Name: Imaging biomolecolare dellassorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri l'imaging biomolecolare multimodale di nanoparticelle d'oro in cellule tumorali mediante microscopia ottica non lineare. Questa tecnica avanzata consente l'imaging iperspettrale rapido per studiare le strutture cellulari.

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Questa ricerca è stata sostenuta da EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) e CONTRAST facility (EP/S009957/1).

1. Accensione del sistema laser
<ol><li>Accendere il sistema di interblocco e selezionare il laser a braccio prima di avviare il sistema.</li>
	<li>Accendi il PC con il software per controllare il laser a femtosecondi a doppia uscita.</li>
	<li>Caricare il software per il laser a femtosecondi a doppia uscita; Questo software consente di accendere e spegnere il laser e controlla direttamente la lunghezza d'onda del fascio della pompa.</li>
	<li>Attiva l'emissione laser tenendo premuto l'icona di accensione per un conteggio di 3.</li>
	<li>Attendere che il laser si sia riscaldato e che la luce pronta per il laser si illumini di verde nel software.</li>
	<li>La lunghezza d'onda del fascio della pompa è controllata direttamente attraverso il software; Questo può variare da 680-1.300 nm. Per l'imaging cellulare nella regione vibrazionale Raman C-H, selezionare 802 nm.</li>
	<li>Aprire gli otturatori del fascio della pompa sintonizzabile e del fascio Stokes da 1.045 nm tenendo premute le immagini di apertura per 3 s. ATTENZIONE: Guida alla sicurezza del laser il laser a femtosecondi a doppia uscita è un laser pulsato a infrarossi di classe IV e può causare danni permanenti alla vista. Pertanto, tutte le regole locali di sicurezza laser devono essere seguite durante l'esecuzione di questa procedura: (i) Solo gli utenti autorizzati che hanno ricevuto una formazione sulla sicurezza laser possono eseguire la procedura. (ii) L'accesso al laboratorio avviene tramite accesso tramite carta magnetica con un interblocco sulla porta della stanza. (iii) Per la maggior parte dell'operazione, i raggi laser sono completamente chiusi. (iv) Quando il raggio laser è esposto, devono essere indossati occhiali di sicurezza laser (utilizzare gli occhiali di sicurezza laser LG9, che bloccano OD 7+ sia la pompa che i raggi Stokes).</li>
</ol>2. Accensione dell'unità di temporizzazione e ricombinazione della messa a fuoco spettrale (SF-TRU)
<ol><li>Caricare il software ATM sullo stesso PC con il software laser, che controlla gli stadi di ritardo e gli attenuatori laser nell'unità SF-TRU. NOTA: Questa unità è responsabile di assicurarsi che la pompa e le travi Stokes siano spazialmente sovrapposte, controllando la dispersione nella pompa e nelle travi Stokes e controllando il ritardo temporale tra la pompa e le travi Stokes. La polarizzazione dei raggi Stokes e della pompa è verticale. Si noti che ogni raggio è dotato di una piastra a mezza onda per controllare in modo indipendente le polarizzazioni prima di uscire dall'SF-TRU.</li>
	<li>Assicurarsi che sia la pompa che i laser Stokes siano attenuati al <10% (pompa) e al <15% (raggi Stokes). Se i raggi non vengono attenuati, la potenza del laser può causare danni al sistema e bruciare campioni biologici.</li>
	<li>Per l'imaging cellulare, impostare le impostazioni laser ottimali su 6% (pompa) e 10% (Stokes), corrispondenti a 12 mW e 30 mW sul campione.</li>
	<li>L'SF-TRU ha due impostazioni: modalità femtosecondi (fs) e modalità picosecondi (ps).</li>
	<li>Per la modalità fs, spingere le manopole su entrambi i lati della scatola (questo rimuove i reticoli di dispersione dal percorso del fascio).</li>
	<li>Per la modalità ps, estrarre le manopole su entrambi i lati della scatola (questo posiziona i reticoli di dispersione nel percorso del raggio).</li>
	<li>Per l'imaging iperspettrale, selezionare la modalità ps.</li>
	<li>Assicurarsi che la fase di ritardo sia nella posizione corretta affinché la pompa e i fasci di Stokes siano temporalmente sovrapposti per l'imaging C-H su questo sistema.</li>
	<li>Assicurarsi che le impostazioni di dispersione della pompa e del fascio Stokes siano corrette; per una pompa da 802 nm, questo è 5 mm per il raggio della pompa e 30 mm per il raggio Stokes.</li>
</ol>3. Modulazione del fascio di Stokes per l'imaging SRS
<ol><li>Per il rilevamento SRS, modulare l'intensità del fascio di Stokes.</li>
	<li>Accendere il generatore di segnali per la modulazione del fascio.</li>
	<li>Richiamare le impostazioni precedenti, che sono le seguenti: USCITA 1: Onda quadra: Frequenza = 19,5 MHz, Ampiezza = 1,4 V. USCITA 2: Onda quadra: Frequenza = 19,5 MHz, Ampiezza = 300 mV.</li>
	<li>Accendere le uscite 1 e 2.</li>
	<li>Collegare l'uscita 1 a un amplificatore per l'EOM nel box SF-TRU tramite un cavo BNC.</li>
	<li>Collegare l'uscita 2 all'amplificatore lock-in utilizzato per il rilevamento SRS tramite un cavo BNC.</li>
	<li>Accendere l'alimentazione all'amplificatore sul portale.</li>
</ol>4. Accensione dell'amplificatore lock-in
<ol><li>Per l'imaging SRS, utilizzare il modulo di rilevamento SRS che comprende un fotodiodo di grande area e un amplificatore lock-in appositamente costruito.</li>
	<li>Accendere l'alimentatore dell'amplificatore lock-in sul portale.</li>
	<li>Caricare il software per l'amplificatore lock-in "SRS detection Module" sul PC.</li>
	<li>Nel software, scegliere le seguenti impostazioni: Fase = 0°, Offset = -80 mW, Guadagno = 58 dB.</li>
	<li>Selezionare la costante di tempo di integrazione dell'amplificatore lock-in nel software: per l'imaging cellulare la costante di tempo di 2 μs fornisce immagini di buona qualità.</li>
</ol>5. Funzionamento sul microscopio a scansione laser
<ol><li>Accendere le spine di tutte le apparecchiature tranne la scatola del telecomando. Attendere che lo standby sia acceso sulla scatola di controllo situata nella parte superiore del portale.</li>
	<li>Accendere la scatola del telecomando sul portale e accendere il retro della scatola. Attendere che la spia del telecomando diventi blu (sulla casella di controllo) e premere Avvia operazione.</li>
	<li>Accendere il PC del microscopio a scansione laser.</li>
	<li>Eseguire il software del microscopio confocale.</li>
	<li>Controllare il percorso della luce del microscopio tramite il software del computer. NOTA: Sono state apportate alcune modifiche al microscopio per renderlo adatto all'imaging SRS: (i) Nel percorso del fascio, è stato aggiunto un passaggio corto di 775 nm alla ruota portafiltri in cui i raggi laser entrano nell'unità di scansione, questo può essere selezionato nella scheda Lightpath nel software del computer. (ii) Invece di utilizzare i PMT integrati del microscopio confocale per il rilevamento, è stato aggiunto un rilevatore su misura al percorso della luce trasmessa, che consente sia il rilevamento SRS che CARS. (iii) Le uscite di questi rivelatori sono collegate alla scatola analogica sul portale. Il segnale CARS dal PMT è collegato tramite un cavo BNC al CD1 e il segnale SRS dall'amplificatore lock-in è collegato tramite un cavo BNC al CD2.</li>
	<li>Controlla la messa a fuoco attraverso il touch screen o le manopole del telecomando o il software del computer.</li>
	<li>Selezionare le impostazioni dell'immagine desiderate nel software; Ciò include lo zoom, la dimensione dell'immagine in pixel e il tempo di permanenza dei pixel.</li>
	<li>Assicurarsi che la velocità di imaging (tempo di permanenza dei pixel) sia maggiore del tempo di integrazione impostato nel software dell'amplificatore lock-in. NOTA: per l'imaging è stato utilizzato un obiettivo di immersione in acqua NA 1.2.</li>
</ol>6. Montare un campione nella fase del microscopio
<ol><li>Preparare i campioni di cellule per l'imaging come segue.<ol><li>Cellule di carcinoma mammario di topo 4T1 in RPMI-1640 integrate con siero bovino fetale al 10% (FBS). Cambiare il mezzo ogni 2 giorni e far passare le celle al 70% -80% di confluenza. NOTA: I passaggi 8–10 sono stati utilizzati nel corso degli esperimenti qui descritti.</li>
		<li>Per gli esperimenti di imaging, incubare 1 x 10 5 cellule su vetrini quadrati per 24 ore a 37 °C,5 % CO2. Quindi, lavare le cellule con soluzione salina tamponata fosfato preriscaldata (PBS) e incubare con nanoparticelle d'oro (diluizione 1:100 in terreno di coltura cellulare, concentrazione di stock: 2,3 x 10 10 particelle / ml, diametro:60 nm) per 4 ore.</li>
		<li>Prima dell'imaging, lavare le cellule con PBS ghiacciato e fissarle con paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare le celle con PBS 3x, quindi montare tra due vetrini per l'imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare una goccia di acqua distillata sopra l'obiettivo di immersione in acqua che focalizza i raggi laser nel campione tra l'obiettivo e il campione. Quindi, posizionare il campione sul palco del microscopio.</li>
	<li>Un condensatore con NA 1.4 raccoglie la luce propagata in avanti. Applicare una goccia d'acqua tra il condensatore e il campione per l'imaging. Regolare l'altezza del condensatore a circa 1 mm sopra il campione per raccogliere la quantità massima di luce.</li>
	<li>Il rilevatore SRS si trova su un supporto mobile, che consente di scorrere dentro e fuori dal percorso ottico di raccolta. Per mettere a fuoco il campione utilizzando la luce bianca, spostare il rilevatore SRS fuori dal percorso del fascio.</li>
	<li>Riposizionare il rilevatore nel percorso del fascio, pronto per l'imaging SRS.</li>
</ol>7. Cambiare lo spostamento Raman e raccogliere uno stack di dati iperspettrali
NOTA: Lo spostamento Raman in cui avviene l'imaging dipende dalla posizione dello stadio di ritardo nella scatola SF-TRU e dalla lunghezza d'onda del fascio della pompa dal sistema laser.
<ol><li>Per grandi cambiamenti nello spostamento Raman, modificare la lunghezza d'onda del laser. Ad esempio, per l'imaging di vibrazioni CH tra 2.800-3.100 cm-1, selezionare 802 nm, mentre, per l'imaging di circa 1.600 cm-1 per il picco di ammide I, selezionare il fascio della pompa a 898 nm. Regolalo tramite il software.</li>
	<li>Per ottenere piccole regolazioni nello spostamento Raman, scansionare la fase di ritardo nell'unità SF-TRU.</li>
	<li>L'FF-TRU fornisce posizioni di stadio di ritardo in millimetri (mm). Per convertire la posizione dello stadio di ritardo da mm a cm-1, eseguire la scansione iperspettrale di calibrazione utilizzando un campione di perle di polistirene e confrontare le posizioni di picco trovate nella scansione di calibrazione con quelle prese su una configurazione Raman spontanea. Ciò fornirà un'equazione lineare, che converte la posizione dello stadio di ritardo in mm allo spostamento Raman in cm-1.</li>
	<li>Per generare una scansione iperspettrale, prendi una serie temporale di immagini in diverse posizioni di fase di ritardo.</li>
	<li>Per sincronizzare l'acquisizione delle immagini e il movimento dello stadio di ritardo, utilizzare l'unità analogica per inviare e ricevere segnali TTL da e verso il sistema SF-TRU. NOTA: Per fare ciò, la scatola analogica ha le seguenti connessioni: (i) TRIG OUT VD1 - questo è collegato all'SF-TRU tramite un BNC e invia un segnale TTL per indicare allo stadio di ritardo di spostarsi con incremento di +1. (ii) TRIG In 1 - qui, un segnale viene ricevuto tramite BNC quando la fase di ritardo ha terminato il suo movimento, e questo viene utilizzato per attivare l'immagine successiva nella serie temporale.</li>
	<li>Per il set di dati iperspettrali, selezionare le seguenti impostazioni nel software del microscopio confocale:<ol><li>Nella scheda Trigger, selezionare Avvia tramite trigger TTL (ON) e Trigger (ogni fotogramma).</li>
		<li>Nella scheda Serie, impostare la serie temporale ON e la serie z OFF.</li>
		<li>Impostare il numero di fotogrammi nella serie temporale in modo che corrisponda al numero di passaggi nel software ATM (qui vengono utilizzati 101 passi).</li>
	</ol></li>
	<li>Nel software ATM, vai alla scheda Esegui .<ol><li>Impostare le posizioni dello stadio di ritardo in millimetri per l'inizio e l'arresto della scansione iperspettrale. Per la regione CH ad alto numero d'onda, utilizzare la posizione iniziale = 90,25 mm e la posizione di arresto = 92,25 mm.</li>
		<li>Assicurarsi che il numero di passaggi corrisponda al numero di fotogrammi nel software del microscopio confocale.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo aver controllato le impostazioni corrette, avviare prima lo stack iperspettrale nel software del microscopio confocale. Vai su Acquisisci e fai clic su Avvia scansione. Quindi, nel software ATM, fare clic su Start. Questo avvia la raccolta di una serie di immagini, con aumenti incrementali della posizione della fase di ritardo tra le posizioni di inizio e arresto selezionate.</li>
	<li>Esportare la serie di immagini iperspettrali come file .tif multi-frame e utilizzare un pacchetto software adatto per eseguire la calibrazione.</li>
	<li>Una volta completata la calibrazione, utilizzare l'equazione di calibrazione lineare per convertire la posizione dello stadio di ritardo negli spostamenti Raman.</li>
	<li>Per passare dall'imaging nella regione vibrazionale CH (2.800-3.100 cm-1) alla regione vibrazionale ammide I 1.500-1.700 cm-1), procedi come segue.<ol><li>Modificare la lunghezza d'onda della pompa nel software laser da 802 nm a 898 nm.</li>
		<li>Modificare l'impostazione di dispersione di Stokes nel software ATM da 30 mm a 5 mm.</li>
		<li>Effettuare una piccola regolazione allo specchio nel percorso di dispersione del fascio della pompa all'interno della scatola SF-TRU. Questo viene fatto regolando la manopola inferiore sul supporto dello specchio, che cambia l'angolo dello specchio di una quantità incrementale.</li>
		<li>Quando si esegue una scansione iperspettrale sulla regione ammide I, impostare le posizioni di avvio e arresto nel software ATM rispettivamente su 89 e 91 mm. ATTENZIONE: Gli occhiali di sicurezza laser devono essere indossati per questa fase poiché il raggio laser sarà esposto.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Questo studio ha presentato la combinazione del modulo SF-TRU e del sistema laser ultraveloce a doppia uscita che ha dimostrato le sue applicazioni per la microspettroscopia multimodale. Con la sua capacità di studiare l'assorbimento delle nanoparticelle d'oro (AuNP) da parte delle cellule tumorali, la piattaforma di imaging multimodale può visualizzare le risposte cellulari ai trattamenti antitumorali ipertermici quando i raggi laser vengono assorbiti dagli AuNP.
Inoltre, l'imaging rapido chi...

Le nanoparticelle d'oro (AuNP) hanno mostrato un grande potenziale come sonde di imaging biocompatibili, ad esempio, come substrati efficaci della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS) in varie applicazioni biomediche. Le principali applicazioni includono campi come il biorilevamento, il bioimaging, le spettroscopie potenziate dalla superficie e la terapia fototermica per il trattamento del cancro1. Inoltre, sondare le AuNP nei sistemi viventi è fondamentale per valutare e comprendere l'interazione tra AuNP e sistemi biologici. Esistono varie tecniche analitiche, tra cui la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier(FTIR) 2, la spettrometria di massa accoppiata induttivamente per ablazione laser (LA-ICP-MS)3 e la risonanza magnetica (MRI)4 che sono state utilizzate con successo per studiare la distribuzione delle AuNP nei tessuti. Tuttavia, questi metodi soffrono di diversi inconvenienti, come il tempo richiesto e la preparazione di campioni complessi3, che richiedono lunghi tempi di acquisizione o la mancanza di una risoluzione spaziale inferiore al micron 2,4.
Rispetto alle tecniche di imaging convenzionali, la microscopia ottica non lineare offre diversi vantaggi per sondare cellule vive e AuNP: la microscopia ottica non lineare raggiunge una profondità di imaging più profonda e fornisce funzionalità di sezionamento ottico 3D intrinseco con l'uso di laser ultraveloci vicino all'IR. Con il significativo miglioramento della velocità di imaging e della sensibilità di rilevamento, è stata dimostrata la microscopia a fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF)5,6,7 e la microscopia di seconda generazione armonica (SHG)8,9,10 per migliorare ulteriormente l'imaging non invasivo delle biomolecole endogene nelle cellule e nei tessuti viventi. Inoltre, utilizzando nuove tecniche ottiche non lineari pompa-sonda come l'assorbimento transitorio (TA)11,12,13,14 e lo scattering Raman stimolato (SRS)15,16,17,18, è possibile derivare il contrasto biochimico label-free delle strutture cellulari e delle AuNP. La visualizzazione di AuNP senza l'uso di etichette estrinseche è di grande importanza poiché le perturbazioni chimiche delle nanoparticelle modificheranno le loro proprietà fisiche e quindi il loro assorbimento nelle cellule.
Questo protocollo presenta l'implementazione di un modulo SF-TRU (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) per un laser a impulsi a doppia lunghezza d'onda, che consente l'imaging multimodale rapido di AuNP e cellule tumorali. Questo lavoro mira a dimostrare i dettagli delle tecniche integrate TPEF, TA e SRS su un microscopio a scansione laser.

<table><tbody><tr><td>Unità di rilevamento APE SRS</td><td>APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)</td><td>APE Lock-in Module</td><td>Sistema combinato contenente un fotodiodo Si di ampia area per il rilevamento del fascio della pompa insieme a un amplificatore Lock-In per il rilevamento delle modulazioni del fascio</td></tr><tr><td>Unità di scansione confocale</td><td>Olympus</td><td>FV 3000</td><td>Unità di scansione confocale utilizzata per l'imaging</td></tr><tr><td>di perline di lattice CML, 4% p/v, 1,0 e micro; m</td><td>Invitrogen</td><td>C37483</td><td>Microsfere di polistirene</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Thorlabs</td><td>CG15CH2</td><td>22 mm x 22 mm vetrini coprioggetti per cellule di semina</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Siero bovino fetale (inattivato a caldo)</td></tr><tr><td>Flouview</td><td>Olympus</td><td>FV31S-SW</td><td>Software di controllo del microscopio a scansione laser</td></tr><tr><td>Generatore di funzioni</td><td>BX precision</td><td>40543</td><td>Utilizzato per generare una funzione d'onda quadra che viene alimentata all'EOM in SF-TRU per produrre modulazioni nel fascio di colpi</td></tr><tr><td>Nanoparticelle d'oro</td><td>Nanopartz</td><td>A11-60</td><td>Nanoparticelle d'oro sferiche, diametro 60 nm</td></tr><tr><td>Interfaccia di ingresso e uscita</td><td>Olympus</td><td>FV30 ANALOG</td><td>Questa unità consente di inserire le letture di tensione da PMT e LockIn nel software di scansione confocale e consente l'invio di impulsi di temporizzazione tra il microscopio olympus e l'SF-TRU unità.</td></tr><tr><td>InSight X3</td><td>Newport</td><td>Spectra-Physics</td><td>Laser pulsato a femtosecondi a doppia uscita. Accordabile (680&ndash; 1300 nm) e fisse (1045 nm) con frequenza di ripetizione di 80 MHz.</td></tr><tr><td>Cornice del microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td>Microscopio invertito</td></tr><tr><td>Cellule di topo 4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td>Cellule di cancro al seno di topo</td></tr><tr><td>NA 1.2 Obiettivo ad immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW/IR</td><td>L'obiettivo multifotone 60x ha una distanza di lavoro di 0,28 mm. Altri obiettivi simili possono essere utilizzati.</td></tr><tr><td>NA 1.4 Condensatore</td><td>Nikon</td><td>CSC1003</td><td>Possono essere utilizzati anche altri condensatori con NA superiore all'obiettivo di eccitazione.</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td>PMT utilizzato per il rilevamento di foto anti-colpi per CARS micrsocopy</td></tr><tr><td>Connettore PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>C13654-01-Y002</td><td>per alimentatore PMT</td></tr><tr><td></td><td>RS</td><td>RSPD-3303 C</td><td>Alimentatore programmabile che viene utilizzato per fornire la tensione corretta al PMT</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>Da allora il Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium è stato trovato adatto per una varietà di cellule di mammifero.</td></tr><tr><td>SF-TRU</td><td>Newport Spectra Physics</td><td>Sistema SF-TRU</td><td>progettato per il controllo del ritardo e della dispersione delle 2 uscite laser e per l'esecuzione delle modulazioni del fascio richieste per SRS</td></tr></tbody></table>

imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale

Biomolecular Imaging of Cellular Uptake of Nanoparticles using Multimodal Nonlinear Optical Microscopy

Sondare le nanoparticelle d'oro (AuNP) nei sistemi viventi è essenziale per rivelare l'interazione tra AuNP e tessuti biologici. Inoltre, integrando segnali ottici non lineari come lo scattering Raman stimolato (SRS), la fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF) e l'assorbimento transitorio (TA) in una piattaforma di imaging, può essere utilizzato per rivelare il contrasto biomolecolare delle strutture cellulari e delle AuNP in modo multimodale. Questo articolo presenta una microscopia ottica non lineare multimodale e la applica per eseguire immagini chimicamente specifiche di AuNP nelle cellule tumorali. Questa piattaforma di imaging fornisce un nuovo approccio per sviluppare AuNP funzionalizzate più efficienti e determinare se si trovano all'interno di vascolarature che circondano il tumore, gli spazi pericellulari o cellulari.

Il modulo Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) viene introdotto tra il laser a femtosecondi a doppia uscita e il microscopio a scansione laser modificato. Il sistema laser ultraveloce sintonizzabile utilizzato in questo studio ha due porte di uscita che forniscono un fascio a una lunghezza d'onda fissa di 1.045 nm e l'altro fascio sintonizzabile nell'intervallo 680-1.300 nm. Uno schema dettagliato del modulo SF-TRU e della piattaforma di imaging multimodale è illustrato nella Figu...

Questo articolo presenta l'integrazione di un modulo di messa a fuoco spettrale e di un laser a impulsi a doppia uscita, che consente una rapida imaging iperspettrale di nanoparticelle d'oro e cellule tumorali. Questo lavoro mira a dimostrare i dettagli delle tecniche ottiche non lineari multimodali su un microscopio a scansione laser standard.

Imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale

Probing gold nanoparticles (AuNPs) in living systems is essential to reveal the interaction between AuNPs and biological tissues. Moreover, by integrating ...

Il nostro protocollo presenta una microscopia ottica multimodale, non lineare, e la applica per eseguire l'imaging chimicamente specifico delle nanoparticelle d'oro nelle cellule tumorali. Il vantaggio principale del nostro sistema di imaging è che può essere utilizzato per rivedere il contrasto biomolecolare delle strutture cellulari e delle nanoparticelle d'oro in modo multimodale. Per iniziare, accendere le spine di tutte le apparecchiature, tranne la scatola del telecomando.Quindi, accendere il retro della scatola e premere Avvia operazione dopo che la luce del telecomando diventa blu sulla scatola di controllo. Successivamente, accendere il PC del microscopio a scansione laser ed eseguire il software del microscopio confocale. Quindi, controllare il percorso della luce del microscopio utilizzando il software del computer e controllare la messa a fuoco attraverso il touch screen o le manopole del telecomando o il software del computer.Selezionare le impostazioni dell'immagine desiderate nel software, tra cui Zoom, Dimensioni immagine in pixel e Tempo di permanenza pixel, assicurandosi che il tempo di permanenza dei pixel sia maggiore del tempo di integrazione. Posizionare una goccia di acqua distillata sopra l'obiettivo di immersione in acqua che focalizza i raggi laser nel campione e tra il condensatore e il campione per l'imaging. Quindi, regolare l'altezza del condensatore a circa un millimetro sopra il campione per raccogliere la quantità massima di luce e spostare il rilevatore SRS posizionato su un supporto mobile fuori dal percorso del fascio per concentrarsi sul campione utilizzando la luce bianca.Utilizzando le impostazioni del software, selezionare il fascio della pompa e modificare la lunghezza d'onda del laser a 802 nanometri per le vibrazioni CH e 898 nanometri per il picco dell'ammide I, tenendo conto dei grandi cambiamenti nello spostamento Raman. Per ottenere piccoli aggiustamenti nello spostamento Raman, scansionare la fase di ritardo nell'unità SFTRU come descritto nel manoscritto. Per il set di dati iperspettrali, selezionare la scheda Trigger, fare clic su Start by ttl trigger on, quindi selezionare Trigger every frame.Quindi, nella scheda Serie, impostare la serie temporale su e la serie Z disattivata. Inoltre, impostare il numero di fotogrammi nella serie temporale in modo che corrisponda al numero di passaggi nel software ATM. Successivamente, vai alla scheda Esegui nel software ATM e imposta le posizioni dello stadio di ritardo per CH a 90,25 e 92,25, mentre per la regione ammide I a 89 e 91 in millimetri, corrispondenti alla posizione di inizio e arresto della scansione iperspettrale, assicurandoti che il numero di passi corrisponda al numero di fotogrammi nel software del computer.Dopo aver controllato le impostazioni corrette, avviare lo stack iperspettrale nel software del computer andando prima su Acquisisci e quindi facendo clic su Avvia scansione. Quindi, nel software ATM, fare clic su Start, che avvia la raccolta di una serie di immagini con aumenti incrementali della posizione della fase di ritardo tra le posizioni di avvio e arresto selezionate. Quindi, prendi una serie temporale di immagini in diverse posizioni di fase di ritardo per generare una scansione iperspettrale.Utilizzando l'unità analogica, inviare e ricevere segnali ttl da e verso il sistema SFTRU per sincronizzare l'acquisizione delle immagini e il movimento della fase di ritardo. Per passare dall'imaging nella regione vibrazionale CH alla regione vibrazionale dell'ammide I, modificare la lunghezza d'onda della pompa nel software laser da 802 nanometri a 898 nanometri. Inoltre, modificare l'impostazione di dispersione di Stokes nel software ATM da 30 millimetri a 5 millimetri.Regolare la manopola inferiore sul supporto dello specchio per effettuare una piccola regolazione dello specchio nel percorso di dispersione del fascio della pompa all'interno della scatola SFTRU modificando l'angolo dello specchio con una quantità incrementale. Per convalidare la selettività chimica delle microsfere di polistirene, sono stati registrati lo scattering Raman stimolato iperspettrale e gli spettri Raman spontanei. Gli spettri erano identici tranne che per la differenza osservata nell'intensità relativa.L'imaging di diffusione Raman stimolato delle cellule tumorali 4T1 è stato eseguito a 2.852, 2, 930 e 2.968 numeri d'onda, corrispondenti alla banda vibrazionale di allungamento carbonio-idrogeno di biomolecole di lipidi, proteine e DNA. L'imaging multimodale di cellule tumorali 4T1 dosate con nanoparticelle d'oro è stato eseguito per studiare le distribuzioni delle nanoparticelle nelle cellule tumorali. Le immagini di scattering Raman stimolate acquisite sono state ottenute per i canali CH2 e CH3, le sonde fluorescenti LysoTracker e il canale di diffusione Raman stimolato dalla risonanza.La cosa più importante da ricordare è cambiare la regione vibrazionale, il riferimento della pompa, nel software laser e anche l'impostazione della dispersione di Stokes durante il protocollo. Questo sistema può essere facilmente commutato dalla regione a femtosecondi a quella a picosecondi senza influire sull'allineamento ottico. Questa capacità ci consente di eseguire spettroscopia di scattering Raman coerente multifotone e spettroscopia a sonda a pompa e le loro applicazioni.Questa piattaforma di imaging multimodale fornisce nuove conoscenze sulla nanomedicina e apre la strada all'imaging molecolare di cellule, tessuti e nanoparticelle d'oro.

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Scopri l'imaging biomolecolare multimodale di nanoparticelle d'oro in cellule tumorali mediante microscopia ottica non lineare. Questa tecnica avanzata consente l'imaging iperspettrale rapido per studiare le strutture cellulari.

Imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale

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