Imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale

Il nostro protocollo presenta una microscopia ottica multimodale, non lineare, e la applica per eseguire l'imaging chimicamente specifico delle nanoparticelle d'oro nelle cellule tumorali. Il vantaggio principale del nostro sistema di imaging è che può essere utilizzato per rivedere il contrasto biomolecolare delle strutture cellulari e delle nanoparticelle d'oro in modo multimodale. Per iniziare, accendere le spine di tutte le apparecchiature, tranne la scatola del telecomando.

Quindi, accendere il retro della scatola e premere Avvia operazione dopo che la luce del telecomando diventa blu sulla scatola di controllo. Successivamente, accendere il PC del microscopio a scansione laser ed eseguire il software del microscopio confocale. Quindi, controllare il percorso della luce del microscopio utilizzando il software del computer e controllare la messa a fuoco attraverso il touch screen o le manopole del telecomando o il software del computer.

Selezionare le impostazioni dell'immagine desiderate nel software, tra cui Zoom, Dimensioni immagine in pixel e Tempo di permanenza pixel, assicurandosi che il tempo di permanenza dei pixel sia maggiore del tempo di integrazione. Posizionare una goccia di acqua distillata sopra l'obiettivo di immersione in acqua che focalizza i raggi laser nel campione e tra il condensatore e il campione per l'imaging. Quindi, regolare l'altezza del condensatore a circa un millimetro sopra il campione per raccogliere la quantità massima di luce e spostare il rilevatore SRS posizionato su un supporto mobile fuori dal percorso del fascio per concentrarsi sul campione utilizzando la luce bianca.

Utilizzando le impostazioni del software, selezionare il fascio della pompa e modificare la lunghezza d'onda del laser a 802 nanometri per le vibrazioni CH e 898 nanometri per il picco dell'ammide I, tenendo conto dei grandi cambiamenti nello spostamento Raman. Per ottenere piccoli aggiustamenti nello spostamento Raman, scansionare la fase di ritardo nell'unità SFTRU come descritto nel manoscritto. Per il set di dati iperspettrali, selezionare la scheda Trigger, fare clic su Start by ttl trigger on, quindi selezionare Trigger every frame.

Quindi, nella scheda Serie, impostare la serie temporale su e la serie Z disattivata. Inoltre, impostare il numero di fotogrammi nella serie temporale in modo che corrisponda al numero di passaggi nel software ATM. Successivamente, vai alla scheda Esegui nel software ATM e imposta le posizioni dello stadio di ritardo per CH a 90,25 e 92,25, mentre per la regione ammide I a 89 e 91 in millimetri, corrispondenti alla posizione di inizio e arresto della scansione iperspettrale, assicurandoti che il numero di passi corrisponda al numero di fotogrammi nel software del computer.

Dopo aver controllato le impostazioni corrette, avviare lo stack iperspettrale nel software del computer andando prima su Acquisisci e quindi facendo clic su Avvia scansione. Quindi, nel software ATM, fare clic su Start, che avvia la raccolta di una serie di immagini con aumenti incrementali della posizione della fase di ritardo tra le posizioni di avvio e arresto selezionate. Quindi, prendi una serie temporale di immagini in diverse posizioni di fase di ritardo per generare una scansione iperspettrale.

Utilizzando l'unità analogica, inviare e ricevere segnali ttl da e verso il sistema SFTRU per sincronizzare l'acquisizione delle immagini e il movimento della fase di ritardo. Per passare dall'imaging nella regione vibrazionale CH alla regione vibrazionale dell'ammide I, modificare la lunghezza d'onda della pompa nel software laser da 802 nanometri a 898 nanometri. Inoltre, modificare l'impostazione di dispersione di Stokes nel software ATM da 30 millimetri a 5 millimetri.

Regolare la manopola inferiore sul supporto dello specchio per effettuare una piccola regolazione dello specchio nel percorso di dispersione del fascio della pompa all'interno della scatola SFTRU modificando l'angolo dello specchio con una quantità incrementale. Per convalidare la selettività chimica delle microsfere di polistirene, sono stati registrati lo scattering Raman stimolato iperspettrale e gli spettri Raman spontanei. Gli spettri erano identici tranne che per la differenza osservata nell'intensità relativa.

L'imaging di diffusione Raman stimolato delle cellule tumorali 4T1 è stato eseguito a 2.852, 2, 930 e 2.968 numeri d'onda, corrispondenti alla banda vibrazionale di allungamento carbonio-idrogeno di biomolecole di lipidi, proteine e DNA. L'imaging multimodale di cellule tumorali 4T1 dosate con nanoparticelle d'oro è stato eseguito per studiare le distribuzioni delle nanoparticelle nelle cellule tumorali. Le immagini di scattering Raman stimolate acquisite sono state ottenute per i canali CH2 e CH3, le sonde fluorescenti LysoTracker e il canale di diffusione Raman stimolato dalla risonanza.

La cosa più importante da ricordare è cambiare la regione vibrazionale, il riferimento della pompa, nel software laser e anche l'impostazione della dispersione di Stokes durante il protocollo. Questo sistema può essere facilmente commutato dalla regione a femtosecondi a quella a picosecondi senza influire sull'allineamento ottico. Questa capacità ci consente di eseguire spettroscopia di scattering Raman coerente multifotone e spettroscopia a sonda a pompa e le loro applicazioni.

Questa piattaforma di imaging multimodale fornisce nuove conoscenze sulla nanomedicina e apre la strada all'imaging molecolare di cellule, tessuti e nanoparticelle d'oro.