Name: Recupero laparoscopico degli ovociti e crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Scopri il recupero laparoscopico degli ovociti e la crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser. Questo approccio combinato riduce le procedure invasive e preserva la fertilità futura.

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Il comitato etico locale presso il centro di riferimento terziario per MRKHS (IRCCS Ospedale Universitario San Raffaele, Milano, Italia) è stato informato e approvato il protocollo prima della sua attuazione nel luglio 2017. Tutti i pazienti o i tutori hanno dato il consenso informato firmato per il prelievo laparoscopico degli ovociti e la crioconservazione durante la vaginoplastica e per l'uso di dati clinici / di laboratorio anonimizzati per scopi scientifici.
1. Composizione del team
<ol><li>Designare un team dedicato, composto da un chirurgo laparoscopico esperto, un chirurgo vaginale esperto, un esperto di infertilità, uno psicologo dedicato e un'infermiera impegnata.</li>
	<li>Assistere il paziente come squadra durante l'intera configurazione ed esecuzione della procedura.</li>
</ol>2. Lavoro diagnostico e consulenza
<ol><li>Eseguire l'ecografia pelvica e addominale transaddominale sulla paziente per la visualizzazione delle ovaie e la stima della conta dei follicoli antrali (AFC). Valutare i livelli ematici di ormone anti-Mülleriano (AMH) per ottimizzare la dose iniziale di gonadotropina per la stimolazione ovarica controllata. Eseguire test sierologici per malattie infettive (HIV-Ab, HCV-Ab, HBV-Ab, RPR-TPHA) secondo protocolli nazionali/locali per la crioconservazione di tessuti/gameti.</li>
	<li>Consigliare il paziente sugli aspetti sessuali e riproduttivi della MRKHS, compresa la vaginoplastica non chirurgica e chirurgica, i costi e la legislazione relativi alla maternità surrogata, la prospettiva del trapianto uterino nel contesto di un programma sperimentale, i diversi approcci disponibili per il recupero degli ovociti e le prestazioni della crioconservazione degli ovociti in termini di tassi di nascita vivi.</li>
	<li>Offrire alla paziente una valutazione psicologica per sostenerla attraverso la procedura e valutare la stabilità emotiva e l'impegno e il desiderio di maternità futura. Ottenere il consenso informato firmato per il concomitante recupero laparoscopico degli ovociti, la crioconservazione dei gameti e la vaginoplastica laparoscopica. Nel caso di paziente minorenne, eseguire le valutazioni cliniche in presenza dei genitori che sottoscrivono anche il relativo consenso informato.</li>
</ol>3. Programmazione della procedura chirurgica e della stimolazione ovarica controllata
<ol><li>Programmare la procedura di recupero laparoscopico concomitante degli ovociti, crioconservazione dei gameti e vaginoplastica laparoscopica, tenendo conto della disponibilità del team clinico (vedi sopra) e del personale di laboratorio che esegue la vitrificazione degli ovociti.</li>
	<li>Iniziare la stimolazione ovarica controllata (COS) il giorno -14 dal giorno dell'intervento, tenendo conto di una durata pianificata della COS di n = 12 giorni e delle 36 ore necessarie tra l'innesco dell'ovulazione e il prelievo e la vitrificazione degli ovociti.</li>
	<li>Nel caso in cui la COS richieda una durata diversa da quella prevista, riprogrammare l'intervento di conseguenza.</li>
</ol>4. Stimolazione ovarica controllata: dose iniziale, aggiustamenti della dose e monitoraggio, innesco della maturazione finale degli ovociti
<ol><li>Iniziare la COS in qualsiasi fase del ciclo ovarico, come comunemente fatto nel contesto dei protocolli di "avvio casuale" per la conservazione della fertilità.</li>
	<li>Scegliere la dose iniziale di ormone follicolo-stimolante (FSH)/gonadotropina della menopausa umana (hMG) in base all'AFC e all'AMH del paziente e istruire il paziente a continuare le iniezioni sottocutanee quotidiane autosomministrate. Eseguire successivamente aggiustamenti personalizzati della dose in base alla risposta ovarica.</li>
	<li>Monitorare la risposta ovarica mediante ecografia transaddominale seriale e misurazioni concomitanti di E2 e P (giorno 1, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12).</li>
	<li>Innescare la maturazione finale degli ovociti mediante somministrazione sottocutanea di 0,2 mL di un analogo del Gn-RH (Triptorelina).</li>
</ol>5. Procedura clinica (laparoscopia): prelievo ovocitario
<ol><li>Posizionare il paziente in posizione di litomia dorsale modificata, che consente un eccellente accesso simultaneo all'addome e al perineo. Indurre l'anestesia generale e somministrare 2 g di Cefazolin per via endovenosa come da profilassi antibiotica intraoperatoria di routine. Posizionare un catetere Foley intravescicale.</li>
	<li>Stabilire lo pneumoperitoneo con un ago Veress peri-ombelicale, posizionare un trocar ombelicale da 10 mm per l'inserimento del laparoscopio e due trocar da 5 mm nei quadranti superiori destro e sinistro. Sotto visione laparoscopica, utilizzare un ago a lume singolo da 17 G collegato a una pompa di aspirazione, come comunemente impiegato per il recupero transvaginale, attraverso i trocar destro e sinistro per la puntura dell'ovaio destro e sinistro, rispettivamente.</li>
	<li>Sollevare e tenere le ovaie con una pinza laparoscopica per facilitare l'esposizione dei follicoli. Quando si aspirano più follicoli vicini l'uno all'altro, mantenere la punta dell'ago nell'ovaio per ridurre il numero di volte in cui la corteccia ovarica viene trafitta e il rischio intrinseco di sanguinamento.</li>
</ol>6. Procedura clinica (laparoscopia): vaginoplastica
NOTA: Le fasi della vaginoplastica rimangono invariate rispetto alla tecnica laparoscopica modificata di Davydov12.
<ol><li>Sezionare il peritoneo sollevando e incidendo il filamento peritoneale trasversalmente tra le due corna uterine rudimentali, quindi estendendo l'incisione anteriormente, lateralmente e posteriormente.</li>
	<li>Iniziare una sutura a corda di borsa in polidiossanone sintetico assorbibile (PDS) 2-0 monofilamento in ciascun emipelvi, dal peritoneo mobilizzato sopra la vescica, con trasfissione consecutiva del legamento rotondo, dell'istmo tubarico, del legamento uteroovarico e della foglia peritoneale laterale. Quindi, includere nelle due suture l'aspetto laterale del mesoretto e l'aspetto anteriore della sierosa rettale, immediatamente sotto la giunzione rettosigmoideo.</li>
	<li>Esporre la fossetta vaginale sull'approccio perineale ed eseguire un'incisione a forma di H e creare uno spazio neovaginale mediante una dissezione netta e smussata dello spazio vescicorettale. Quindi, tirare giù i margini peritoneali sezionati fino al bordo del vestibolo vaginale. Suture interrotte di posizione in PDS 3-0 per l'anastomosi peritoneale-vestibolare. Infine, posizionare una garza rivestita di paraffina nella neovagina rivestita di peritoneo.</li>
</ol>7. Laboratorio FIV: il giorno prima del prelievo degli ovociti
<ol><li>Preparare da 2 a 5 provette a fondo tondo con 9 ml di Quinn's Advantage Medium con HEPES (integrato con albumina sierica umana al 5% [HSA]) in base al numero di follicoli attesi e incubarli per una notte a 37 °C.</li>
	<li>Preparare uno o due piatti a 4 pozzetti con 0,5 ml/pozzetto di terreno di fecondazione (integrato con HSA al 5%), coperto con 0,5 ml di olio minerale per coltura embrionale e incubarlo per una notte a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O2).</li>
	<li>Preparare un piatto contenente 9 (30 μL) gocce di terreno di coltura singola continua (CSCM) (integrato con un integratore sostitutivo del siero al 10% [SSS]) coperto con 6 ml di olio minerale. Incubarlo per una notte a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O2).</li>
</ol>8. Laboratorio FIVET: procedura di prelievo degli ovociti
<ol><li>Preparare una soluzione di Quinn's Advantage Medium con HEPES (integrato con HSA al 5%) con eparina ad una concentrazione finale di 10 UI/mL in cui verranno raccolti aspirati follicolari.</li>
	<li>Analogamente al prelievo transvaginale di routine degli ovociti 13, raccogliere gli aspirati follicolari in tubi a fondo tondo da 10 ml, tenuti caldi (37 °C) in un'incubatrice portatile e immediatamente trasportati al laboratorio di embriologia, con un tempo di trasporto di circa10 minuti.</li>
	<li>Esaminare il liquido follicolare in una capsula di Petri sterile preriscaldata da 90 mm per identificare i complessi cumulo-ovocita (COC). Una volta rilevato un COC, sciacquarlo in un piatto a pozzetto centrale riempito con 1 ml di Quinn's Advantage Medium preriscaldato con HEPES (integrato con HSA al 5%).</li>
	<li>Man mano che tutti i COC vengono raccolti, posizionarli nel piatto a 4 pozzetti contenente il Mezzo di Fecondazione ed etichettare il coperchio e il fondo con i dati relativi all'identità del paziente.</li>
	<li>Incubarli a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O2).</li>
	<li>Assicurarsi che un secondo membro del personale del laboratorio esegua un doppio controllo della procedura.</li>
</ol>9. Denudazione degli ovociti
<ol><li>Eseguire la rimozione delle cellule cumuliformi / corona entro 38 ore dal trigger dell'ovulazione.</li>
	<li>Preparare una soluzione di Quinn's Advantage Medium con HEPES (integrato con HSA al 5%) con ialuronidasi ad una concentrazione finale di 10 UI/ml.</li>
	<li>Preparare un piatto a pozzetto centrale con 1 ml di Quinn's Advantage Medium preriscaldato con HEPES (integrato con HSA al 5%) contenente ialuronidasi e un altro con 1 ml di terreno preriscaldato tamponato HEPES (integrato con HSA al 5%).</li>
	<li>Etichettare le piastre di denudazione degli ovociti con i dati di identificazione della paziente.</li>
	<li>Posizionare i COC nel pozzetto centrale contenente l'enzima per disperdere le cellule del cumulo con una pipetta Pasteur di vetro, pipettando delicatamente la soluzione contenente COC su e giù per un massimo di 30 s.</li>
	<li>Spostare gli ovociti nel secondo piatto centrale contenente solo terreno tamponato HEPES, assicurandosi di spostare una quantità minima dell'enzima.</li>
	<li>Rimuovere le restanti celle corona utilizzando pipette denudate con diametri interni decrescenti (170-140 μm).</li>
	<li>Valutare lo stadio di maturazione degli ovociti, separando gli ovociti in metafase II (MII), caratterizzati dall'estrusione del primo corpo polare, dagli ovociti in metafase I (MI) e dalle vescicole germinali (GV).</li>
	<li>Trasferire gli ovociti MII in una coltura IVF 60 mm capsula di Petri contenente nove (30 μL) gocce di terreno di coltura singola continua (CSCM) (integrato con supplemento sostitutivo sierico al 10% [SSS]) coperto con 6 ml di olio minerale.</li>
	<li>Incubarli a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O2).</li>
</ol>10. Vitrificazione degli ovociti
<ol><li>Eseguire la vitrificazione degli ovociti MII subito dopo la denudazione degli ovociti, seguendo il protocollo fornito dal produttore del kit di vitrificazione.</li>
	<li>Portare a temperatura ambiente (25-27 °C): la soluzione di equilibrazione (ES), la soluzione di vetrificazione (VS) e la soluzione di lavaggio (WS), circa 30 minuti prima della procedura. NOTA: Come riportato dai produttori, ES contiene il 7,5% di DMSO, il 7,5% di glicole etilenico, il 20% di supplemento di destrano siero (DSS), la gentamicina nel mezzo tamponato HEPES M-199; VS contiene il 15% di DMSO, il 15% di glicole etilenico, 0,5 M di saccarosio, il 20% di DSS, la gentamicina in un terreno tamponato con HEPES M-199 e WS contiene il 20% di DSS, gentamicina in un terreno tamponato con HEPES M-199.</li>
	<li>Per un criodispositivo, utilizzare Cryotop costituito da una sottile striscia di pellicola trasparente attaccata a un manico di plastica.</li>
	<li>Etichettare i criodispositivi con il nome della paziente, la data di nascita, l'ID, la data di crioconservazione e il numero di ovociti caricati su ogni singolo dispositivo.</li>
	<li>Etichettare il piatto di vitrificazione con il nome e l'ID del paziente.</li>
	<li>Assicurarsi che un operatore testimone controlli i dati corretti del paziente sui criodispositivi e sulla parabola.</li>
	<li>Riempire una scatola di raffreddamento fino alla parte superiore con azoto liquido fresco e coprire fino all'uso per ridurre al minimo la dispersione e l'evaporazione.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta stripper con un diametro interno di 170 μm per evitare di danneggiare gli ovociti durante la manipolazione.</li>
	<li>Agitare delicatamente ogni flaconcino di ES, VS e WS per mescolare il contenuto prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare il coperchio di una capsula di Petri da 60 mm con una goccia di 50 μL di WS1 (Figura 1A).</li>
	<li>Posizionare le gocce appena prima dell'uso per limitare l'evaporazione del mezzo.</li>
	<li>Prelevare il piatto ovocitario dall'incubatrice e trasferire gli ovociti MII (fino a 3 alla volta) con un volume minimo di terreno dal piatto di coltura nei 50 μL di WS.</li>
	<li>Erogare 50 μL di gocce di WS2, ES1 ed ES2 in prossimità e trasferire gli ovociti dalla goccia WS1 alla goccia WS2 (Figura 1B).</li>
	<li>Unire la goccia di ES1 a WS2 e attendere 2 minuti per la miscelazione spontanea di entrambe le soluzioni.</li>
	<li>Quindi, unire la goccia di ES2 alle gocce precedentemente unite e lasciare per altri 2 minuti.</li>
	<li>Infine, unire una nuova goccia da 100 μL di ES3 alle gocce precedentemente unite e lasciare agire per 1 minuto aggiuntivo.</li>
	<li>Posizionare gli ovociti in una goccia di 100 μL di ES4 per 10 minuti (Figura 1C).</li>
	<li>Erogare due gocce da 50 μL di VS e una da 100 μL di VS (Figura 1D).</li>
	<li>Spostare gli ovociti in sequenza nelle tre gocce di VS per 60 s in modo che gli ovociti rimangano in ogni goccia per ~ 20 s.</li>
	<li>Quando rimangono circa 10 s prima della fine dei 60 s di incubazione, posizionare il criodispositivo al microscopio.</li>
	<li>Portare gli ovociti sulla punta della pipetta e posizionarli sul criodispositivo con la quantità minima di VS.</li>
	<li>Aspirare l'eccesso di VS, lasciando gli ovociti coperti da un sottile strato di VS.</li>
	<li>Immergere il criodispositivo direttamente nell'azoto liquido e spostarlo rapidamente. Conservare il dispositivo in azoto liquido e coprirlo con il coperchio protettivo.</li>
	<li>Conservare il criodispositivo in un sistema di stoccaggio (ad esempio, visiotube) e posizionarlo nel serbatoio criogenico. Registrare i dati di crioconservazione sul database e sul foglio di laboratorio.</li>
</ol>11. Assistenza postoperatoria ospedaliera
<ol><li>Rimuovere il catetere urinario e la garza vaginale rivestita di paraffina 48 ore dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Esplorare digitalmente la neovagina delle pazienti dopo la rimozione e istruire la paziente su come eseguire l'esplorazione digitale. Quindi, rivestire uno stampo vaginale (9 cm di lunghezza e 2 cm di diametro) con gel di estrogeni (per favorire l'epitelizzazione) e istruire la paziente su come inserire e mantenere lo stampo.</li>
	<li>A partire dal giorno 3 dopo l'intervento e ogni giorno successivo, istruire il paziente su come posizionare lo stampo e mantenerlo in posizione per almeno 2 ore al giorno.</li>
	<li>Se non si verificano complicazioni, dimettere il paziente il giorno 5-6 dopo l'intervento.</li>
</ol>12. Assistenza postoperatoria ambulatoriale
<ol><li>Istruire la paziente su come eseguire la dilatazione neovaginale per 2 mesi con lo stesso stampo (9 cm di lunghezza e 2 cm di diametro) utilizzato durante la degenza ospedaliera, e poi uno più grande (11 cm di lunghezza e 2,5 cm di diametro).</li>
	<li>Dopo la visita di 3 mesi, consentire alla paziente di iniziare l'attività sessuale e informarla di continuare a utilizzare gli stampi nei giorni in cui non ci sono rapporti sessuali.</li>
</ol>13. Seguito dato
<ol><li>Pianifica visite di follow-up a 1, 3, 6 e 12 mesi dopo la procedura.</li>
	<li>Ad ogni visita di follow-up, valutare la conformità con gli esercizi di dilatazione e chiedere al paziente se ha sperimentato limitazioni alle sue attività della vita quotidiana, dolore, sintomi urinari o disfunzione sessuale (a partire dalla visita dopo il terzo mese dopo l'intervento). Eseguire un esame ginecologico ad ogni visita di follow-up per misurare la larghezza vaginale, la lunghezza, la sospensione e la mobilità degli annessi.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Questo protocollo riduce l'invasività nel trattamento della MRKHS combinando le procedure di vaginoplastica e recupero degli ovociti. A tal fine, è fondamentale che venga designato un team dedicato per garantire che i tempi della COS, la procedura chirurgica e la vitrificazione degli ovociti siano programmati in modo efficiente.
I pazienti MRKHS per i quali questo metodo laparoscopico combinato dovrebbe essere più vantaggioso sono quelli in cui un recupero transvaginale sarebbe considerato tec...

Con un'incidenza di circa 1 su 4-10.000 donne, MRKHS è la causa del 15% dei casi di amenorrea primaria. La MRKHS è caratterizzata dall'assenza congenita del segmento superiore della vagina e dell'utero, mentre le anomalie del tratto urinario e scheletrico sono associate in modo variabile. Più specificamente, di solito è presente una volta vaginale con una profondità di 1-2 cm e si possono trovare due corna uterine rudimentali1.
In passato, l'interesse medico primario nel MRKHS era quello di consentire un normale rapporto sessuale, che generalmente richiede la costruzione di una neovagina con approcci non chirurgici o chirurgici2. Tuttavia, i progressi nella medicina riproduttiva attualmente consentono la maternità genetica nei pazienti MRKHS, mediante maternità surrogata3,4 o, più recentemente, trapianto di utero5. Mentre il trapianto di utero è ancora una procedura sperimentale, la maternità surrogata è disponibile in molti paesi del mondo6 e gli esiti ostetrici e psicosociali riportati sono paragonabili a quelli della fecondazione in vitro standard e della donazione di ovociti7.
Sia la maternità surrogata che il trapianto di utero richiedono il prelievo degli ovociti e la fecondazione in vitro, ma non esiste un consenso su come eseguire la raccolta degli ovociti nei pazienti con MRKHS. Un approccio transvaginale può essere impraticabile a causa dell'insufficiente elasticità vaginale8 anche dopo vaginoplastica, posizione atipica delle ovaie9 o distanza eccessiva tra le ovaie e il bracciale vaginale 4,10. In questi casi, il prelievo laparoscopico degli ovociti rappresenta l'approccio ottimale in termini di accesso chirurgico. Tuttavia, poiché la maggior parte dei pazienti MRKHS attualmente sottoposti a neovaginoplastica laparoscopica, suggeriamo di eseguire un prelievo laparoscopico degli ovociti al momento dell'intervento chirurgico per vaginoplastica11, seguito dalla crioconservazione degli ovociti per uso futuro, riducendo così al minimo l'invasività e combinando il trattamento della funzione sessuale e riproduttiva dei pazienti MRKHS.
Dati demografici dei pazienti Ventitré pazienti MRKH sono stati sottoposti finora a trattamento con questo protocollo. I risultati anamnestici, strumentali e di laboratorio dei pazienti sono riassunti nella Tabella 1. Se non specificato nella Tabella 1, non sono state riscontrate anomalie congenite associate.

<table><tbody><tr><td>Procedura di recupero degli ovociti<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>u>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 O2 Incubatore</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Cooper Surgical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice portatile</td><td>Stereomicroscopio chirurgico</td><td></td><td></td>Cooper</tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 mL di polistirene Tubo a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 4 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Piastra Petri</td><td>Nunc</td><td>FA9150270</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petri piatto</td><td>Nunc</td><td>FA9150360</td><td></td></tr><tr><td>Siero Umano Albumina 100 mg/ml in Soluzione Fisiologica (5%)</td><td>Origio</td><td>3001</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale per coltura embrionale</td><td>Origio</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>One Well Dish</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05</td><td></td></tr><tr><td>Quinn' s Advantage Terreno di concimazione SAGE</td><td>Origio</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>Quinn' s Advantage medium con HEPES</td><td>Origio</td><td>1024</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sterili in vetro pasteur<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Denudazione degli ovociti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 O2 Incubatrice</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexipet manico regolabile set</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Stereomicroscopio chirurgico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooper Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumabili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 pozzetti</td><td>piatto Nunc</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>CSCM (Coltura singola continua) mezzo</td><td>Fujifilm irvine Scientific</td><td>90165</td><td></td></tr><tr><td>Albumina umana 100 mg/mL in soluzione salina normale (5%)</td><td>Origio</td><td>3001</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90101</td><td></td></tr><tr><td>Coltura IVF Piastra di Petri da 60 mm</td><td>Nunc</td><td>FA9150270</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale per coltura embrionale</td><td>Origio</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>One Well Dish</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05</td><td></td></tr><tr><td>Quinn' s Advantage medium con HEPES</td><td>Origio</td><td>1024</td><td></td></tr><tr><td>Integratore sostitutivo del siero</td><td>Fujifilm irvine Scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td></td>sterili in vetro pasteur</tr><tr><td>Stripping puntali per pipette (140 &mu; m)</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1140-10BS-5</td><td></td></tr><tr><td>Stripping puntali per pipette (170 &mu; m)</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td></td></tr><tr><td>Vitrificazione di ovociti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Piastra di Petri</td><td>NUNC</td><td>150255</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Piastra di Petri</td><td>NUNC</td><td>150270</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 90 mm</td><td>NUNC</td><td>150360</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per Rack di raffreddamento</td><td>Kitazato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryodevice/cryotop</td><td>Kitazato</td><td>81111</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td>elettronico</tr><tr><td>Flexipet</td><td>COOK</td><td>K- 1000</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson F123601</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stampante da laboratorio LabXpert</td><td>Brady</td><td>XSL-86-461</td><td></td></tr><tr><td>Punte 20-200 &; L</td><td>Thermo Scientific</td><td>2160G</td><td></td></tr><tr><td>Punte 2-20 &; L</td><td>Thermo Scientific</td><td>2139-HR</td><td></td></tr><tr><td>Visotubes</td><td>Cryo Bio System</td><td>20</td><td></td></tr><tr><td>Kit di congelamento per vetrificazione</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90133-SO</td><td></td></tr><tr><td>Kit di disgelo per vetrificazione</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90137-SO</td><td></td></tr></tbody></table>

recupero laparoscopico degli ovociti e crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di mayer-rokitansky-kuster-hauser

Laparoscopic Oocyte Retrieval and Cryopreservation during Vaginoplasty for Treatment of Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser Syndrome

Nei pazienti con sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKHS) che sono programmati per vaginoplastica laparoscopica e hanno un desiderio di maternità biologica, proponiamo che venga eseguito un concomitante prelievo laparoscopico degli ovociti per la crioconservazione. Il prelievo ovocitario viene effettuato all'inizio della laparoscopia. Vengono posizionati trocar destro e sinistro da 5 mm, attraverso i quali viene utilizzato un ago di aspirazione dell'ovulo da 17 G per la puntura delle ovaie destra e sinistra, rispettivamente. Per facilitare l'esposizione dei follicoli, le ovaie vengono mobilitate e trattenute con una pinza laparoscopica.
Quando si aspirano più follicoli vicini l'uno all'altro, la punta dell'ago viene trattenuta nell'ovaio per ridurre il numero di volte in cui la corteccia ovarica viene trafitta e a causa del rischio intrinseco di sanguinamento. I passaggi successivi sono invariati rispetto alla tecnica modificata laparoscopica Davydov per vaginoplastica. Prima dell'intervento chirurgico, la stimolazione ovarica controllata viene eseguita con un protocollo antagonista dell'ormone di rilascio dell'ormone gonadotropina (Gn-RH) e la procedura concomitante di prelievo degli ovociti e vaginoplastica è programmata 36 ore dopo il trigger finale della maturazione follicolare. Il liquido follicolare viene raccolto nelle stesse provette sterili da 10 ml utilizzate durante il prelievo transvaginale degli ovociti e trasferito in un blocco riscaldante (37 °C) al laboratorio di riproduzione assistita, dove gli ovociti maturi (metafase II) vengono vitrificati.
In questo caso, una serie di 23 donne con MRKH, ovociti sono stati recuperati con successo e crioconservati in tutte le pazienti; La vaginoplastica è stata successivamente condotta senza modifiche e le cure postoperatorie ospedaliere e ambulatoriali (giorno della rimozione del catetere urinario, giorno della dimissione ospedaliera, uso del dilatatore e comfort al follow-up) sono rimaste inalterate. Una complicanza postoperatoria si è verificata in un paziente (febbre che si è sviluppata il giorno 5 dopo l'intervento chirurgico e rilevamento del liquido intraperitoneale all'ecografia transaddominale) e si è risolta dopo un trattamento conservativo. Piuttosto che eseguire vaginoplastica chirurgica e ritardare il prelievo degli ovociti nei pazienti MRKH, questo approccio combina entrambe le procedure in un'unica laparoscopia, riducendo così al minimo l'invasività chirurgica e i rischi anestesiologici.

La Tabella 2 include i dati di stimolazione ovarica delle pazienti, mentre i principali esiti chirurgici e funzionali sono descritti nella Tabella 3. Le procedure laparoscopiche concomitanti di prelievo degli ovociti e vaginoplastica sono state combinate con successo in tutte le pazienti. Sono stati recuperati in media 11,4 ± 5,4 (media ± DS) ovociti e 9,6 ± 4,3 ovociti MII sono stati crioconservati (Tabella 3). Nella nostra esperienza con la crioconservazione degli ovoc...

Un team dedicato può offrire alle pazienti Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser la possibilità di eseguire la stimolazione ovarica controllata e la crioconservazione degli ovociti al momento della vaginoplastica laparoscopica.

Recupero laparoscopico degli ovociti e crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser

In Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser Syndrome (MRKHS) patients who are scheduled for laparoscopic vaginoplasty and have a desire for biological motherhood, ...

Il nostro approccio consente di ridurre al minimo la malattia invasiva nel trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser combinando vaginoplastica laparoscopica e prelievo ovocitario per futuri trattamenti di fertilità. I principali vantaggi del nostro approccio sono la necessità di una singola anestesia e il superamento dell'impossibilità di un prelievo transvaginale degli ovociti nelle pazienti Rokitansky più giovani. La procedura sarà dimostrata da Diana Delprato, ginecologa senior della nostra unità di infertilità e da Alessandra Alteri e Greta Cermisoni, due embriologhe cliniche senior del nostro laboratorio di riproduzione assistita.Inizia la stimolazione ovarica controllata il giorno 14 dal giorno dell'intervento. Monitorare la risposta ovarica mediante ecografia transaddominale seriale e misurazioni concomitanti di estradiolo e progesterone. Stabilire lo pneumoperitoneo con una tecnica aperta.Posizionare un trocar ombelicale da 10 millimetri per l'inserimento del laparoscopio e tre trocar da cinque millimetri nei quadranti inferiori centrale, destro e sinistro. Sotto visione laparoscopica, utilizzare un ago a lume singolo calibro 17 collegato a una pompa di aspirazione, come comunemente impiegato per il recupero transvaginale attraverso i trocar centrali e sinistri per la puntura dell'ovaio destro e sinistro, rispettivamente. Sollevare e tenere le ovaie con una pinza laparoscopica per facilitare l'esposizione dei follicoli.Quando si aspirano più follicoli vicini l'uno all'altro, mantenere la punta dell'ago nell'ovaio per ridurre il numero di volte in cui la corteccia ovarica viene trafitta e il rischio intrinseco di sanguinamento. Sezionare il peritoneo sollevando e incidendo il filamento peritoneale trasversalmente tra le due corna uterine rudimentali, quindi estendendo l'incisione lateralmente, anteriormente e posteriormente. Esporre la fossetta vaginale sull'approccio perineale ed eseguire un'incisione a forma di H e creare uno spazio neo-vaginale mediante una dissezione netta e smussata dello spazio vescicorettale.Quindi, tirare giù i margini peritoneali sezionati fino al bordo del vestibolo vaginale. Suture di posizione interrotta in polidiossanone sintetico assorbibile 3-0 per l'anastomosi vestibolare peritoneale. Iniziare una sutura di corda della borsa in polidiossanone sintetico assorbibile 2-0 monofilamento in ciascun emipelvi dal peritoneo mobilizzato sopra la vescica con trasfissazione connettiva del legamento rotondo, dell'istmo tubarico, del legamento utero-ovarico e della foglia peritoneale laterale.Quindi, includere nelle due suture l'aspetto laterale del mesoretto e l'aspetto anteriore della sierosa rettale immediatamente sotto la giunzione rettosigmoideo. Infine, posizionare una garza rivestita di paraffina nella neovagina rivestita di peritoneo. Raccogliere gli aspirati follicolari in tubi a fondo tondo da 10 millimetri tenuti caldi in un'incubatrice portatile e trasportarli immediatamente al laboratorio di embriologia con un tempo di trasporto di circa 10 minuti.Man mano che tutti i complessi di ovociti cumuliformi vengono raccolti, posizionarli nel piatto a quattro pozzetti contenente il mezzo di fecondazione ed etichettare il coperchio e il fondo con i dati relativi all'identità del paziente. Incubarli a 37 gradi Celsius in un'atmosfera controllata contenente il 6% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno. Assicurarsi che un secondo membro del personale del laboratorio esegua un doppio controllo della procedura.Eseguire la rimozione delle cellule della corona cumuliforme entro 38 ore dal trigger post-ovulazione. Posizionare i complessi di ovociti cumuliformi nel pozzetto centrale contenente l'enzima per disperdere le cellule cumuliformi con una pipetta Pasteur di vetro, pipettando delicatamente la soluzione contenente complessi di ovociti cumuliformi su e giù per un massimo di 30 secondi. Spostare gli ovociti nel secondo piatto centrale contenente solo terreno tamponato HEPES, assicurandosi di spostare una quantità minima dell'enzima.Rimuovere le cellule corona rimanenti utilizzando pipette denudate con diametri interni decrescenti. Valutare lo stadio di maturazione degli ovociti, separando gli ovociti in metafase II. Trasferire gli ovociti in metafase II in una capsula di Petri di 60 millimetri per coltura IVF contenente nove gocce di terreno di coltura singolo continuo coperto con sei millimetri di olio minerale.Incubarli a 37 gradi Celsius in un'atmosfera controllata contenente il 6% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno. Riempire una scatola di raffreddamento fino alla parte superiore con azoto liquido fresco e coprire fino a quando non viene utilizzato per ridurre al minimo la dispersione e l'evaporazione. Utilizzare una pipetta stripper con un diametro interno di 170 micrometri per evitare di danneggiare gli ovociti durante la manipolazione.Agitare delicatamente ogni flaconcino di soluzione equilibrante, soluzione di vitrificazione e soluzione di lavaggio per miscelare il contenuto prima dell'uso. Preparare il coperchio di una capsula di Petri da 60 millilitri con una goccia di 50 microlitri di soluzione di lavaggio uno. Posizionare le gocce appena prima dell'uso per limitare l'evaporazione del mezzo.Prelevare il piatto ovocitario dall'incubatrice e trasferire gli ovociti in metafase II con un volume minimo di terreno dal piatto di coltura nei 50 microlitri di soluzione di lavaggio. Erogare gocce da 50 microlitri di soluzione di lavaggio due, soluzione di equilibrio uno e soluzione di equilibrio due in prossimità e trasferire gli ovociti dalla soluzione di lavaggio a goccia uno alla soluzione di lavaggio a goccia due. Unire la goccia di soluzione di equilibrio uno alla soluzione di lavaggio due e attendere due minuti per la miscelazione spontanea di entrambe le soluzioni.Quindi, unire la goccia di soluzione di equilibrio due alle gocce precedentemente unite e lasciare per altri due minuti. Infine, unire una nuova goccia da 100 microlitri di soluzione di equilibrio tre alle gocce precedentemente unite e lasciare per un altro minuto. Mettere gli ovociti in una goccia da 100 microlitri di soluzione equilibrante quattro per 10 minuti.Erogare due gocce da 50 microlitri di soluzione di vitrificazione e una da 100 microlitri di soluzione di vitrificazione. Spostare gli ovociti in sequenza nelle tre gocce di soluzione vitrificata per 60 secondi in modo che gli ovociti rimangano in ogni goccia per circa 20 secondi. Quando mancano circa 10 secondi alla fine dei 60 secondi di incubazione, posizionare il criodispositivo al microscopio.Portare gli ovociti sulla punta della pipetta e posizionarli sul criodispositivo con la quantità minima di soluzione di vitrificazione. Aspirare la soluzione vitrificica in eccesso, lasciando gli ovociti coperti da un sottile strato di soluzione vitrificativa. Immergere il criodispositivo direttamente nell'azoto liquido e spostarlo rapidamente.Conservare il dispositivo in azoto liquido e coprirlo con un coperchio protettivo. Le procedure laparoscopiche concomitanti di prelievo degli ovociti e vaginoplastica sono state combinate con successo in tutte le pazienti. Sono stati recuperati in media 11,4 ovociti 5,4 e crioconservati 9,6 ovociti da 4,3 M2.Il tempo operativo medio totale è stato di 114 17 minuti. La perdita di sangue intraoperatoria è stata insignificante in tutti i pazienti e non sono stati osservati eventi avversi intraoperatori. Il terzo giorno dopo l'intervento, i pazienti hanno iniziato l'uso quotidiano del dilatatore e sono stati dimessi il giorno 6.0 1.0.Si raccomanda una prudente aspirazione dei follicoli all'interno dell'ovaio, con la dovuta attenzione alla mobilizzazione automatica delle ovaie al fine di garantire un accesso e un recupero ottimali.

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Recupero laparoscopico degli ovociti e crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (Video) | JoVE Journal

Recupero laparoscopico degli ovociti e crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser

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