla superficie del gel. Per passivare qualsiasi estere NHS rimanente nell'idrogel, aggiungere due millilitri di PBS sterile al gel e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Preparare immediatamente i gel per gli esperimenti o conservarli durante la notte in PBS sterile a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Gli idrogel sono stati indirettamente modellati con fibronectina fluorescente per visualizzare e misurare le forze di trazione cellulare all'interno di cluster e creare modelli di isole di dimensioni e forma predeterminate. La qualità del modello era direttamente correlata alla fedeltà dello stampo master da cui è stato fuso il timbro PDMS. Questo metodo potrebbe fabbricare modelli di isole isolate e ben definite di forma predeterminata.

I punti di adesione della fibronectina erano presenti solo all'interno dell'area desiderata dell'isola. Queste isole isolate di punti di adesione hanno ulteriormente permesso un migliore controllo della forma del cluster. Rivestire i timbri PDMS con due piccoli 3-APTMS è fondamentale perché limiterà l'efficacia del metodo di rimozione, mentre troppo creerà un residuo arancione sulla superficie del timbro.

I modelli creati qui possono essere utilizzati per determinare le forze di trazione cellulare sia nelle singole cellule che nei cluster, il che fornisce informazioni sulla loro capacità di mantenere l'omeostasi meccanica.