Name: Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dellepitelio pigmentato retinico zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Scopri l'ablazione genetica dell'epitelio pigmentato retinico in zebrafish transgenici con metronidazolo e la piattaforma MATLAB RpEGEN per quantificare la rigenerazione. Questo metodo consente di studiare le vie di segnale pro-rigenerative.

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Il lavoro qui descritto è stato supportato dal National Institutes of Health (RO1-EY29410 a J.M.G e NIH CORE Grant P30-EY08098 al Dipartimento di Oftalmologia); il Centro Immunotrapianto e Terapia UPMC (a L.L.L. e J.M.G.); e la Cattedra E. Ronald Salvitti in Ricerca Oftalmologica (a J.M.G.). Un ulteriore sostegno è stato ricevuto dalla Wiegand Fellowship in Ophthalmology (a L.L.L), dalla Eye & Ear Foundation di Pittsburgh e da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, New York, NY. Gli autori desiderano anche ringraziare Amanda Platt per l'assistenza tecnica e il Dr. Hugh Hammer e lo staff acquatico per l'eccellente supporto alla cura degli animali.

L.L.L. è il co-inventore del brevetto statunitense n. 9.458.428, che descrive un metodo accelerato per derivare l'epitelio pigmentato retinico da cellule staminali pluripotenti umane; questo non è correlato al contenuto del presente documento. J.M.G. e G.B.F. non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'RPE e studiare i meccanismi di degenerazione e rigenerazione nel pesce zebra di età larvale. Questo protocollo è stato eseguito con successo anche nel pesce zebra adulto3 ma con una caratterizzazione meno estesa, motivo per cui le larve sono al centro dell'attenzione. Gli aspetti critici di questa parte del protocollo (fasi 1-4) includono: 1) aggiunta di 1,5x PTU agli embrioni prima dell'inizio della melanogenesi, 2) decorionazio...

La metodologia qui descritta descrive un protocollo per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando il pesce zebra larvale. L'RPE si estende sulla parte posteriore dell'occhio e risiede tra gli strati stratificati della retina neurale e lo strato di vascolarizzazione che costituisce la coroide. Il supporto trofico, l'assorbimento della luce fototossica e il mantenimento delle proteine del ciclo visivo sono solo alcune delle funzioni critiche che l'RPE svolge che sono essenziali per sostenere la salute e l'integrità di questi tessuti adiacenti1. Il danno all'RPE dei mammiferi è riparabile quando le lesioni sono piccole2; tuttavia, i danni subiti da lesioni più grandi o malattie degenerative progressive sono irreversibili. Nell'uomo, le malattie degenerative RPE (ad esempio, la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la malattia di Stargardt) portano alla perdita permanente della vista e, con poche opzioni di trattamento disponibili, alla diminuzione della qualità della vita del paziente. La limitata capacità dell'RPE dei mammiferi di auto-ripararsi ha creato una lacuna di conoscenza nel campo dei processi rigenerativi RPE. Data la robusta capacità rigenerativa del pesce zebra in molti tipi di tessuto diversi, questo protocollo è stato sviluppato per stabilire un sistema di vertebrati in vivo per facilitare gli studi sull'RPE intrinsecamente rigenerante e scoprire i meccanismi che guidano tale risposta. Utilizzando il paradigma di ablazione qui delineato, la via di segnalazione Wnt canonica3, la via mTOR4 e le risposte immuno-correlate5 sono state identificate come mediatori critici della rigenerazione RPE, probabilmente con funzioni sovrapposte.
In questo paradigma di ablazione genetica, il pesce zebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 esprime il gene6 della nitroreductasi di derivazione batterica (NTR/nfsB) fuso a eGFP sotto il controllo dell'elemento potenziatore RPE, rpe65a7. L'ablazione si ottiene aggiungendo il profarmaco, il metronidazolo (MTZ), al sistema idrico che ospita il pesce zebra. L'attivazione intracellulare di MTZ da parte della nitroreduttasi provoca reticolazione del DNA e apoptosi nelle cellule che esprimono NTR/nfsB 8,9. Questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra per ablare le cellule della retina 10,11,12,13 e altri tessuti 8. Insieme, questi elementi consentono l'espressione mirata (rpe65a) di una metodologia di ablazione cellulare inducibile (NTR/MTZ)8,9 e di un marcatore fluorescente (eGFP) per la visualizzazione.
Esistono anche altri interessanti modelli in vivo che possono essere utilizzati per studiare il potenziale rigenerativo dell'RPE14. Questi sono ampi e includono la transdifferenziazione RPE-retina post-retinectomia negli anfibi, in cui le cellule RPE perse per ricrescita retinica vengono sostituite15,16; Ripristino RPE post-infortunio nel topo MRL/MpJ "super curativo"17; e stimolazione esogena della proliferazione RPE in un modello di ratto di RPE spontanea e degenerazione retinica18, tra gli altri. Sono stati sviluppati anche modelli in vitro, come le cellule staminali RPE umane adulte (RPESC)19. Questi modelli sono tutti strumenti preziosi che lavorano per scoprire i processi cellulari legati alla rigenerazione RPE (ad esempio, proliferazione, differenziazione, ecc.); tuttavia, il pesce zebra è unico nella sua capacità di riparazione RPE intrinseca post-ablazione.
Mentre la metodologia qui è scritta per concentrarsi sulla comprensione dei meccanismi che guidano la rigenerazione RPE, la linea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) e questo protocollo di ablazione genetica potrebbero essere utilizzati per studiare altri processi cellulari come l'apoptosi RPE, la degenerazione RPE e l'effetto della lesione RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti. Il protocollo di ablazione può anche essere modificato per includere la manipolazione farmacologica, che è una comoda strategia preliminare per schermare le vie di segnalazione di interesse. Ad esempio, il blocco della via Wnt canonica utilizzando l'inibitore della risposta Wnt-1 (IWR-1)20, ha dimostrato di compromettere la rigenerazione RPE3. Questo è stato ripetuto qui per guidare gli utenti attraverso un esperimento di manipolazione farmacologica e servire come proof-of-concept per convalidare uno script MATLAB (RpEGEN) creato per quantificare la rigenerazione RPE basata sul recupero della pigmentazione. Come la linea transgenica e il protocollo di ablazione, gli script RpEGEN sono adattabili e potrebbero essere utilizzati per quantificare altri marcatori / processi cellulari all'interno dell'RPE.

<table><tbody><tr><td>Lab Materiale/Attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-(4-Amidinofenil)-6-indolecarbamidina dicloridrato (DAPI)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche per centrifuga in polipropilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>Il numero di catalogo è per provette da 50 mL</td></tr><tr><td>Penna per incisione con punta di diamante</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-254-51</td><td>Prodotto da Electron Microscopy Sciences, articoli simili a questo codice sono adeguati</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO) &ge; 99,7 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td>Verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici</td></tr><tr><td>Incubatrice per embrioni (grande)</td><td>Fisher Scientific</td><td>3720A</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice per embrioni (mini/da tavolo)</td><td>Labnet</td><td>I5110A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td>O simile, con laser/filtro di eccitazione a 488 nm</td></tr><tr><td>Pipetta in vetro Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-4</td><td>Prodotto da Corning, non sterile</td></tr><tr><td>InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo</td><td>Millipore Sigma</td><td>5.04462</td><td>Prodotto da Calbiochem; 25 mM in DMSO; verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici</td></tr><tr><td>Blu di metilene (polvere)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP117-100</td><td>Disponibile anche come soluzione</td></tr> <tr><td>preconfezionataMetronidazolo (MTZ)</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3761</td><td>Verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici</td></tr><tr><td>N-feniltiourea (PTU)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7629</td><td>Verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici</td></tr><tr><td>Senza metanolo Senza metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>Rifiuti chimici, è richiesto un corretto smaltimento</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>10 cm di diametro</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (bustine di polvere)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>Utilizzato per produrre 10 X PBS stock</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>PRON-RO</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>Benchmark</td><td>H2010</td><td>Utilizzato per l'incubazione di MTZ per 1 ora a 37 gradi Celsius</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>O simile, con luce trasmessa illuminazione</td></tr><tr><td>Studente Dumont #5 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Pinze a punta fine per la decorionazione manuale</td></tr><tr><td>Rotatore/agitatore da tavolo</td><td>Scilogex</td><td>SK-D1807-E</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z135003</td><td>3,2 mL estrazione della lampadina, non sterile</td></tr><tr><td>Tricaina metanassolato (MS-222)</td><td>Pentair</td><td>TRS1, TRS2, TRS5</td><td>Disponibile anche da Fisher Scientific (NC0342409)</td></tr><tr><td>Supporto di montaggio antidissolvenza VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Software Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td><td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td> <td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Costruzione: 269a0ad53f; Plugin necessario: Bio-Formattazioni,</td></tr><tr><td>esempi GRAMM e how-to,</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>Toolboxes necessari per eseguire RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox</td></tr><tr><td>MATLAB supporta</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/support.html</td><td></td></tr></tbody></table>

ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma matlab (rpegen) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) risiede nella parte posteriore dell'occhio e svolge funzioni essenziali per mantenere la salute e l'integrità dei tessuti retinici e vascolari adiacenti. Allo stato attuale, la limitata capacità riparativa dell'RPE nei mammiferi, che è limitata a piccole lesioni, ha ostacolato il progresso verso la comprensione dei processi rigenerativi RPE in vivo . Qui, viene fornita una metodologia dettagliata per facilitare lo studio della riparazione RPE in vivo utilizzando il pesce zebra, un modello di vertebrato in grado di una robusta rigenerazione dei tessuti. Questo protocollo descrive un paradigma di lesione transgenico mediato da nitroreduttasi/metronidazolo (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), che si traduce in ablazione dei due terzi centrali dell'RPE dopo 24 ore di trattamento con MTZ, con successivo recupero tissutale. L'attenzione è posta sulle ablazioni RPE nel pesce zebra larvale e sono anche delineati i metodi per testare gli effetti dei composti farmacologici sulla rigenerazione RPE. Viene inoltre discussa la generazione e la convalida di RpEGEN, uno script MATLAB creato per automatizzare la quantificazione della rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione. Oltre ai meccanismi attivi di riparazione RPE, questo protocollo può essere esteso agli studi sulla degenerazione RPE e sulle risposte alle lesioni, nonché sugli effetti del danno RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti, tra gli altri processi cellulari e molecolari. Questo sistema di zebrafish è promettente nell'identificazione di geni, reti e processi che guidano la rigenerazione RPE e i meccanismi correlati alla malattia RPE, con l'obiettivo a lungo termine di applicare queste conoscenze ai sistemi dei mammiferi e, in definitiva, allo sviluppo terapeutico.

È noto che l'inibizione della via di segnalazione canonica Wnt compromette significativamente la rigenerazione RPE del pesce zebra utilizzando il paradigma di ablazione genetica (rpe65a:nfsB-eGFP) e la metodologia di manipolazione farmacologica (IWR-1) descritti nel protocollo3. Questo esperimento è stato ripetuto qui per convalidare un metodo automatizzato per quantificare la rigenerazione RPE del pesce zebra basato sulla pigmentazione. I risultati riassunti di seguito comprendevano tutt...

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Il pesce zebra è unico nella sua capacità intrinseca di rigenerare molti tipi di tessuto diversi, incluso l'RPE. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare i percorsi molecolari che guidano la rigenerazione RPE e i meccanismi correlati alla malattia RPE. La versatilità è un vantaggio primario di questa metodologia.Oltre a studiare la rigenerazione RPE, questo protocollo può essere utilizzato per esaminare i processi degenerativi RPE e gli effetti del danno RPE sui tessuti adiacenti nell'occhio. I mammiferi, compresi gli esseri umani, non sono in grado di riparare grandi lesioni DA RPE derivanti da traumi o malattie degenerative. L'utilizzo del pesce zebra come strumento per scoprire i fattori pro-rigenerativi RPE è un passo significativo verso la promozione della rigenerazione RPE nei mammiferi.Per preparare una soluzione MTZ fresca da 10 millimolari, cinque giorni dopo la concimazione, aggiungere la polvere MTZ all'acqua di sistema senza PTU e mescolare accuratamente agitando vigorosamente per un'ora a 37 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione MTZ da 10 millimolari per un'ora a temperatura ambiente su un rotatore o uno shaker da tavolo. Per lo screening delle larve di zebrafish dal transgene rpe65a:nsfB-eGFP, separare le larve transgeniche eGFP positive dalle larve negative eGFP non transgeniche utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente con un laser di eccitazione a 488 nanometri.Wake le larve schermate immediatamente pipettando direttamente in una capsula di Petri con PTU fresco 1,5X senza tricaina. Al termine dello screening, separare ulteriormente le larve positive all'eGFP in due gruppi di piastre di Petri, un gruppo per ricevere il trattamento MTZ e un gruppo per essere il controllo non pubblicato. Quindi ablare l'epitelio pigmentato retinico rimuovendo 1,5X PTU dai piatti di trattamento ablati e aggiungere la soluzione MTZ da 10 millimolari appena prodotta.Rimuovere anche 1,5X PTU dalle piastre di controllo non blopedi e aggiungere acqua fresca di sistema senza PTU. Rimuovere la soluzione MTZ da 10 millimolari dopo esattamente 24 ore e aggiungere acqua di sistema fresca senza PTU. Cambiare l'acqua fresca del sistema senza PTU sui piatti negativi MTZ.Schermo eGFP larve positive a quattro giorni dopo la fecondazione. L'eGFP è visibile quattro giorni dopo la fecondazione, ma appare più debole dell'intensità del segnale il quinto giorno. Posizionare le larve positive all'eGFP in piastre a sei pozzetti invece di piastre di Petri a una densità non superiore a 10 larve per pozzetto per il trattamento farmacologico.Designare piastre separate a sei pozzetti per larve ablate e non ablate. Determinare il volume di 15 micromolari IWR-1 o il volume corrispondente ai pre-trattamenti di controllo del veicolo DMSO necessari e aliquota 1,5X PTU in tubi conici di conseguenza. Aggiungere lo stock IWR-1 a 1,5X PTU per una concentrazione finale di 15 micromolari IWR-1.Aggiungi un volume corrispondente di azioni DMSO a 1,5X PTU. Mescolare bene vorticando e confermare visivamente la dissoluzione dei composti. Rimuovere 1,5X PTU dalle larve positive eGFP in piastre a sei pozzetti e aggiungere cinque millilitri per pozzetto di 0,06% DMSO appena fatto o 15 micromolari IWR-1 trattamenti.Ablate l'RPE il giorno successivo. Nei cinque giorni successivi alla fecondazione, determinare il volume dei trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo necessari per piastre a sei pozzetti non ablate e ablate e volumi appropriati di aliquota di acqua di sistema dolce senza PTU o soluzione MTZ da 10 millimolari in tubi conici. Aggiungere le soluzioni di riserva IWR-1 e DMSO ai rispettivi tubi conici come eseguito in precedenza.Mescolare bene vorticando e confermare visivamente la dissoluzione dei composti. Rimuovere lo 0,06% di DMSO e 15 pre-trattamenti micromolari IWR-1 in 1,5X PTU da piastre a sei pozzetti designate non ablate e ablate. Reintegrare con l'acqua di sistema dolce appropriata senza trattamenti di soluzione PTU e MTZ.Rimuovere lo 0,06% di DMSO e 15 trattamenti micromolari IWR-1 in soluzione MTZ da 10 millimolari dopo esattamente 24 ore e reintegrare con trattamenti in acqua dolce di sistema senza PTU. Ricostituire lo 0,06% di DMSO e 15 trattamenti IWR-1 micromolari in acqua dolce di sistema senza PTU sulla piastra a sei pozzetti nonblata. Monitorare il successo e l'estensione dell'ablazione in vivo utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa su uno stereomicroscopio per il mantenimento larvale post-ablazione genetica.Per generare la regione di interesse RPE o ROI utilizzando Fiji, apri un'immagine TIFF a otto bit, riorienta l'immagine in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto e il distale sia lasciato scegliendo l'immagine, trasformando e capovolgendo orizzontalmente. Per l'ultimo comando, scegli l'opzione più adatta alla direzionalità necessaria per quell'immagine. Avvia il ROI manager scegliendo analisi, strumenti, ROI manager.Usa l'immagine, lo zoom e passa tra i canali DAPI e Brightfield. Usa le scorciatoie da tastiera per l'efficienza. Identificare il punto in cui il lato apicale dell'RPE è adiacente dalla punta della membrana limitante esterna e utilizzare questo punto di riferimento anatomico come punto di partenza del ROI.Crea il ROI RPE con lo strumento di selezione dei poligoni nella barra degli strumenti Fiji utilizzando entrambi i canali di immagine DAPI e Brightfield e la funzione di zoom dell'immagine per identificare i limiti RPE apicali e basali. Porta le estremità dorsali e ventrali del ROI a un punto acuto piuttosto che smussare o arrotondare. Aggiungi il ROI facendo clic su Aggiungi nel ROI manager.Salva il file ROI scegliendo di più e salva all'interno del ROI manager. Fare doppio clic sul rpegen. m da aprire nel riquadro dell'editor.Sotto la sezione variabile definita dall'utente del rpegen. m file, inserisci i percorsi della directory per le cartelle contenenti i file roi, i file di immagine tiff e dove devono essere salvati i file di output. Immettere il nome del gruppo per il file mat da esportare e la posizione del canale Brightfield nello stack di immagini TIFF.Esegui lo script facendo clic sul pulsante Esegui nel menu dell'editor nella parte superiore di MATLAB. Dopo aver salvato il file MAT, verrà visualizzata una figura a tre pannelli che verrà salvata anche come PDF nella directory di output per ogni esecuzione dell'immagine. Attendere che questi PDF di controllo qualità siano stati salvati nella cartella di output e l'ultima figura sia scomparsa.Aprire i singoli PDF e verificare che tutti i ROI corrispondano alle immagini Brightfield. Fare doppio clic sul rpegen_permplot. m da aprire in una nuova scheda dell'editor.Nella sezione Variabili definite da un utente, immettere il percorso della directory per la cartella di output contenente i file MAT dall'esecuzione di rpegen. m script. Immettere ogni nome file MAT da caricare.Eseguire questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu dell'editor. Nella seconda sezione, inserire i nomi dei due gruppi per un confronto statistico nei dati A e nei dati B variabili e designare il numero di ripetizioni di simulazione di permutazione nella variabile reps. Solo 2.000 ripetizioni sono state utilizzate per questa demo per ridurre i tempi di elaborazione.Eseguire questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu dell'editor. Esegui la figura della mappa di calore e raggruppa i risultati e le sezioni del valore P in modo indipendente utilizzando il pulsante Esegui sezione. Il danno dell'intero monte di una larva post-fecondazione di cinque giorni ha mostrato una brillante espressione transgenica nell'RPE al momento dello screening per l'ablazione genetica.La criosezione trasversale della larva post-fecondazione nonblata di sei giorni ha mostrato che l'espressione transgenica era limitata alle cellule RPE mature con l'espressione più brillante confinata ai 2/3 centrali dell'RPE. Le punte di freccia indicano microvilli apicali. La criosezione trasversale di una larva ablata di un giorno dopo l'infortunio ha rivelato un'interruzione della morfologia cellulare positiva all'eGFP.Le frecce indicano i nuclei picnotici. I danni all'intero monte delle larve post-fecondazione non alatate sette giorni hanno mostrato pigmentazione RPE in tutto l'occhio e le larve ablate post-lesione di due giorni hanno mostrato una zona di ablazione senza pigmento nell'RPE centrale. Un grafico generato utilizzando RpEGEN ha mostrato somiglianze tra i gruppi DMSO post-fecondazione di nove giorni non pubblicati e IWR-1 per tutta la lunghezza dell'RPE.Il grafico ha mostrato un'intensità complessiva di pixel più leggera nei gruppi Ablati di quattro giorni post-lesione DMSO e IWR-1, che apparivano più leggeri nell'IWR-1 ablato rispetto a qualsiasi altro gruppo di trattamento. Le differenze nella pigmentazione centrale dell'RPE sono state significative quando si confrontano le larve trattate con IWR-1 ablato con i controlli trattati con DMSO ablato. Utilizzando questo paradigma di ablazione del pesce zebra, siamo stati in grado di identificare diverse vie di segnalazione molecolare, come la segnalazione del vento che abbiamo mostrato qui, che sono regolatori critici della rigenerazione RPE.

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Questo video mostra una procedura per indurre la degenerazione retinica in zebrafish adulti utilizzando lesioni laser. Il laser prende di mira le cellule fotorecettrici della retina, innescando la morte cellulare e un processo degenerativo. Questo danno attiva le cellule della glia di Müller (MG), portando alla loro dedifferenziazione in progenitori di cellule staminali che aiutano nella rigenerazione retinica.

Modellazione della degenerazione e della rigenerazione retinica nel pesce zebra utilizzando una lesione laser focale

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l'intera retina.

A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

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Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali

Per aiutare a valutare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione epatica guidata dalle vie biliari del pesce zebra, abbiamo stabilito un modello di danno epatico in cui gli epatociti che esprimono nitroreduttasi vengono geneticamente ablati dopo il trattamento con metronidazolo.  In questo protocollo, descriviamo come manipolare, monitorare e analizzare abilmente l'ablazione degli epatociti e la rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari.

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

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Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

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Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Abbiamo sviluppato diversi protocolli per indurre danni o degenerazioni retiniche nei girini di Xenopus laevis . Questi modelli offrono la possibilità di studiare i meccanismi di rigenerazione retinica.

Generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di Xenopus

Scopri l'ablazione genetica dell'epitelio pigmentato retinico in zebrafish transgenici con metronidazolo e la piattaforma MATLAB RpEGEN per quantificare la rigenerazione. Questo metodo consente di studiare le vie di segnale pro-rigenerative.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dellepitelio pigmentato retinico zebrafish (Video) | JoVE Journal

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

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