Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

La locusta migratrice è un importante test agricolo. Questo metodo fornisce un protocollo efficiente e facile da ottenere per i metodi di pressione genica del È un metodo sistematico e dettagliato di una costruzione CRISPR / CAS9 di mutanti di locuste omozigoti, compresa la raccolta di ovociti, lo screening mutante e il mantenimento omozigote. Per iniziare, preparare gli aghi per iniezione tirando i capillari di vetro con un estrattore di micro pipette.

Impostare i parametri come descritto nel manoscritto di testo, quindi macinare la punta dell'ago per iniezione con una micro smerigliatrice. Preparare la proteina ribonucleo per l'iniezione mescolando un microlitro di proteina Cas9 con un microlitro di RNA guida singolo verificato. Quindi aggiungere otto microlitri di acqua sterile libera di RNA per ottenere il volume finale della miscela, 10 microlitri.

Mescolare accuratamente la soluzione e metterla sul ghiaccio. Quindi, raccogliere i baccelli appena deposti dal baccello di posizione degli ovuli e attendere la concia delle uova. Dopo 30 minuti, utilizzare un pennello fine per isolare le uova dai baccelli in acqua e lavare le uova tre volte con acqua sterile.

Quindi mettere le uova in una piastra di Petri e aggiungere acqua sterile per mantenerle umide. Riempire l'ago per iniezione con la soluzione proteica di ribonucleo preparata e caricare l'iniezione al micromanipolatore. Impostare i parametri di microiniezione come 300 Hectopascals di pressione di iniezione, 0,5 secondi di tempo di iniezione e 25 Hectopascals di pressione di compensazione.

Quando i parametri sono impostati, premere il pedale per valutare il volume della soluzione iniettata. Regolare la pressione di iniezione e il tempo di iniezione per assicurarsi che il volume di iniezione sia compreso tra 50 e 100 nanolitri. Dopo aver disposto regolarmente le uova sterili sul tampone di iniezione, posizionare il tampone sul tavolo degli oggetti del microscopio e regolare l'ingrandimento del microscopio fino a quando le uova non vengono osservate.

Quindi regolare l'ago per microiniezione al microscopio fino a quando la punta dell'iniezione può essere vista e posizionare la punta vicino all'uovo da iniettare. Iniziare l'iniezione ad un'altezza adeguata e con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi. Inserire la punta nell'uovo vicino alle micro pile dell'uovo e premere il pedale per eseguire l'iniezione.

Quindi, ritrarre rapidamente l'ago e spostare il tampone di iniezione per l'iniezione dell'uovo successivo. Trasferire le uova iniettate in un piatto di coltura con un pezzo di carta da filtro umida. Mettili in un'incubatrice a 30 gradi Celsius.

Dopo l'iniezione, controllare lo sviluppo delle uova iniettate ogni giorno. Trasferire le uova iniettate in un nuovo piatto di coltura ogni 24 ore nei primi cinque giorni. Il sesto giorno dopo l'iniezione, raccogliere e trasferire a caso 10 uova in un tubo e macinare adeguatamente le uova con due sfere d'acciaio a 60 hertz per sei minuti usando un macinino.

Dopo la macinazione, risospendere i detriti in un millilitro di PBS. Quindi trasferire cinque microlitri della miscela risospesa in 45 microlitri di idrossido di sodio da 50 millimolari per lisare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Per terminare la reazione di lisi alcalina, aggiungere cinque microlitri di una soluzione molare di Tris cloridrato nel sistema di lisi.

Prendi un microlitro del prodotto di lisi come modello PCR per amplificare il frammento del gene bersaglio. Dopo la PCR e il sequenziamento, confrontare i risultati del sequenziamento con la sequenza wild type per valutare se il sistema CRISPR / Cas9 ha scisso il gene bersaglio in vivo. Consentire il resto delle uova per lo sviluppo successivo poiché gli indels vengono rilevati nella fase embrionale.

Dopo lo sviluppo, il trasferimento e la coltura le ninfe tratteggiate in una gabbia di allevamento come descritto nel manoscritto. Quando le ninfe si sviluppano fino al quinto stadio instar, separarle con bicchieri di coltura di plastica. Esegui incroci usando i mutanti G0 e le locuste wild type.

Dopo aver raccolto gli oassist, utilizzare da tre a sei uova sviluppate in ciascun oassist per rilevare le mutazioni come descritto in precedenza. Mantenere gli oassist positivi alla mutazione per lo sviluppo successivo e abbandonare gli oassist negativi alla mutazione. Per la crioconservazione, lavare le uova con acqua sterile e incubarle in un piatto di coltura come spiegato prima.

Dopo cinque o sei giorni, raccogliere le uova insieme nel piatto di coltura e coprirle con frammenti di carta da filtro. Quindi avvolgere l'intero piatto di cultura con un film di paraffina. Posizionare il piatto a 25 gradi Celsius per due giorni, seguiti da altri due giorni a una temperatura inferiore di 13-16 gradi Celsius.

Quindi trasferire il piatto in un frigorifero a sei gradi Celsius. Aggiungi acqua al piatto ogni due settimane per fornire un ambiente umido per le uova. Infine, per rianimare le uova crioconservate, posizionare la capsula di Petri a 25 gradi Celsius per due giorni.

Successivamente, metti le uova in un'incubatrice a 30 gradi Celsius fino a quando le ninfe si schiudono. In questo studio, il sito target per il sistema CRISPR / Cas9 era situato nel primo esone. Nel test di scissione Cas9, la proteina ribonucleo CRISPR / Cas9 potrebbe digerire il frammento PCR contenente il sito bersaglio con un tasso di scissione di circa il 55% I risultati del sequenziamento per la stima del tasso di mutazione dello stadio embrionale hanno suggerito un efficiente editing del genoma nel sito target.

L'efficienza di editing ha portato a un tasso di schiusa delle ninfe del 52,73% e il 66,67% degli adulti G0 erano mutanti a mosaico. La strategia di passaggio delle linee mutanti è mostrata qui. Le uova omozigoti in eccesso sono state crioconservate per migliorare il tasso di utilizzo degli omozigoti.

Sebbene il tasso di schiusa delle uova crioconservate sia stato ridotto con l'estensione del tempo di crioconservazione, le azioni correttive come l'applicazione di frammenti di carta da filtro e il recupero di queste uova conservate con un gradiente di aumento della temperatura sono state utili per la rianimazione. La cosa più importante è cercare di limitare i danni meccanici causati dalla microiniezione. Questa procedura può essere utilizzata come riferimento per il raggiungimento di altri insetti.

Parte di alcuni dettagli come i metodi di raccolta delle uova, l'iniezione e il raccolto dovrebbero essere modificati. Questa tecnica può anche essere utile per studiare la metamorfosi e l'adattamento ambientale degli insetti e la costruzione di mutanti di locuste omozigoti ha accelerato la ricerca in questo campo.