Name: Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Impara la costruzione di mutanti omozigoti in Locusta migratoria con CRISPR/Cas9, inclusa la crioconservazione delle uova. Questo protocollo ottimizzato supporta la ricerca genetica sugli insetti e la gestione dei parassiti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 e dalla China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).

1. Selezione del sito target e progettazione degli sgRNA
<ol><li>Raccogliere quante più informazioni possibili sulla sequenza per il gene di interesse attraverso la ricerca della letteratura e / o la ricerca dell'mRNA o della sequenza di DNA codificante (CDS) del gene presso NCBI e database di locuste24.</li>
	<li>Confrontare la sequenza del gene interessato con la sua sequenza di DNA genomico per distinguere le regioni dell'esone e dell'introne.</li>
	<li>Selezionare una regione candidata per la progettazione del sito di destinazione in base allo scopo della ricerca. Progettare coppie di primer per amplificare il frammento della regione candidata e verificare la sua sequenza wild-type mediante l'analisi sequenziale del prodotto PCR. NOTA: Esistono diverse strategie per la selezione della regione target candidata. Ad esempio, nella maggior parte delle ricerche sulla funzione genica / proteina, utilizzare il frammento di esone vicino al suo codone iniziale come regione candidata per garantire che l'intera funzione proteina / RNA venga persa dopo l'editing del genoma (cioè il knock-out del gene). Mentre per l'analisi delle funzioni di un dominio specifico, selezionare la regione candidata all'inizio (o entrambe le estremità) del dominio.</li>
	<li>Utilizza risorse online come E-CRISP Design25 per cercare potenziali siti target nella regione di destinazione candidata.<ol><li>Seleziona "Drosophila melanogaster BDGP6" (o qualsiasi altro insetto) nell'elenco a discesa dei genomi di riferimento e scegli "Input is FASTA sequence" seguito incollando la sequenza della regione target nella casella di testo (in formato FASTA).</li>
		<li>Avviare l'applicazione premendo "Start sgRNA search" con "medium" e "single design" per ottenere i possibili siti target. Selezionare 1-3 potenziali bersagli dai risultati in base ai loro punteggi previsti e progettare gli sgRNA corrispondenti di conseguenza. NOTA: Ci sono molte altre piattaforme online per la progettazione CRISPR, come CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT e così via (vedi Tabella dei materiali). Alcuni di essi hanno la funzione di controllo della specificità per le specie i cui dati di sequenza genomica sono nei loro database. Tuttavia, la sequenza genomica delle locuste non è stata trovata su nessun sito web online. È meglio usare più di uno strumento online per il design CRISPR nelle locuste. In modo completo, considerare i risultati di diversi siti Web e selezionare l'sgRNA dai risultati in base al principio della massima specificità, massima efficienza e minor tasso di mancata corrispondenza (Figura 1A, B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sintesi e verifica dello sgRNA in vitro
<ol><li>Sintetizzare l'sgRNA utilizzando kit di sintesi di sgRNA secondo il manuale del produttore (Table of Materials). Questa procedura di solito include tre fasi: amplificazione del modello di DNA, trascrizione in vitro e purificazione dell'sgRNA21. Diluire lo sgRNA sintetizzato con acqua priva di nucleasi a una concentrazione di stoccaggio di 300 ng/μL per un ulteriore utilizzo.</li>
	<li>Amplificare e purificare il frammento di gene bersaglio per fungere da substrato del test di scissione in vitro del sistema CRISPR / Cas9. Eseguire questi passaggi seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Diluire la proteina Cas9 acquistata a 300 ng/μL con acqua priva di nucleasi. Incubare 1 μL di sgRNA (300 ng/μL) e 1 μL di proteina Cas9 (300 ng/μL) con 200 ng di frammento bersaglio purificato nel tampone di scissione a 37 °C per 1 ora (10 μL del volume totale; vedere Tabella 1). Stimare l'efficienza della scissione Cas9 indotta da sgRNA mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 1C). Selezionare gli sgRNA ad alta attività per la successiva microiniezione. NOTA: I risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio possono essere convertiti in immagini in scala di grigi con software di elaborazione delle immagini e l'efficienza di scissione è stimata in base alla scala di grigi delle bande di dimensioni ipotizzate.</li>
</ol>3. Microiniezione e coltura delle uova
<ol><li>Preparare gli aghi per iniezione tirando capillari di vetro con un estrattore di micropipette (Tabella dei materiali). Impostate i parametri come segue: Calore su 588, Tira su 90, Velocità su 60 e Tempo su 40. Macinare la punta dell'ago per iniezione con una micro smerigliatrice (Tabella dei materiali). NOTA: Le punte ideali degli aghi sono aperte e affilate (Figura 2A). Si raccomanda vivamente di preparare aghi aggiuntivi per gli esperimenti perché a volte gli aghi sono bloccati o accidentalmente rotti durante le iniezioni.</li>
	<li>Mescolare 1 μL di proteina Cas9 (300 ng/μL) con 1 μL di sgRNA verificato (300 ng/μL) insieme per ottenere gli RNP per iniezione. Aggiungere 8 μL di acqua sterile priva di RNasi per portare il volume finale della miscela a 10 μL. Mescolare accuratamente la soluzione e tenerla in ghiaccio. NOTA: Le concentrazioni finali della proteina Cas9 e degli sgRNA possono essere ottimizzate in base ai risultati dell'editing. Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti della soluzione di RNP preparata e si raccomanda l'uso immediato.</li>
	<li>Allevare insieme le locuste adulte maschio e femmina a 30 °C con un fotoperiodo di 16 (chiaro):8 (scuro) e fornire loro sufficienti piantine di grano fresco come cibo. Osserva queste locuste ogni giorno e metti un vaso di ovodeposizione (un vaso di plastica o una tazza piena di sabbia sterile bagnata) nella gabbia di allevamento per la deposizione delle uova una volta che le locuste si sono accoppiate. NOTA: Di solito, 100 coppie di locuste adulte allevate in una gabbia di allevamento (40 cm x 40 cm x 40 cm) sono sufficienti per generare uova per eliminare un singolo gene. Colture ulteriori coppie di locuste se sono necessarie più uova.</li>
	<li>Raccogliere i baccelli appena deposti dalla pentola di deposizione delle uova e attendere circa 30 minuti per la concia delle uova. Isolare delicatamente le uova dai baccelli in acqua usando un pennello fine e lavarle con acqua sterile tre volte. Conservare le uova in una capsula di Petri e aggiungere acqua sterile per mantenerle umide. NOTA: La concia delle uova appena deposte può migliorare significativamente l'efficienza mutante21.</li>
	<li>Riempire un ago per iniezione con la soluzione di RNP preparata e caricarlo sul micromanipolatore (Tabella dei materiali).<ol><li>Impostare i parametri di microiniezione come segue: 300 hPa della pressione di iniezione (pi), 0,5 s del tempo di iniezione (ti) e 25 hPa della pressione di compensazione (pc).</li>
		<li>Premere il pedale per valutare il volume della soluzione iniettata. Regolare la pressione di iniezione e il tempo di iniezione per assicurarsi che il volume di iniezione sia di circa 50-100 nL. NOTA: Scaricare l'aria residua nell'ago per rendere la soluzione di iniezione continua e controllabile il più possibile. La connessione dell'ago e del micromanipolatore deve essere stretta.</li>
	</ol></li>
	<li>Disporre regolarmente le uova sterili sul tampone di iniezione (Figura 2B,C) e posizionare il tampone sul tavolo degli oggetti del microscopio (Figura 3A). Regolare l'ingrandimento del microscopio fino a quando non si osservano le uova. Regolare l'ago per microiniezione al microscopio fino a quando non è visibile la punta dell'iniezione e posizionarlo vicino all'uovo da iniettare.</li>
	<li>Iniziare l'iniezione ad un'altezza adeguata e con un angolo di 30-45 gradi. Inserire la punta nell'uovo con attenzione vicino ai micropili dell'uovo (Figura 3B) e premere il pedale per effettuare l'iniezione. Ritrarre rapidamente l'ago e spostare il tampone di iniezione per l'iniezione dell'uovo successivo. NOTA: Deve essere osservata una leggera espansione dell'uovo durante la microiniezione. Una piccola quantità di perdita citoplasmatica al foro stenopeico è accettabile. Sostituire l'ago per iniezione con uno nuovo o regolare l'angolo di iniezione se il deflusso del fluido è eccessivo.</li>
	<li>Trasferire le uova iniettate in un piatto di coltura (una capsula di Petri con un pezzo di carta da filtro umida) e metterle in un'incubatrice a 30 °C. NOTA: Ci vorranno circa 13-14 giorni prima che le ninfe si schiudano da queste uova iniettate (a condizione che la mutazione del gene bersaglio non influenzi lo sviluppo degli embrioni) (Figura 3C). Iniettare almeno 100 uova per garantire una quantità sufficiente di schiusa ed eclosione per eliminare un gene specifico.</li>
</ol>4. Stima del tasso di mutazione e screening dei mutanti
<ol><li>Controllare lo sviluppo delle uova iniettate ogni giorno dopo l'iniezione. Trasferire le uova iniettate in un nuovo piatto di coltura ogni 24 ore nei primi 5 giorni.</li>
	<li>Il 6° giorno (o più tardi) dopo l'iniezione, prelevare e trasferire a caso 10 uova in un tubo e macinare adeguatamente le uova con due sfere di acciaio a 60 Hz per 6 minuti usando un macinino (vedi Tabella dei materiali). Risospendere i detriti con 1 mL di PBS. Trasferire 5 μL della miscela in 45 μL di 50 mM NaOH e lisare a 95 °C per 5 minuti. Aggiungere 5 μL di 1 M Tris-HCl (pH=8,0) nel sistema di lisi per terminare la reazione di lisi alcalina. NOTA: Le uova possono essere selezionate per la lisi alcalina in qualsiasi giorno dopo l'ultimo trasferimento e più uova possono essere utilizzate come un campione a seconda della loro situazione di sviluppo (ad esempio, cinque embrioni di 6 giorni possono essere utilizzati come un campione e due embrioni di 10 giorni possono essere utilizzati come un campione). A volte, non è possibile ottenere il DNA genomico delle uova usando il metodo di lisi alcalina. I kit di estrazione del DNA genomico commerciale possono essere utilizzati come metodo alternativo per isolare il DNA genomico dalle uova.</li>
	<li>Prendere 1 μL del prodotto di lisi come modello PCR per amplificare il frammento del gene bersaglio (Tabella 2 e Tabella 3) e inviare i prodotti PCR per il sequenziamento. Confrontare i risultati del sequenziamento con la sequenza wild-type per valutare preliminarmente se il sistema CRISPR / Cas9 ha scisso il gene bersaglio in vivo (Figura 4A). Consentire il resto delle uova per lo sviluppo successivo a condizione che gli indels vengano rilevati nella fase embrionale. NOTA: In questo modo, il tasso di mutazione può essere preventivamente stimato allo stadio embrionale. Se non si trovano indels in questa fase, preparare alcuni nuovi sgRNA per il gene bersaglio e ripetere il protocollo knock-out dal punto 2.1.</li>
	<li>Trasferire le ninfe tratteggiate in una gabbia di allevamento e coltivarle come descritto al punto 3.3. Quando le ninfe si sono sviluppate fino al quinto stadio instar, separarle con bicchieri di coltura di plastica (1 ninfa / tazza). NOTA: Di solito ci vogliono circa 25-35 giorni perché le ninfe si sviluppino fino al loro quinto stadio e il fenotipo più evidente è che le gemme alari si estendono fino al quarto o quinto segmento addominale. Inoltre, si raccomanda di registrare i fenotipi delle ninfe morte per prevedere la relazione tra il gene bersaglio e i fenotipi in ulteriori ricerche.</li>
	<li>Tagliare circa 2 mm di lunghezza delle antenne con le forbici da dissezione e lisarlo con il metodo della lisi alcalina (fase 4.2). Analizzare la sequenza di frammenti di gene bersaglio di queste ninfe come descritto sopra (passo 4.3) per identificare i mutanti G0 (Figura 4B). NOTA: Le antenne tagliate per la lisi possono essere un po 'più lunghe e macinare o tritare le antenne è utile per la lisi anche se le antenne possono essere direttamente digerite. Gli individui con picchi multipli vicino al sito bersaglio nel risultato del sequenziamento vengono identificati come mutanti positivi e consentiti per il successivo sviluppo e accoppiamento.</li>
</ol>5. Istituzione e passaggio delle linee mutanti
<ol><li>Eseguire incroci utilizzando i mutanti G0 e le locuste wild-type (Figura 4B). Raccogliere le oocisti e incubarle separatamente a 30 °C. Utilizzare 3-6 uova sviluppate in ciascuna oocisti per rilevare le mutazioni descritte nei punti 4.2 e 4.3. Mantenere le oocisti positive alla mutazione per lo sviluppo successivo e abbandonare le oocisti negative alla mutazione. NOTA: La stima del tasso di mutazione allo stadio embrionale può accelerare notevolmente lo screening dei mutanti G1 . Di solito, 3-6 uova sviluppate possono essere mescolate come un campione per la genotipizzazione mediata dalla PCR come descritto sopra.</li>
	<li>Sollevare le ninfe G1 come descritto al punto 4.4. Tagliare circa 2 mm di lunghezza delle antenne per eseguire la genotipizzazione basata sulla PCR come descritto nella fase 4.5 per rilevare gli eterozigoti G1 . Eseguire la clonazione di TA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali) per identificare le loro mutazioni. Eseguire in-cross utilizzando eterozigoti G1 con le stesse mutazioni per ottenere ninfe G2 . NOTA: Il sequenziamento con metodo Sanger dei prodotti PCR può fornire solo informazioni per scoprire gli eterozigoti, ma non informazioni sufficienti per identificare le mutazioni esatte. Pertanto, la clonazione di TA utilizzando i prodotti PCR è necessaria per identificare chiaramente le mutazioni e può promuovere la creazione di linee mutanti stabili.</li>
	<li>Alleva le ninfe G2 fino al loro quinto instar. Utilizzare la genotipizzazione basata sulla PCR descritta nella fase 5.2 per identificare gli omozigoti e/o gli eterozigoti che sono adatti per ulteriori ricerche e passaggi stabili (Figura 4B). NOTA: Prestare attenzione ad evitare la mescolanza di omozigoti ed eterozigoti. Si raccomanda di eseguire la genotipizzazione basata sulla PCR in ogni generazione per confermare l'omozigosi e/o l'eterozigosi di ciascuna popolazione. Il numero di locuste utilizzate per questo controllo dipende dalla dimensione della popolazione. Inoltre, la popolazione di locuste può essere ampliata dalla strategia in-cross.</li>
</ol>6. Crioconservazione e rianimazione degli ovociti
<ol><li>Lavare le uova da crioconservare con acqua sterile e incubarle in un piatto di coltura come descritto sopra (fase 3.8) per 5-6 giorni. Raccogli queste uova insieme nel piatto di coltura e coprile con frammenti di carta da filtro. Avvolgere l'intero piatto di cultura con una pellicola di paraffina.</li>
	<li>Conservare il piatto a 25 °C per 2 giorni seguiti da altri 2 giorni ad una temperatura relativamente più bassa (13-16 °C). Quindi, trasferire il piatto in un frigorifero a 6 °C. Aggiungere acqua ogni 2 settimane per fornire un ambiente umido per le uova (Figura 5A). NOTA: Si ipotizza che gli embrioni siano allo stadio di katatrepsi dopo essere stati sviluppati per 5-6 giorni a 30 °C26. Il raffreddamento a gradiente è utile per la crioconservazione delle uova (Tabella 5).</li>
	<li>Per rianimare gli ovuli crioconservati, estrarre la capsula di Petri dal frigorifero e mantenerla a 25 °C per 2 giorni. Porre queste uova in un'incubatrice a 30 °C fino alla schiusa delle ninfe (Figura 5B). NOTA: È necessario mettere gli ovuli crioconservati a 25 °C prima di trasferirli in un'incubatrice a 30 °C. Gli embrioni possono essere crioconservati per almeno cinque mesi, anche se il tasso di schiusa e il tasso di eclosione possono diminuire a causa della crioconservazione (Tabella 5).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Le locuste sono state tra i parassiti più devastanti per l'agricoltura dalla civiltà degli esseri umani23. La tecnologia di modifica del genoma basata su CRISPR / Cas9 è un potente strumento per fornire una migliore conoscenza dei meccanismi biologici nelle locuste e una promettente strategia di controllo dei parassiti. Pertanto, è di grande beneficio sviluppare un metodo efficiente e facile da usare per la costruzione mediata da CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti. Sebbene alcuni grandi...

Le tecnologie di modifica genetica potrebbero essere utilizzate per introdurre inserzioni o delezioni in uno specifico locus del genoma per modificare artificialmente il gene bersaglio sullo scopo1. Negli ultimi anni, la tecnologia CRISPR / Cas9 si è sviluppata rapidamente e ha un crescente ambito di applicazioni in vari campi delle scienze della vita 2,3,4,5,6. Il sistema CRISPR / Cas9 è stato scoperto nel 19877 e ampiamente trovato in batteri e archei. Ulteriori ricerche hanno indicato che si trattava di un sistema immunitario adattativo procariotico che dipende dalla nucleasi guidata dall'RNA Cas9 per combattere i fagi8. Il sistema CRISPR/Cas9 modificato artificialmente consiste principalmente di due componenti, un singolo RNA guida (sgRNA) e la proteina Cas9. Lo sgRNA è costituito da un RNA CRISPR (crRNA) complementare alla sequenza bersaglio e da un crRNA transattivante ausiliario (tracrRNA), che è relativamente conservato. Quando il sistema CRISPR/Cas9 viene attivato, l'sgRNA forma una ribonucleoproteina (RNP) con la proteina Cas9 e guida Cas9 al suo sito bersaglio attraverso l'accoppiamento di basi delle interazioni RNA-DNA. Quindi, il DNA a doppio filamento può essere scisso dalla proteina Cas9 e, di conseguenza, la rottura del doppio filamento (DSB) emerge vicino al motivo adiacente del protospaziatore (PAM) del sito bersaglio 9,10,11,12. Per mitigare il danno causato dalle DSB, le cellule attiverebbero risposte complete al danno del DNA per rilevare in modo efficiente i danni genomici e avviare la procedura di riparazione. Ci sono due distinti meccanismi di riparazione nella cellula: non-homologous end joining (NHEJ) e homology-directed repair (HDR). NHEJ è la via di riparazione più comune che può riparare rapidamente le rotture del doppio filamento del DNA e prevenire l'apoptosi cellulare. Tuttavia, è soggetto a errori a causa del fatto che lascia piccoli frammenti di inserzioni e delezioni (indel) vicino ai DSB, che di solito si traduce in uno spostamento del frame di lettura aperto e quindi può portare al knock-out genico. Al contrario, la riparazione omologa è un evento piuttosto raro. A condizione che ci sia un modello di riparazione con sequenze omologhe al contesto del DSB, le cellule occasionalmente riparano la rottura genomica secondo il modello vicino. Il risultato dell'HDR è che il DSB viene riparato con precisione. In particolare, se c'è una sequenza aggiuntiva tra le sequenze omologhe nel modello, verrebbero integrate nel genoma tramite HDR, e in questo modo, le inserzioni geniche specifiche potrebbero essere realizzate13.
Con l'ottimizzazione e lo sviluppo delle strutture sgRNA e delle varianti proteiche Cas9, il sistema di editing genetico basato su CRISPR / Cas9 è stato applicato con successo anche nella ricerca di insetti, inclusi ma non limitati a Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella e Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Per quanto a conoscenza degli autori, sebbene RNP costituiti dalla proteina Cas9 e sgRNA trascritti in vitro siano stati utilizzati per l'editing del genoma delle locuste20,21,22, manca ancora un protocollo sistematico e dettagliato per la costruzione mediata dalla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti omozigoti della locusta migratoria.
La locusta migratrice è un importante parassita agricolo che ha una distribuzione globale e pone minacce sostanziali alla produzione alimentare, essendo particolarmente dannoso per le piante graminose, come grano, mais, riso e miglio23. L'analisi della funzione genica basata su tecnologie di modifica del genoma può fornire nuovi obiettivi e nuove strategie per il controllo delle locuste migratorie. Questo studio propone un metodo dettagliato per eliminare i geni delle locuste migratorie attraverso il sistema CRISPR / Cas9, compresa la selezione dei siti bersaglio e la progettazione di sgRNA, la sintesi in vitro e la verifica degli sgRNA, la microiniezione e la coltura di uova, la stima del tasso di mutazione allo stadio embrionale, l'individuazione dei mutanti e il passaggio e la conservazione dei mutanti. Questo protocollo potrebbe essere usato come riferimento basale per la manipolazione della stragrande maggioranza dei geni delle locuste e può fornire preziosi riferimenti per l'editing del genoma di altri insetti.

<table><tbody><tr><td>10&volte; NEBuffer r3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7030S</td><td>Il tampone di &nbsp; in vitro Saggi di scissione Cas9</td></tr><tr><td>2xEs Taq MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0690</td><td>Per l'amplificazione genica</td></tr><tr><td>2xPfu MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0686</td><td>Per l'amplificazione genica</td></tr><tr><td>CHOPCHOP</td><td></td><td></td><td>Sito web online per la progettazione di sgRNA, http://chopchop.cbu.uib.no/.</td></tr><tr><td>Sito web CRISPOR</td><td></td><td></td><td>Online per la progettazione di sgRNA, http://crispor.org.</td></tr><tr><td>Sito web online CRISPRdirect</td><td></td><td></td><td>per la progettazione di sgRNA, http://crispr.dbcls.jp/.</td></tr><tr><td>Alimentatore per elettroforesi</td><td>LIUYI BIOLOGY</td><td>DYY-6D</td><td>Separazione di molecole di acido nucleico di diverse dimensioni</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>30125177</td><td>Per la raccolta di campioni, ecc.</td></tr><tr><td>Spazzole fini</td><td>Annigoni</td><td>1235</td><td>Per la pulizia e l'isolamento delle uova. Acquistato online.</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Strumento Sutter</td><td>P97</td><td>Per realizzare gli aghi per microiniezione</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel</td><td>Cwbio</td><td>CW2302</td><td>Recupero e purificazione del DNA</td></tr><tr><td>Sistema di analisi dell'imaging su gel</td><td>OLYMPUS</td><td>Gel Doc XR</td><td>Osservare i risultati dell'elettroforesi</td></tr><tr><td>GeneTouch Plus</td><td>Bioer</td><td>B-48DA</td><td>Per l'amplificazione genica</td></tr><tr><td>Vetro elettrodo capillare</td><td>Gairdner</td><td>GD-102</td><td>Per la fabbricazione&nbsp; aghi per iniezione con&nbsp; a&nbsp; micropipetta Puller</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>MEMMERT</td><td>INplus55</td><td>Per la coltura di embrioni di locuste migratorie</td></tr><tr><td>Bagno metallico</td><td>TIANGEN</td><td>AJ-800</td><td>Per il riscaldamento del campione</td></tr><tr><td>Micro autoiniettore</td><td>Eppendorf</td><td>5253000068</td><td>Microiniezione di embrioni all'inizio dello sviluppo</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Allsheng</td><td>MTV-1</td><td>Utilizzato per miscelare i reagenti</td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td>Per mettere a terra la punta dell'ago per iniezione</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf 5242956003</td><td></td><td>Per caricare le soluzioni negli aghi per iniezione.</td></tr><tr><td>Sistema di micromanipolazione</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td>Un sistema di manipolazione altinativa per microiniezione</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>cnoptec</td><td>SZ780</td><td>Per microiniezione</td></tr><tr><td>Manipolatore a motore</td><td>NARISHIGE</td><td>MM-94</td><td>Per il controllo della posizione della micropipetta durante la procedura di microiniezione</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti multicampione</td><td>jingxin</td><td>Tissuelyser-64</td><td>Macinare e omogeneizzare la</td></tr><tr><td>pentola per l'ovipisizione</td><td>delle uova ChangShengYuanYi</td><td>CS-11</td><td>Riempito con sabbia sterile bagnata per la deposizione delle locuste in esso. Le oocisti vengono raccolte da questo contenitore. Acquistato online.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>ParafilmM</td><td>PM996</td><td>Per avvolgere le piastre di Petri.</td></tr><tr><td>Kit di clonazione pEASY-T3</td><td>TransGen Biotech</td><td>CT301-01</td><td>Per la clonazione TA</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>NEST</td><td>752001</td><td>Per la coltura e la conservazione degli ovuli.</td></tr><tr><td>Pipettor,</td><td>Eppendorf</td><td>Research plus</td><td>Per il caricamento del campione</td></tr><tr><td>, bicchiere</td><td></td><td></td> di coltura <td>in plastica Per l'allevamento separato delle locuste e qualsiasi bicchiere di plastica abbastanza grande (non meno di 1000 ml di volume) andrà bene. Acquistato online.</td></tr><tr><td>Kit di sintesi di gRNA di precisione</td><td>Thermo</td><td>A29377</td><td>Per la sintesi di sgRNA</td></tr><tr><td>Primer Premier</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Primer Premier 5.00</td><td>Per la progettazione di primer</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Scienza perspicace</td><td>SnapGene&reg; 4.2.4</td><td>Per l'analisi delle sequenze Sfere d'acciaio</td></tr><tr><td></td><td>HuaXinGangQiu</td><td>HXGQ60</td><td>Per la macinazione dei campioni. Acquistato online.</td></tr><tr><td>Punte</td><td>bioleaf</td><td>D781349</td><td>Per il caricamento dei campioni</td></tr><tr><td>Trans DNA Marker II</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM411-01</td><td>Utilizzato per determinare la dimensione del gene</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo</td><td>A36496</td><td>Cas9 protein</td></tr><tr><td>UniversalGen DNA Kit</td><td>Cwbio</td><td>CWY004</td><td>Per l'estrazione del DNA genomico</td></tr><tr><td>VANNAS Forbici</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72932-01</td><td>Per tagliare le antenne</td></tr><tr><td>Grano</td><td></td><td></td><td>Per generare piantine di grano come cibo per le locuste. Acquistato da agricoltori locali.</td></tr><tr><td>Sito web ZiFiT</td><td></td><td></td><td>Online per la progettazione di sgRNA, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.</td></tr></tbody></table>

costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia crispr/cas9

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

La locusta migratrice, Locusta migratoria, non è solo una delle locuste della peste in tutto il mondo che ha causato enormi perdite economiche agli esseri umani, ma anche un importante modello di ricerca per la metamorfosi degli insetti. Il sistema CRISPR / Cas9 può localizzare con precisione un locus specifico del DNA e fendere all'interno del sito bersaglio, introducendo in modo efficiente rotture a doppio filamento per indurre il knockout del gene bersaglio o integrare nuovi frammenti di geni nel locus specifico. L'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 è un potente strumento per affrontare le domande incontrate nella ricerca sulle locuste e una tecnologia promettente per il controllo delle locuste. Questo studio fornisce un protocollo sistematico per il knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 con il complesso della proteina Cas9 e RNA guida singola (sgRNA) nelle locuste migratorie. La selezione dei siti target e la progettazione degli sgRNA sono descritte in dettaglio, seguite dalla sintesi in vitro e dalla verifica degli sgRNA. Le procedure successive includono la raccolta della zattera delle uova e la separazione delle uova conciate per ottenere una microiniezione di successo con basso tasso di mortalità, coltura delle uova, stima preliminare del tasso di mutazione, allevamento delle locuste, nonché rilevamento, conservazione e passaggio dei mutanti per garantire la stabilità della popolazione delle locuste modificate. Questo metodo può essere utilizzato come riferimento per applicazioni di editing genetico basate su CRISPR / Cas9 nelle locuste migratorie e in altri insetti.

Questo protocollo contiene i passaggi dettagliati per generare mutanti omozigoti delle locuste migratorie con l'RNP costituito dalla proteina Cas9 e sgRNA sintetizzato in vitro . I seguenti sono alcuni risultati rappresentativi del knockout del gene bersaglio mediato da CRISPR / Cas9 nelle locuste, tra cui selezione del bersaglio, sintesi e verifica dell'sgRNA (Figura 1A), raccolta e iniezione di ovociti, screening mutante e passaggio, crioconservazione e rianimazione delle uova omo...

Questo studio fornisce una procedura sistematicamente ottimizzata di costruzione basata sulla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti, nonché un metodo dettagliato per la crioconservazione e la rianimazione delle uova di locuste.

Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

La locusta migratrice è un importante test agricolo. Questo metodo fornisce un protocollo efficiente e facile da ottenere per i metodi di pressione genica del È un metodo sistematico e dettagliato di una costruzione CRISPR / CAS9 di mutanti di locuste omozigoti, compresa la raccolta di ovociti, lo screening mutante e il mantenimento omozigote. Per iniziare, preparare gli aghi per iniezione tirando i capillari di vetro con un estrattore di micro pipette.Impostare i parametri come descritto nel manoscritto di testo, quindi macinare la punta dell'ago per iniezione con una micro smerigliatrice. Preparare la proteina ribonucleo per l'iniezione mescolando un microlitro di proteina Cas9 con un microlitro di RNA guida singolo verificato. Quindi aggiungere otto microlitri di acqua sterile libera di RNA per ottenere il volume finale della miscela, 10 microlitri.Mescolare accuratamente la soluzione e metterla sul ghiaccio. Quindi, raccogliere i baccelli appena deposti dal baccello di posizione degli ovuli e attendere la concia delle uova. Dopo 30 minuti, utilizzare un pennello fine per isolare le uova dai baccelli in acqua e lavare le uova tre volte con acqua sterile.Quindi mettere le uova in una piastra di Petri e aggiungere acqua sterile per mantenerle umide. Riempire l'ago per iniezione con la soluzione proteica di ribonucleo preparata e caricare l'iniezione al micromanipolatore. Impostare i parametri di microiniezione come 300 Hectopascals di pressione di iniezione, 0,5 secondi di tempo di iniezione e 25 Hectopascals di pressione di compensazione.Quando i parametri sono impostati, premere il pedale per valutare il volume della soluzione iniettata. Regolare la pressione di iniezione e il tempo di iniezione per assicurarsi che il volume di iniezione sia compreso tra 50 e 100 nanolitri. Dopo aver disposto regolarmente le uova sterili sul tampone di iniezione, posizionare il tampone sul tavolo degli oggetti del microscopio e regolare l'ingrandimento del microscopio fino a quando le uova non vengono osservate.Quindi regolare l'ago per microiniezione al microscopio fino a quando la punta dell'iniezione può essere vista e posizionare la punta vicino all'uovo da iniettare. Iniziare l'iniezione ad un'altezza adeguata e con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi. Inserire la punta nell'uovo vicino alle micro pile dell'uovo e premere il pedale per eseguire l'iniezione.Quindi, ritrarre rapidamente l'ago e spostare il tampone di iniezione per l'iniezione dell'uovo successivo. Trasferire le uova iniettate in un piatto di coltura con un pezzo di carta da filtro umida. Mettili in un'incubatrice a 30 gradi Celsius.Dopo l'iniezione, controllare lo sviluppo delle uova iniettate ogni giorno. Trasferire le uova iniettate in un nuovo piatto di coltura ogni 24 ore nei primi cinque giorni. Il sesto giorno dopo l'iniezione, raccogliere e trasferire a caso 10 uova in un tubo e macinare adeguatamente le uova con due sfere d'acciaio a 60 hertz per sei minuti usando un macinino.Dopo la macinazione, risospendere i detriti in un millilitro di PBS. Quindi trasferire cinque microlitri della miscela risospesa in 45 microlitri di idrossido di sodio da 50 millimolari per lisare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Per terminare la reazione di lisi alcalina, aggiungere cinque microlitri di una soluzione molare di Tris cloridrato nel sistema di lisi.Prendi un microlitro del prodotto di lisi come modello PCR per amplificare il frammento del gene bersaglio. Dopo la PCR e il sequenziamento, confrontare i risultati del sequenziamento con la sequenza wild type per valutare se il sistema CRISPR / Cas9 ha scisso il gene bersaglio in vivo. Consentire il resto delle uova per lo sviluppo successivo poiché gli indels vengono rilevati nella fase embrionale.Dopo lo sviluppo, il trasferimento e la coltura le ninfe tratteggiate in una gabbia di allevamento come descritto nel manoscritto. Quando le ninfe si sviluppano fino al quinto stadio instar, separarle con bicchieri di coltura di plastica. Esegui incroci usando i mutanti G0 e le locuste wild type.Dopo aver raccolto gli oassist, utilizzare da tre a sei uova sviluppate in ciascun oassist per rilevare le mutazioni come descritto in precedenza. Mantenere gli oassist positivi alla mutazione per lo sviluppo successivo e abbandonare gli oassist negativi alla mutazione. Per la crioconservazione, lavare le uova con acqua sterile e incubarle in un piatto di coltura come spiegato prima.Dopo cinque o sei giorni, raccogliere le uova insieme nel piatto di coltura e coprirle con frammenti di carta da filtro. Quindi avvolgere l'intero piatto di cultura con un film di paraffina. Posizionare il piatto a 25 gradi Celsius per due giorni, seguiti da altri due giorni a una temperatura inferiore di 13-16 gradi Celsius.Quindi trasferire il piatto in un frigorifero a sei gradi Celsius. Aggiungi acqua al piatto ogni due settimane per fornire un ambiente umido per le uova. Infine, per rianimare le uova crioconservate, posizionare la capsula di Petri a 25 gradi Celsius per due giorni.Successivamente, metti le uova in un'incubatrice a 30 gradi Celsius fino a quando le ninfe si schiudono. In questo studio, il sito target per il sistema CRISPR / Cas9 era situato nel primo esone. Nel test di scissione Cas9, la proteina ribonucleo CRISPR / Cas9 potrebbe digerire il frammento PCR contenente il sito bersaglio con un tasso di scissione di circa il 55% I risultati del sequenziamento per la stima del tasso di mutazione dello stadio embrionale hanno suggerito un efficiente editing del genoma nel sito target.L'efficienza di editing ha portato a un tasso di schiusa delle ninfe del 52,73% e il 66,67% degli adulti G0 erano mutanti a mosaico. La strategia di passaggio delle linee mutanti è mostrata qui. Le uova omozigoti in eccesso sono state crioconservate per migliorare il tasso di utilizzo degli omozigoti.Sebbene il tasso di schiusa delle uova crioconservate sia stato ridotto con l'estensione del tempo di crioconservazione, le azioni correttive come l'applicazione di frammenti di carta da filtro e il recupero di queste uova conservate con un gradiente di aumento della temperatura sono state utili per la rianimazione. La cosa più importante è cercare di limitare i danni meccanici causati dalla microiniezione. Questa procedura può essere utilizzata come riferimento per il raggiungimento di altri insetti.Parte di alcuni dettagli come i metodi di raccolta delle uova, l'iniezione e il raccolto dovrebbero essere modificati. Questa tecnica può anche essere utile per studiare la metamorfosi e l'adattamento ambientale degli insetti e la costruzione di mutanti di locuste omozigoti ha accelerato la ricerca in questo campo.

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Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all'ottenimento e all'iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

Qui, descriviamo i metodi per iniezioni pupali e adulte efficienti in Nasonia vitripennis come alternative accessibili alla microiniezione embrionale, consentendo l'analisi funzionale dei geni di interesse utilizzando il silenziamento dell'RNA tramite interferenza dell'RNA (RNAi) o knockout genico tramite l'editing del genoma CRISPR / Cas9.

Iniezioni pupali e adulte per l'editing genico RNAi e CRISPR a Nasonia al vetripennis

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

Molte caratteristiche dell'eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all'interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Qui è presentato un protocollo di microiniezione embrionale Helicoverpa armigera (Hübner) e identificazione di mutanti knockout creati dall'editing del genoma CRISPR / Cas9. Gli insetti mutanti consentono ulteriori ricerche sulla funzione genica e sull'interazione tra diversi geni in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

Qui sono presenti protocolli per la raccolta e la microiniezione di embrioni precellulari di cavallette di mais allo scopo di modificare il loro genoma tramite l'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 o per l'aggiunta di elementi trasponibili marcati attraverso la trasformazione germinale.

Microiniezione di Corn Planthopper, Peregrinus maidis, embrioni per l'editing del genoma CRISPR/Cas9

Questo articolo presenta i protocolli passo-passo per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis. I passaggi dettagliati forniti da questo protocollo standardizzato serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per studi genetici funzionali in B. dorsalis.

Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis

Impara la costruzione di mutanti omozigoti in Locusta migratoria con CRISPR/Cas9, inclusa la crioconservazione delle uova. Questo protocollo ottimizzato supporta la ricerca genetica sugli insetti e la gestione dei parassiti.

Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

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