Name: Impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Impara l'impianto ecoguidato di cardiomiociti derivati da iPS umane per la riparazione del miocardio infartuato nei topi. Questa tecnica percutanea offre un approccio meno invasivo e sicuro per la terapia cellulare cardiaca.

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Questo lavoro è stato supportato dal Grande Piano di Ricerca della National Natural Science Foundation of China (No. 91539111to JY), Key Project of Science and Technology of Hunan Province (No. 2020SK53420 to JY) e The Science and Technology Innovation Program of Hunan Province (2021RC2106 to CF).

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<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873(2021).</li>
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<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li>
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<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi critiche di questo studio includono la coltura di hiPSC, la differenziazione dei cardiomiociti, la purificazione di hiPSC-CM e il trapianto di hiPSC-CM nel sito di infarto miocardico del topo. La chiave è utilizzare l'ecografia cardiaca per guidare transcutaneamente il trattamento verso il sito dell'infarto ai margini dell'infarto in cui sono stati iniettati gli hiPSC-CM nell'area.
Con il prolungamento del tempo di coltura, il fenotipo hiPSC-CM cambia nella morfologia (dimensioni cellu...

Quando si verifica un'infarto miocardica acuta, le cellule del miocardio nell'area infartuata muoiono rapidamente a causa di ischemia e ipossia. Diversi fattori infiammatori vengono rilasciati dopo la morte e la rottura delle cellule, mentre le cellule infiammatorie si infiltrano nel sito infartuato per causare infiammazione1. Significativamente, i fibroblasti e il collagene, entrambi senza contrattilità e conduttività elettrica, sostituiscono le cellule miocardiche nel sito infartuato per formare tessuto cicatriziale. A causa della limitata capacità di rigenerazione dei cardiomiociti nei mammiferi adulti, il tessuto vitale formato dopo una vasta area di infarto di solito non è adeguato per mantenere una gittata cardiaca sufficiente2. L'infarto miocardico causa insufficienza cardiaca e, nei casi gravi di insufficienza cardiaca, i pazienti possono fare affidamento solo su trapianti di cuore o dispositivi di assistenza ventricolare per mantenere le normali funzioni cardiache 3,4.
Dopo l'infarto miocardico, la strategia di trattamento ideale è quella di sostituire i cardiomiociti morti con cardiomiociti di nuova formazione, formando accoppiamenti elettromeccanici con tessuti sani. Tuttavia, le opzioni di trattamento hanno tipicamente adottato il salvataggio miocardico piuttosto che la sostituzione. Attualmente, le terapie basate su cellule staminali e cellule progenitrici sono tra le strategie più promettenti per promuovere la riparazione miocardica dopo l'MI5. Tuttavia, il trapianto di queste cellule ha diversi problemi, in primo luogo l'incapacità delle cellule staminali adulte di differenziarsi in cardiomiociti e la loro breve durata di vita6.
Le questioni etiche relative all'uso di cellule staminali embrionali (ES) possono essere aggirate dalle iPSC, che sono una fonte promettente di cellule. Inoltre, le iPSC possiedono forti capacità di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in cardiomiociti7. Gli studi hanno dimostrato che le hiPSC-CM trapiantate nel sito MI possono sopravvivere e formare giunzioni gap con le cellule ospiti 8,9. Tuttavia, poiché queste cellule trapiantate si trovano nel microambiente di ischemia e infiammazione, il loro tasso di sopravvivenza è estremamente basso10,11.
Sono stati stabiliti diversi metodi per migliorare il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate, come il pretrattamento con ipossia e shock termico delle cellule trapiantate12,13, la modificazione genetica 14,15 e il trapianto simultaneo di cellule e capillari 16. Sfortunatamente, la maggior parte dei metodi sono limitati dalla complessità e dai costi elevati. Quindi, il presente studio propone un metodo di somministrazione hiPSC-CM riproducibile, conveniente, relativamente invasivo ed efficace.
L'iniezione di cellule intramiocardiche guidata da ultrasuoni può essere eseguita solo con una piccola ecografia veterinaria ad alta risoluzione e un microiniettore, indipendentemente dal sito. Sotto la guida ecografica, la consegna diretta delle cellule sotto il processo xifoideo dal pericardio al miocardio nei topi è un protocollo sicuro che evita danni al fegato e ai polmoni. Questo metodo può essere combinato contemporaneamente ad altre tecnologie per migliorare significativamente il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpo</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardiaca T</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150110</td><td></td></tr><tr><td>Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150062</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardiaca umana T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Isolectina B4</td><td>Vettore</td><td>FL-1201</td><td></td></tr><tr><td>Alfa actina sarcomerica</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Agglutinina del germe di grano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di B27 (meno insulina)</td><td>Thermo Fisher Scientific A1895601</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Integratore di B27 (senza siero)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17... 504-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Bouin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SDHT10132</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>ciclosporina A</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-B0579</td><td></td></tr><tr><td>ROSSO DIRETTO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>365548-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood e Kit Tessuto</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>FAST GREEN FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Senza glucosio RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific 11879020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>acido lattico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356234</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green MasterMix kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Thermo Fisher Scientific 11875119</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdif Terreno di congelamento dei cardiomiociti/STEMdiff</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Terreno di supporto per cardiomiociti</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr> agente <tr><td>di accoppiamento ad ultrasuoni</td><td>CARENT</td><td>22396269389</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature e forniture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 </td> Criostato PCR <td></td>in tempo reale</tr><tr><td></td><td>Microscopio a</td> fluorescenza Leica <td>CM1950</td><td></td></tr> Forbici anatomiche fini <tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>pinza da dissezione fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Micro siringa</td><td>Hamilton</td><td>7633</td><td></td></tr><tr><td>Piccolo animale macchina per anestesia</td><td>MATRX</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ecografico ad altissima risoluzione per piccoli animali</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistical Product and Service Solutions</td><td>IBM</td><td>21</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>1.48</td><td></td></tr><tr><td>Mitocondriale umano Primer di DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>la sequenza di primer diretta</td><td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>la sequenza di primer inversa</td><td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

L'obiettivo chiave della terapia cellulare dopo infarto miocardico (IM) è quello di migliorare efficacemente il tasso di innesto cellulare e i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CM) sono una fonte cellulare promettente per la riparazione cardiaca dopo danno ischemico. Tuttavia, un basso tasso di innesto è un ostacolo significativo per un'efficace rigenerazione del tessuto cardiaco dopo il trapianto. Questo protocollo mostra che più iniezioni percutanee guidate da ultrasuoni hiPSC-CM in un'area MI aumentano efficacemente i tassi di trapianto cellulare. Lo studio descrive anche l'intero processo di coltura hiPSC-CM, il pretrattamento e i metodi di somministrazione percutanea ecoguidati. Inoltre, l'uso del DNA mitocondriale umano aiuta a rilevare l'assenza di hiPSC-CM in altri organi del topo. Infine, questo articolo descrive i cambiamenti nella funzione cardiaca, nell'angiogenesi, nelle dimensioni delle cellule e nell'apoptosi nella zona di confine infartuato nei topi 4 settimane dopo il parto cellulare. Si può concludere che l'iniezione percutanea guidata dall'ecocardiografia del miocardio ventricolare sinistro è una terapia cellulare fattibile, relativamente invasiva, soddisfacente, ripetibile ed efficace.

L'ecocardiografia per la valutazione della funzione ventricolare sinistra dei topi in ciascun gruppo ha rivelato che le lesioni dell'infarto miocardico erano effettivamente invertite nel gruppo MD (Figura 2A). Rispetto al gruppo MI (MI), il gruppo SD ha mostrato un aumento della frazione di eiezione (EF) (dal 30% al 35%; Figura 2B) e accorciamento frazionario (FS) (dal 18% al 22%; Figura 2C) dopo MI. Tuttavia, è ancora più cruciale ...

La somministrazione cellulare guidata da ultrasuoni intorno al sito di infarto miocardico nei topi è un modo sicuro, efficace e conveniente di trapianto cellulare.

Impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Questo è il primo rapporto che dimostra che l'iniezione intramiocardica percutanea guidata dall'ecocardiografia dei cardiomiociti migliora significativamente la proprietà riparativa dei cardiomiociti umani derivati da iPS. Questo metodo è fattibile, soddisfacente, ripetibile, meno invasivo ed efficace procedura per la somministrazione di cardiomiociti umani derivati da iPS. Riteniamo che la somministrazione intramiocardica percutanea sia un metodo sicuro ed efficiente per la somministrazione locale di farmaci per malattie tra cui cardiopatia ischemica, infarto miocardico e insufficienza cardiaca.Questo progetto è supervisionato dal professor Jinfu Yang e dal professor Jun Peng. A dimostrare la procedura saranno Xun Wu, Kele Qin e Kun Xiang, MD PhDs dal mio laboratorio e Di Wang, un dottorato di ricerca dal laboratorio chiave provinciale di Hunan di ricerca cardiovascolare. Per iniziare, aspirare sottovuoto il surnatante di coltura da una coltura di 60 giorni di hiPSC-CMs.Lavare le cellule con PBS tre volte. Quindi dissociare gli hiPSC-CM in singole cellule usando la miscela enzimatica di distacco cellulare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Raccogliere le celle in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI più B27 mezzo e mescolare.Contare le celle e calcolare il numero totale di celle. Centrifugare la sospensione cellulare a 300G per due minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel mezzo di supporto dei cardiomiociti ad una concentrazione di 6 x 10 delle 4 cellule per microlitro.Posizionare il tubo a 37 gradi Celsius fino alla fase di iniezione. Dopo che il mouse è sufficientemente anestetizzato, fissare gli arti e la coda con del nastro adesivo. Quindi, fissare gli incisivi del mouse con un filo di seta 2/0 e del nastro adesivo.Sterilizzare il collo mediano e il torace sinistro con tre cicli alternati di betaina seguiti da alcol. Fai un'incisione mediana del collo usando forbici anatomiche sottili e pinze da dissezione fine. Tagliare alcuni muscoli cervicali anteriori per stabilizzare ed esporre completamente la trachea.Inserire un ago per puntura del catetere di calibro 20 come tubo tracheale attraverso la bocca. Collegare il tubo tracheale al ventilatore e controllare il movimento toracico per assicurarsi che entrambi i polmoni siano ben ventilati. Regola i parametri respiratori.Quindi, rifissare l'arto posteriore sinistro sul lato inferiore destro e allentare il nastro attorno all'arto superiore sinistro. Con sottili forbici e pinze da dissezione, eseguire una toracotomia nello spazio intercostale da tre a quattro del torace sinistro. Usando una pinza, staccare il pericardio e individuare l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra.Utilizzare un filo di seta 6/0 per legare l'estremità prossimale dell'arteria. Per garantire che il modello di infarto miocardico acuto sia stabilito, attendere che il lato distale dell'arteria nel sito di legatura cambi da rosso a bianco. Chiudere il torace strato per strato e suturare la pelle con filo 4/0.Per il gruppo fittizio di animali, eseguire tutte le procedure chirurgiche ad eccezione della legatura. Nelle prime due settimane dopo l'infarto miocardico, posizionare i topi in una scatola per anestesia collegata con isofluorano al 5% ed eseguire l'intubazione tracheale. Tre giorni prima della somministrazione di hiPSC-CMs, iniettare ciclosporina A nella cavità intraperitoneale alla dose di 10 milligrammi per chilogrammo al giorno.Rimuovere i peli dal petto e dall'addome superiore del topo con crema depilatoria. Inalazione di alimentazione isofluorano fino a quando la frequenza cardiaca è mantenuta a 400 a 500 battiti al minuto. Fissare gli arti e la coda del mouse con del nastro adesivo sulla console di rilevamento e impostare la temperatura della piattaforma a 37 gradi Celsius.Applicare la gelatina ad ultrasuoni sulla parte superiore dell'addome. Utilizzando una sonda ecografica veterinaria ad alta risoluzione, ottenere immagini del fegato del topo. Utilizzando una micro siringa da cinque microlitri, aspirare circa 3 x 10 al 5 ° hiPSC-CMs.Tenere la siringa e inserire un ago da tre millimetri nel processo paraxifoideo sinistro. Sotto guida ecografica, seguire il bordo superiore del diaframma. Osservare il ritmo respiratorio e la gamma.Entra nel pericardio alla fine del cerchio espiratorio, evitando danni al fegato e ai polmoni. Quindi acquisire l'immagine dell'asse lungo parasternale del cuore del topo mediante ecocardiografia in modalità B. Sotto guida ultrasonica, iniettare 1 x 10 alle cellule 5th hiPSC-CMs in ciascuna delle tre aree marginali del sito di infarto.Rimuovere la sonda ad ultrasuoni e risciacquare la gelatina. Svezzare il topo dall'anestesia e riportarlo nella sua gabbia. Iniettare ciclosporina A continuamente per un mese dopo il trapianto.L'ecocardiogramma del ventricolo sinistro ha mostrato che le lesioni dovute all'infarto miocardico sono state invertite nel gruppo a dosi multiple. Il trapianto di hiPSC-CMs ha anche comportato un aumento della frazione di eiezione e un accorciamento della frazione. La misurazione dei parametri cardiaci utilizzando la colorazione Sirius Red e Fast Green ha mostrato che la dimensione dell'infarto e la frazione di volume del collagene sono diminuite, mentre lo spessore della parete anteriore ventricolare sinistra è aumentato dopo il trapianto.L'etichettatura per l'alfa actina non specifica in verde, DAPI in blu e troponina T specifica per l'uomo in rosso ha mostrato la presenza di cellule trapiantate nell'infarto e nell'area marginale dell'infarto. Il numero e la percentuale di cellule trapiantate erano più alti nel gruppo a dose multipla rispetto alla dose singola. 28 giorni dopo l'infarto miocardico, il gruppo a dosi multiple ha mostrato un aumento del numero di cellule che esprimono il marcatore delle cellule endoteliali, I-B4.L'agglutinina del germe di grano e la colorazione dell'alfa actinina sarcomerica sui cardiomiociti hanno mostrato una riduzione del diametro minimo della fibra. Un numero inferiore di nuclei di cardiomiociti positivi al tunnel nel gruppo a dose multipla ha indicato una riduzione dell'apoptosi. L'analisi PCR ha rilevato il DNA mitocondriale umano solo nel cuore, mostrando un trapianto specifico.Quando si inserisce l'ago, assicurarsi che entri nella cavità pericardica insieme al margine superiore del diaframma e alla fine del cerchio espiratorio per evitare lesioni al fegato o al polmone.

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