Name: Identificazione dellattività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Scopri come estrarre velenamente da anemoni di mare e identificare attività emolitica e fosfolipasica con saggi biologici semplici. Questo metodo rapido ed economico facilita la ricerca tossicologica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), con un numero di sovvenzione IT200819. Gli autori riconoscono a Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, di aver controllato la grammatica inglese di questo manoscritto; e l'assistenza tecnica di Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) e Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Ringraziamo anche il Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) per aver ottenuto sangue di pecora. Ringraziamo in particolare il Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, per le strutture nel suo laboratorio per la registrazione video.

Gli anemoni di mare sono stati raccolti secondo le linee guida della Commissione nazionale per l'acquacoltura, la pesca e l'alimentazione del governo federale del Messico (numero di permesso PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Il Comitato di Bioetica dell'Istituto di Biotecnologia, Università Nazionale Autonoma del Messico ha approvato tutti gli esperimenti con gli anemoni di mare. Il campione di sangue di pecora è stato acquistato presso il Centro per l'insegnamento pratico e la ricerca nella produzione e la salute animale (CEPIPSA, Università Nazionale Autonoma del Messico).
1. Raccolta di organismi
<ol><li>Raccogli l'anemone di mare A. dowii. NOTA: Qui, gli organismi sono stati raccolti durante i periodi di bassa marea nella zona intertidale al largo della costa di Ensenada Baja, California, Messico (Figura 1A, B).</li>
	<li>Trasportare gli organismi al laboratorio in contenitori con acqua di mare (Figura 1C).</li>
	<li>In laboratorio, pulire gli organismi con acqua distillata a mano per rimuovere le grandi particelle di substrato che aderiscono al corpo.</li>
	<li>Congelare immediatamente gli organismi a -80 °C in un ultra-congelatore per 72 ore.</li>
	<li>Posizionare gli organismi in vetri speciali per la liofilizzazione, con condizioni di liofilizzazione di -20 °C, 0,015 psi, per 48 ore.</li>
	<li>Conservare gli organismi liofilizzati a -20 °C fino all'uso.</li>
</ol>2. Idratazione dei tessuti
<ol><li>Ricostituire 20 g di peso secco di organismi liofilizzati con 60 mL (1/3 p/v) di tampone fosfato di sodio 50 mM, pH 7,5 e 1 compressa cocktail inibitore (Tabella dei materiali).</li>
	<li>In un agitatore magnetico, mescolare continuamente il campione a ~ 800 rpm, 4 °C, per 12 h.</li>
</ol>3. Rilascio di tossine
<ol><li>Per indurre la lisi cellulare e lo scarico di nematocisti, congelare il campione a -20 °C per 12 ore, quindi posizionare il contenitore in acqua a temperatura ambiente (RT) fino a scongelamento fino al 90%. Ripetere questa procedura tre volte. NOTA: Il campione non si scongela al 100%; è fondamentale mantenere il campione a ~4 °C per prevenire la degradazione delle proteine.</li>
	<li>Osservare la nematocisti scaricata al microscopio confocale. Prelevare 10 μL del campione su un vetrino e posizionare sopra un coperchio. Osservare al microscopio confocale con ingrandimento 100x e 60x. Qui non era necessario un colorante.</li>
	<li>Elaborare le immagini catturate al microscopio confocale nel software ImageJ (versione 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).</li>
	<li>Se il tubulo all'interno della nematocisti si srotola ed è all'esterno, le nematocisti vengono scaricate; quindi, continua con il passaggio successivo. Altrimenti, condurre solo un altro ciclo di congelamento-disgelo.</li>
	<li>Per chiarire l'estratto, centrifugare il campione a 25.400 x g per 40 min, 4 °C, recuperare il surnatante e centrifugarlo di nuovo. Ripetere questo passaggio 3-4 volte.</li>
	<li>Recuperare il surnatante e scartare il pellet. Il surnatante o estratto grezzo contiene i componenti del veleno (tossine) e altre molecole cellulari, come lipidi, carboidrati e acidi nucleici.</li>
</ol>4. Quantificazione della proteina totale
<ol><li>Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo utilizzando un kit commerciale bradford colorimetrico15 (Table of Materials).</li>
	<li>Diluire il reagente colorante (una parte del colorante con quattro parti di acqua distillata).</li>
	<li>Preparare la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) Frazione V (Tabella dei materiali) a 1 mg/mL di concentrazione in tampone fosfato (50 mM fosfato di sodio, pH 7,5).</li>
	<li>Preparare le soluzioni elencate nella Tabella 1 in triplice copia.</li>
	<li>Mescolare vigorosamente ogni soluzione in uno shaker per 4 s.</li>
	<li>Incubare i campioni per 5 minuti a RT, senza agitare.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza (AU) a 595 nm.</li>
	<li>Tracciare le medie delle assorbanze BSA del campione (AU vs. concentrazione proteica) e determinare l'equazione del grafico (Equazione 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq01.jpg" style="margin: auto;">     Equazione 1 dove y è l'assorbanza, m è la pendenza della linea, x è la concentrazione proteica e b è l'intercetta y. Per calcolare la concentrazione di estratto grezzo, risolvere per x come segue: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq02.jpg" style="margin: auto;">     Equazione 2
</li>
</ol>5. Determinare la complessità del veleno polipeptidico
<ol><li>Assemblare il contenitore di vetro per l'elettroforesi verticale su gel secondo il manuale.</li>
	<li>Preparare la miscela di acrilammide (30%): 29,2 g di acrilammide, 0,8 g di bis-acrilammide, il volume finale di 100 ml. Filtrare la soluzione utilizzando una membrana da 0,45 μm. Conservare la soluzione in un flacone scuro a 4 °C. Quindi, preparare la miscela per il gel risolutivo (Tabella 2).</li>
	<li>Il gel SDS-PAGE è costituito da un gel risolutivo e da un gel impilabile. Preparare i gel secondo i volumi di soluzione definiti nella Tabella 2. Durante la preparazione, assicurarsi di mantenere ogni miscela a 4 °C per ridurre i tempi di polimerizzazione. NOTA: Il volume di ogni miscela varia a seconda della marca di attrezzatura utilizzata; per questo protocollo, i volumi corrispondono alla preparazione del gel di acrilammide al 15%, spessore 0,75 mm, per una camera di elettroforesi verticale (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Dopo che l'acrilammide ha polimerizzato, ~ 10 min, aggiungere la miscela di gel impilabile.</li>
	<li>Preparare la miscela per il gel impilabile, aggiungerlo immediatamente alle lastre di vetro e posizionare un pettine per formare i pozzetti per il caricamento dei campioni.</li>
	<li>Una volta che il gel impilabile ha polimerizzato (~ 15 min), rimuovere il pettine e posizionare il contenitore di vetro in una camera per l'elettroforesi verticale.</li>
	<li>Posizionare 200 mL di tampone elettrodo (0,25 M Tris, 0,192 M glicina, 0,1% SDS) nella camera di elettroforesi.</li>
	<li>Analizzare l'estratto grezzo: Mescolare 30 μg di estratto grezzo con 5 μL di tampone di carico proteico (25% glicerolo, 15% sodio dodecil solfato, 25% 2-mercaptoetanolo, 0,125 mM Tris pH 7, bromofenolo blu 0,1 mg/mL) per denaturare le proteine. Il volume finale deve essere &lt;50 μL.</li>
	<li>Riscaldare a 90 °C per 5 min, raffreddare e centrifugare per 3 s a 1.400 x g.</li>
	<li>Caricare i campioni nei pozzetti del gel impilabile. Caricare una scala a peso molecolare standard.</li>
	<li>Eseguire elettroforesi a 25 mA costanti per 1 h 30 min.</li>
	<li>Rimuovere i contenitori di vetro dalla camera di elettroforesi per procedere con la colorazione delle proteine del gel.</li>
</ol>6. Colorazione delle proteine
<ol><li>Risciacquare il gel in 50 ml di acqua distillata per rimuovere i detriti dall'elettrodo tampone.</li>
	<li>Scartare l'acqua.</li>
	<li>Per evitare la diffusione delle proteine del gel, aggiungere la soluzione di fissazione (60 ml di etanolo, 20 ml di acido acetico e 20 ml di acqua distillata, volume finale 100 ml). Incubare a RT per 40 minuti con agitazione a 80 giri / min. Decantare la soluzione.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione reticolante proteica (15 mL di etanolo, 0,25 mL di glutaraldeide, 50 ml di acqua distillata, volume finale 65,25 ml) e incubare per 30 minuti a RT con agitazione a 80 giri/min. Rimuovere la soluzione.</li>
	<li>Lavare il gel con 100 ml di acqua distillata per 5 minuti e rimuovere l'acqua. Ripetere questa procedura quattro volte.</li>
	<li>Effettuare la colorazione proteica con 50 mL di soluzione filtrata Coomassie blu brillante R-250 (40% metanolo, 10% acido acetico, 50% acqua distillata, 0,1% colorante, volume finale 100 ml), mescolando a 60 giri / min in un oscillatore rotativo da laboratorio a RT per 15 min.</li>
	<li>Recuperare la soluzione, che può essere utilizzata per macchiare altri gel.</li>
	<li>Per eliminare il colorante in eccesso, aggiungere una soluzione di destaining (40 ml di metanolo, 10 ml di acido acetico, 50 ml di acqua distillata). Continuare a mescolare (80 rpm) a RT fino a quando le bande (proteine colorate) non vengono visualizzate.</li>
	<li>Conservare il gel in 50 ml di acqua distillata e scansionare l'immagine in un sistema di documentazione Gel.</li>
</ol>7. Preparare la soluzione di globuli rossi
<ol><li>Estrarre 1 mL di sangue dalla vena giugulare di una pecora.</li>
	<li>Rimuovere l'ago dalla siringa e drenare immediatamente il sangue in un tubo con 50 mL di soluzione di Alsever (0,002 M di acido citrico, 0,07 M di NaCl, 0,1 M di destrosio e 0,027 M di citrato di sodio come anticoagulante, pH 7,4).</li>
	<li>Invertire lentamente la soluzione tre volte.</li>
	<li>Conservare a 4 °C per il trasferimento in laboratorio.</li>
	<li>Centrifugare a 804 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendare il pellet in 30 ml di soluzione Alsever. Aggiungere la soluzione facendola scorrere lungo le pareti interne del tubo e, utilizzando una pipetta di plastica Pasteur, risospese lentamente le celle. Centrifugare nuovamente a 804 x g per 5 min, 4 °C. Ripetere questa procedura fino a quando il surnatante non è chiarito.</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di soluzione Alsever; risospese il pellet lentamente con una pipetta di plastica Pasteur.</li>
	<li>Mantenere il volume finale della soluzione di Alsever per raggiungere una concentrazione di 2 x 106 celle/ml, approssimativamente. Quindi, utilizzare una camera Neubauer o un emocitometro per contare le cellule. NOTA: Contare gli eritrociti nel vetrino dell'emacitometro (Neubauer migliorato). La slitta è una slitta da 30 mm x 70 mm x 4 mm. Il centro ha due pedane argentate (Figura 2A) (una griglia superiore e una inferiore), ciascuna di 3 mm x 3 mm, e due canali ai lati della griglia. Il conteggio delle celle si trova nei quadrati angolari e centrali (quadrati rossi nella Figura 2B). La concentrazione ottimale di cellule per il conteggio dovrebbe essere nell'ordine di 106 cellule. La scatola centrale ha una superficie di 0,1 cm2, che equivale a 0,0001 ml.</li>
	<li>Posizionare una copertina sopra la diapositiva.</li>
	<li>Posizionare 10 μL del campione tra il vetrino e il coperchio e attendere l'erogazione del campione.</li>
	<li>In un microscopio ottico (ingrandimento 60x), eseguire il conteggio nella prima casella quadrata. Contare solo le celle nella griglia centrale e quelle che toccano il margine superiore o sinistro della casella.</li>
	<li>Determinare la concentrazione cellulare utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq03v4.jpg" style="margin: auto;">Equazione 3 Se il campione è molto concentrato ed è necessaria la diluizione, utilizzare la seguente equazione: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq04v3.jpg" style="margin: auto;">Equazione 4 NOTA: Quando si prende la soluzione di eritrociti per il test di emolisi, omogeneizzare lentamente la soluzione con una pipetta pasteur di plastica.</li>
	<li>Eseguire i passaggi in triplice copia per ridurre gli errori.</li>
</ol>8. Saggio di emolisi
<ol><li>Preparare le miscele di soluzioni (in triplicati) indicate nella Tabella 3 in piastre coniche a 96 pozzetti. NOTA: Mescolare lentamente gli eritrociti per mantenere una sospensione omogenea.</li>
	<li>Incubare per 1 ora a 37 °C, senza agitare.</li>
	<li>Centrifugare la piastra a 804 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Recuperare il surnatante in un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo piatto.</li>
	<li>Se l'estratto grezzo contiene citolisine, gli eritrociti lisi e rilasciano emoglobina. Leggere l'assorbanza a 415 nm.</li>
	<li>Calcolare la percentuale di emolisi, utilizzando la seguente equazione: % Emolisi = ((Acrude extract-AAlsever buffer) / (AH2O-AAlsever)) x 100 NOTA: L'estratto di Acrude, il tampone AAlsever e l'AH2O corrispondono rispettivamente all'assorbanza degli eritrociti con l'estratto grezzo, all'assorbanza della soluzione di Alsever e all'assorbanza dell'acqua distillata.</li>
	<li>Eseguire un test di emolisi prima e dopo ogni ciclo di congelamento e scongelamento con 50 μg di proteine totali dall'estratto grezzo.</li>
	<li>Determinare il numero di cicli di congelamento e scongelamento necessari per raggiungere il 100% di attività emolitica.</li>
	<li>Calcolare la quantità di estratto che produce emolisi nel 50% degli eritrociti (HU50); seguire lo stesso protocollo descritto nella Tabella 3, aumentare la quantità di estratto grezzo di anemone di mare e progettare la trama con regolazioni sigmoidali utilizzando software appropriati (ad esempio, Origine, Tabella dei materiali).</li>
</ol>9. Saggio della fosfolipasi
<ol><li>Lavare un uovo di gallina con l'1% di SDS in acqua distillata.</li>
	<li>Separare il tuorlo d'uovo dall'albume in condizioni sterili.</li>
	<li>Preparare 50 ml di soluzione di NaCl allo 0,86% e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Quindi, preparare la soluzione A: aggiungere 12 ml di tuorlo d'uovo e 36 ml di soluzione di NaCl allo 0,86%.</li>
	<li>Preparare la soluzione B: mescolare 300 mg di agarosio in 50 mL di tampone (50 mM Tris, pH 7,5), filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino all'ebollizione. Raffreddare in acqua tiepida per raggiungere i 43-45°C.</li>
	<li>Preparare la soluzione C: preparare 10 mM di CaCl2 e filtrarlo con un filtro da 0,22 μm.</li>
	<li>Preparare la soluzione D: 10 mg di rodamina 6G in 1 mL di acqua distillata.</li>
	<li>In condizioni sterili (cappa a flusso laminare), aggiungere 500 μL di soluzioni A e C alla soluzione B e 100 μL di soluzione D, mescolare e versare 25 mL in ciascuna capsula di Petri (90 x 15 mm).</li>
	<li>Attendere che la soluzione si solidifichi in condizioni sterili (30 min).</li>
	<li>Crea pozzetti (~ 2-3 mm di diametro) con un tubo sottile.</li>
	<li>Aggiungere un totale di 20 μL di tampone fosfato (controllo negativo) in un pozzetto e 20 μL di una determinata fosfolipasi (controllo positivo) in un altro pozzo.</li>
	<li>Collocare diverse quantità di proteine dell'estratto grezzo, 5, 15, 25, 35, 45 μg, nei pozzetti rimanenti, ciascuno in un volume finale di 20 μL.</li>
	<li>Attendere che l'agar assorba tutti i campioni (30 min).</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 20 h.</li>
	<li>Se si forma un alone intorno al pozzo, questo indica l'attività della fosfolipasi. Misurare l'alone formato con una pinza vernier. NOTA: eseguire l'esperimento in triplice copia (passaggi da 9.1 a 9.14).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse concorrente in relazione alla pubblicazione di questo articolo.

L'elevata domanda di nuovi composti con applicazioni in diversi campi della scienza e dell'industria ha portato allo studio del veleno. Il veleno rappresenta una ricca fonte di molecole che funge da modello per la generazione di nuovi strumenti molecolari. Tuttavia, la complessità di questi veleni richiede l'implementazione e la combinazione di vari metodi per ottenerli e studiarli.
Qui, mostriamo un metodo per ottenere e analizzare il veleno dell'anemone di mare Anthopleura dowii, Ve...

Gli animali marini sono una ricca fonte di composti biologicamente attivi. Negli ultimi decenni, la composizione del veleno di anemone di mare ha attirato l'attenzione scientifica poiché comprende una varietà di polipeptidi con attività emolitica, citotossica, enzimatica (fosfolipasi, proteasi, chitinasi) e neurotossica ed effetti inibitori sull'attività proteolitica1. Inoltre, questi polipeptidi sono potenziali fonti per lo sviluppo di strumenti molecolari nell'uso biotecnologico e terapeutico 2,3.
Ci sono poche segnalazioni sul veleno di anemone di mare e sui suoi componenti molecolari a causa della complessità di ottenere il veleno, persino l'isolamento e la caratterizzazione delle tossine. I metodi di estrazione utilizzati nei rapporti prevedevano la lisi e lo svuotamento del contenuto delle cellule che sono correlate e non correlate alla produzione di veleno1.
Una caratteristica particolare in tutti gli cnidari è l'assenza di un sistema per la produzione e il rilascio del veleno centralizzato in un'unica regione anatomica. Invece, le nematocisti sono strutture che mantengono il veleno 4,5. Altri tipi di cellule, chiamate cellule della ghiandola epidermica, secernono anche tossine e sono anche distribuite in tutto il corpo degli anemoni di mare6.
La prima e più cruciale sfida nell'ottenere il veleno è la generazione di un estratto con sufficiente manipolazione nei processi successivi, senza l'inattivazione o la degradazione delle proteine labili. Successivamente, le cellule devono essere lisate e i componenti, in questo caso, i polipeptidi devono essere estratti in modo efficiente e rapido, evitando la proteolisi e l'idrolisi mentre si eliminano altri componenti cellulari7.
Diversi metodi sono utilizzati per ottenere l'estratto grezzo di un anemone di mare; alcuni implicano il sacrificio dell'organismo mentre altri permettono che sia mantenuto in vita. I metodi che implicano l'uso di tutto il corpo dell'organismo consentono il rilascio della maggior parte delle tossine dal veleno8, rispetto ai metodi che mantengono in vita gli organismi, che estraggono solo alcuni componenti del veleno9. La preparazione di un estratto richiede la valutazione della presenza e della potenza di una sostanza di interesse attraverso uno specifico biodosaggio, che include strategie per osservare gli effetti farmacologici con metodi in vivo o in vitro 10.
Il veleno di anemoni di mare contiene polipeptidi citolitici, tossine che formano pori (PFT)11 e fosfolipasi12; queste molecole sono modelli nello studio dell'interazione proteina-lipidi, strumenti molecolari nella terapia del cancro e biosensori basati su nanopori3. La classificazione dei PFT di anemoni di mare viene effettuata in base alle loro dimensioni o peso molecolare, da 5 kDa a 80 kDa. Il PFT da 20 kDa, il più studiato e conosciuto come actinoporine11, è di particolare interesse per il suo potenziale biomedico nello sviluppo di strumenti molecolari per possibili applicazioni come biosensori antitumorali, antimicrobici e basati su nanopori. Un'altra citolisina, comprese le fosfolipasi, in particolare la fosfolipasi A2 (PLA2)13, rilascia un acido grasso dovuto e idrolizza i fosfolipidi, destabilizzando la membrana cellulare. Grazie a questo meccanismo d'azione, PLA2 promette di essere un modello essenziale per lo studio e le applicazioni nelle malattie infiammatorie. Potrebbe servire come modello per gli studi sul comportamento lipidico nella membrana cellulare14.
Qui, descriviamo un protocollo efficiente per ottenere l'estratto grezzo dall'anemone di mare Anthopleura dowii Verrill, 1869, e rilevare emolisine e fosfolipasi. Entrambe sono tossine rilevanti che potrebbero essere utilizzate come modello per progettare nuovi strumenti molecolari.

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga conica da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>2-Bromofenolo blu</td><td>Sigma</td><td>B75808</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>J.T. Baker</td><td>9515-03</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Promega</td><td>V3115</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrilammide</td><td>Promega</td><td>V3143</td><td></td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica bovina V</td><td>Sigma</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saggi proteici</td><td>di Bradford Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari 96 pozzetti, V-bottom</td><td>Corning</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Corning</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP system</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blu brillante G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610406</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blu brillante R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>J.T. Baker</td><td>1916-01</td><td></td></tr><tr><td>Recinzione senza condotto</td><td>Labconco</td><td>https://imagej.nih.gov/ij verticale</td><td>ImageJ 1.53c</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ</td><td>Bio Rad.</td><td></td><td>Sistema di documentazione su gel</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-4L</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Marienfeld</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Software)</td><td>NIH, USA</td><td>Versione 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore 211</td><td>Labnet</td><td>I5211 DS</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>J.T. Baker</td><td>9049-03</td><td></td></tr><tr><td>Tetra cella</td> <td>Mini-PROTEANBio-Rad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3824-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-05</td><td></td></tr><tr><td>Origin software</td><td></td><td>versione 9</td><td>Per progettare la trama con regolazioni sigmoidali</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman kit</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Mini gel prefabbricato</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252433</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>JT Baker</td><td>3646-01</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>G10S UV-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Volt Alimentatore</td><td>Hoefer</td><td>PS300B</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

La composizione del veleno di anemone di mare comprende molecole polipeptidiche e non proteiche. I componenti citolitici hanno un elevato potenziale biotecnologico e biomedico per la progettazione di nuovi strumenti molecolari. Il veleno di anemoni di mare si trova nelle cellule ghiandolari dell'ectoderma e delle strutture subcellulari chiamate nematocisti, entrambe distribuite in tutto il corpo dell'anemone marino. Questa caratteristica implica sfide perché le cellule e la nematocisti devono essere lisate per rilasciare i componenti del veleno con altre molecole non tossiche. Pertanto, in primo luogo, il veleno è derivato da un estratto grezzo (miscela di molecole diverse e diverse e detriti tissutali). Il prossimo passo è rilevare polipeptidi con bioattività specifiche. Qui, descriviamo una strategia efficiente per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare e il biotest per identificare la presenza di citolisine. Il primo passo prevede tecniche economiche e semplici (ciclo agitato e congelamento-disgelo) per rilasciare citolisine. Abbiamo ottenuto la più alta attività citolitica e proteina (~ 500 mg di proteine da 20 g di peso secco). Successivamente, la complessità polipeptidica dell'estratto è stata analizzata dal gel SDS-PAGE rilevando proteine con pesi molecolari compresi tra 10 kDa e 250 kDa. Nel test emolitico, abbiamo utilizzato globuli rossi di pecora e determinato HU50 (11,1 ± 0,3 μg / mL). Al contrario, la presenza di fosfolipasi nell'estratto grezzo è stata determinata utilizzando il tuorlo d'uovo come substrato in un mezzo solido con agarosio. Nel complesso, questo studio utilizza un protocollo efficiente ed economico per preparare l'estratto grezzo e applica biotest replicabili per identificare citolisine, molecole con interessi biotecnologici e biomedici.

I risultati rappresentativi del protocollo utilizzato per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare hanno mostrato che la combinazione di due tecniche (agitazione e cicli di congelamento e scongelamento) produceva uno scarico efficiente di nematocisti e la quantità totale di proteine era di 500 mg (8 mg / mL) (Figura 3).
La complessità proteica dell'estratto grezzo potrebbe essere osservata da 10 kDa e superiore a 250 kDa attraverso l'elettroforesi SDS-PAGE. I...

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'estratto di veleno grezzo dall'anemone di mare e rilevare la sua attività emolitica e fosfolipasi.

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

L'interazione della tossina anemone di mare deve utilizzare il minor numero di organismi e protocolli efficienti per ottenere una grande diversità e abbondanza delle tossine e una rapida identificazione di una tossina specifica. Abbiamo combinato due tecniche efficienti per preparare l'estratto grezzo con un'elevata quantità di proteine e descrivere saggi riproducibili, specifici, veloci e poco costosi per identificare l'emolisi e le basi fostoliche nel veleno di anemone di mare. Il metodo può essere utilizzato in quasi tutti gli esempi che si decide di identificare uno o entrambi i tipi di citolisine.L'efficienza del metodo si ottiene curando i tempi in ogni fase durante la preparazione dell'estratto grezzo. La chiave per l'emolisi è un'attenta manipolazione dell'eritrocita per evitare la lisi meccanica e, nel test di fosfolisi, prendendosi cura della temperatura nella preparazione della piastra. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Santos Ramirez-Carreto, la biologa Sandra Salazar Garcia e il biologo Giovanni Macias Martinez del mio laboratorio.Inizia pulendo l'anemone di mare raccolto A.doi con acqua distillata a mano per rimuovere le grandi particelle di substrato che aderiscono al corpo. Congelare immediatamente gli organismi a meno 80 gradi Celsius in un ultragelatore per 72 ore. Quindi, posizionare gli organismi in bicchieri speciali per la liofilizzazione con condizioni di liofilizzazione per 48 ore.Per l'idratazione dei tessuti, ricostituire 20 grammi di peso secco di organismi liofilizzati con 60 millilitri di tampone fosfato di sodio 50 millimolare e una compressa di cocktail inibitore. In un agitatore magnetico, mescolare continuamente il campione a circa 800 RPM e quattro gradi Celsius per 12 ore. Dopo aver congelato il campione a meno 20 gradi Celsius per 12 ore per indurre la lisi cellulare e lo scarico di nematocisti, posizionare il contenitore in acqua a temperatura ambiente fino a quando non si scongela fino al 90%Ripetere questa procedura tre volte.Per chiarire l'estratto, centrifugare il campione a 25, 400 volte G per 40 minuti a quattro gradi Celsius. Recuperare il surnatante e centrifugarlo di nuovo. Ripeti il passaggio tre o quattro volte e recupera finalmente il surnatante.Il surnatante recuperato o estratto grezzo contiene i componenti del veleno e altre molecole cellulari come lipidi, carboidrati e acidi nucleici. Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo utilizzando un kit di analisi colorimetrica Bradford commerciale. Incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente senza agitare.Quindi, misurare l'assorbanza a 595 nanometri. Traccia le medie delle assorbanze BSA del campione e determina l'equazione del grafico dove y è l'assorbanza, m è la pendenza della linea, x è la concentrazione proteica e b è l'ordinata all'origine. Per analizzare l'estratto grezzo, aggiungere 30 microgrammi di estratto grezzo a cinque microlitri del tampone di carico proteico per denaturare le proteine.Il volume finale deve essere inferiore a 50 microlitri. Eseguire l'elettroforesi a 25 milliampere costanti per un'ora e 30 minuti. Per evitare la diffusione delle proteine del gel, aggiungere la soluzione di fissazione alle proteine e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti con agitazione a 80 RPM.Quindi, decantare la soluzione e aggiungere la soluzione di reticolazione proteica. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione a 80 RPM. Rimuovere la soluzione e lavare il gel con 100 millilitri di acqua distillata per cinque minuti.Successivamente, rimuovere l'acqua e ripetere questa procedura quattro volte. Effettuare la colorazione proteica con 50 millilitri di soluzione filtrata Coomassie Brilliant Blue R-250 mescolando a 60 RPM in un oscillatore rotativo da laboratorio a temperatura ambiente per 15 minuti. Estrarre un millilitro di sangue dalla vena giugulare di una pecora e rimuovere l'ago dalla siringa.Scaricare immediatamente il sangue in un tubo con 50 millilitri di soluzione di Alsever e centrifugare a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e aggiungere 30 millilitri di soluzione Alsever facendolo scorrere lungo le pareti interne del tubo. Risospese lentamente il pellet utilizzando una pipetta di plastica Pasteur e centrifugare nuovamente la soluzione a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Ripetere questa procedura fino a quando il surnatante non è chiarito. Mantenere il volume finale della soluzione Alsever per raggiungere una concentrazione di circa 2 milioni di cellule per millilitro. Quindi, utilizzare una camera Neubauer o un emocitometro per contare le cellule.Incubare le miscele di soluzioni per un'ora a 37 gradi Celsius senza agitare e quindi centrifugare la piastra a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Recuperare il surnatante in un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Se l'estratto grezzo contiene citolisine, gli eritrociti lisi e rilasciano emoglobina.Leggi l'assorbanza a 415 nanometri e calcola la quantità di estratto che produce l'emolisi nel 50% degli eritrociti. Aumentare la quantità di estratto grezzo di anemone di mare e progettare la trama con regolazioni sigmoidali utilizzando un software appropriato. Lavare un uovo di gallina con l'1% di SDS in acqua distillata e separare il tuorlo d'uovo dall'albume in condizioni sterili.Preparare le soluzioni A, B, C e D.Aggiungere 500 microlitri di soluzioni A e C alla soluzione B e 100 microlitri di soluzione D.Mescolarli e versare 25 millilitri in ogni capsula di Petri. Attendere che la soluzione si solidifichi in condizioni sterili e realizzare pozzetti di circa due o tre millimetri di diametro con un tubo sottile. Aggiungere un totale di 20 microlitri di tampone fosfato come controllo negativo in un pozzetto e 20 microlitri di una determinata fosfolipasi come controllo positivo in un altro pozzo.Posizionare diverse quantità di proteine dell'estratto grezzo 5, 15, 25, 35 e 45 microgrammi nei pozzetti rimanenti, ciascuno in un volume finale di 20 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 20 ore. I risultati rappresentativi del protocollo utilizzato per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare hanno dimostrato che la combinazione di due tecniche, agitazione e cicli di congelamento e scongelamento, ha prodotto uno scarico efficiente di nematocisti.I nematociti prima e dopo gli stimoli sono mostrati qui. Il tubulo di nematocisti è esposto in questa immagine, indicando il rilascio di tossine. Il profilo elettroforetico dell'estratto grezzo di anemone di mare è mostrato qui.L'estratto grezzo di anemone di mare è stato analizzato da SDS-PAGE 15% poliacrilammide gel e ha mostrato proteine da 10 kilodalton a 250 kilodalton di peso molecolare. Qui, la corsia 1 è la scala proteica e la corsia 2 è il veleno di anemoni di mare. Le citolisine sono state rilevate nella zona di peso molecolare di 15 kilodalton e 20 kilodalton.Qui è mostrato il test di emolisi negli eritrociti delle pecore. L'attività emolitica dell'estratto prima e durante i cicli di congelamento e scongelamento è aumentata fino a raggiungere l'emolisi al 100% con 50 microgrammi della proteina totale dell'estratto grezzo negli ultimi due cicli. La quantità necessaria per lisare il 50% degli eritrociti di pecora è di 11,1 0,3 microgrammi per millilitro.L'attività della fosfolipasi è stata rilevata dalla formazione di aloni chiari nelle aree della piastra di agar in cui è stato applicato il campione di estratto grezzo. I risultati mostrano la presenza di attività fosfolipasi da 15 microgrammi di proteine totali. Il diametro dell'alone è aumentato in modo dose-dipendente;cioè, se la quantità di estratto grezzo è aumentata, il diametro dell'alone è aumentato.Durante il tentativo di procedura, assicurarsi di indurre lo scarico di nematocisti, quantificare la proteina totale, analizzare l'estratto grezzo mediante elettroforesi SDS-PAGE, calcolare la quantità di proteine dell'estratto grezzo per produrre il 50% di emolisi e utilizzare diverse quantità di proteine nel saggio della fosfolipasi. Possiamo analizzare l'estratto grezzo con tecnica proteomica per identificare polipeptidi di grande rilevanza in biotecnologia e biomedicina, anche profilare e caratterizzare una molecola unica per poi produrla in laboratorio per un'applicazione. Abbiamo ottenuto parte della sequenza di una proteina performante con attività antitumorale nelle cellule epiteliali del carcinoma polmonare ostinato umano.Allo stesso modo, identifichiamo la sequenza di fosfolipasi di interesse biotecnologico.

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