Name: Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Scopri quattro metodi complementari per rilevare Wolbachia nelle cellule di Aedes albopictus. Questo protocollo migliora l'accuratezza della diagnosi e supporta la ricerca sulle interazioni batterio-ospite.

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Ringraziamo il Dr. Xin-Ru Wang dell'Università del Minnesota per suggerimenti e indicazioni approfondite. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

1. Materiali e reagenti
<ol><li>Utilizzare soluzioni e mezzi privi di pirogeni per la coltura cellulare (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Utilizzare acqua ultrapura per preparare tutte le soluzioni.</li>
	<li>Fare attenzione nella selezione del siero bovino fetale (FBS) per la coltura cellulare, seguendo un processo di controllo dei lotti. NOTA: poiché i lotti FBS sono soggetti a modifiche regolari, è impossibile indicare il catalogo e i numeri di lotto pertinenti in questo protocollo.</li>
	<li>Selezionare ceppi cellulari Aa23 derivati da uova di A. albopictus , corrispondenti ad Aa23-T senza Wolbachia.</li>
</ol>2. Coltura cellulare
<ol><li>Preparare palloni di coltura cellulareda 25 cm 2 con 4 mL di terreno di Schneider con il 10% di FBS.</li>
	<li>Incubare i palloni a 28 °C in atmosfera al 5% di CO2 per 5-7 giorni 7,24.</li>
	<li>Osservare le cellule Aa23 e Aa23-T non macchiate nei palloni utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 100x (Figura 1).</li>
</ol>3. Estrazione del DNA
<ol><li>Coltivare le cellule per 5-7 giorni fino al 70-80% di confluenza per pallone (fase 2). Raccogliere le cellule con pipettaggio manuale da 1 mL di terreno di coltura risospeso mediante centrifugazione per 5 minuti a 100 × g in una microcentrifuga.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante per aspirazione e conservare il pellet cellulare risultante a -20 °C.</li>
	<li>Risospesare il pellet in 0,40 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), posizionare 50 μL della soluzione in un tubo microcentrifuga, aggiungere 5 μL di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare a 55 °C per 1 ora. Infine, riscaldare questi tubi a 99 °C per 15 minuti per ottenere il DNA grezzo e conservarlo a -20 °C.</li>
</ol>4. Rilevazione dell'acido nucleico Wolbachia
<ol><li>Analisi PCR<ol>
<li>Eseguire la PCR in un volume di reazione totale di 20 μL, contenente 8 μL di ddH2O, 10 μL di Taq polimerasi (vedere la tabella dei materiali), 1 μL di modello di DNA (dalla fase 3), 0,5 μL di primer avanti e indietro (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') e wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, rispettivamente.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 °C, ricottura a 55 °C ed estensione a 72 °C; poi, un'estensione finale a 72 °C per 7 min.</li>
		<li>Rileva il DNA su un gel di agarosio all'1% (1% p/v di agarosio in PBS) utilizzando un imager gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi qPCR<ol>
<li>Analizzare la copia del genoma di Wolbachia per tre repliche biologiche (n = 6) dal DNA estratto (fase 3) utilizzando i primer wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') e QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalizzati con primer ribosomiali S6 (RPS6) in avanti e inverso (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' e 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', rispettivamente)3.</li>
		<li>Generare una curva standard per wAlbB e RPS6.<ol>
<li>Estrarre il DNA dal plasmide ricombinante PMD-18T (un vettore speciale per la clonazione efficiente di prodotti PCR (clonazione TA)) contenente frammenti di geni wsp e rps6 (file supplementare) e misurare la concentrazione di DNA plasmidico (vedere la tabella dei materiali).</li>
			<li>Convertire la concentrazione di DNA plasmidico in concentrazione di numero di copie utilizzando Eq (1). Numero di copia del plasmide = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>Diluire il numero di copie del plasmide da 101 a 108 con acqua ultrapura e impostare 3 repliche per ogni gradiente di concentrazione.</li>
			<li>Eseguire l'amplificazione qPCR utilizzando TB Green e un sistema PCR in tempo reale (vedere la Tabella dei materiali) e registrare i risultati di ogni reazione. Utilizzate il valore Ct per sviluppare una curva standard. Analizzare il DNA in un volume di reazione totale di 20 μL, comprendente 7 μL di ddH2O, 10,4 μL di TB Green (vedere la Tabella dei materiali), 1 μL di modello di DNA (fornito dalla fase 3) e 0,8 μL di primer avanti e indietro (10 μM). Utilizzare le seguenti condizioni di reazione: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s e ricottura a 60 °C per 35 s.</li>
			<li>Calcola i numeri di copia del gene WSP e RPS6 nelle cellule secondo la curva standard stabilita e la densità relativa di Wolbachia dal numero di copie di wsp / RPS6. Analizzare i dati utilizzando un t-test di campioni indipendenti.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi Western blot della proteina Wolbachia<ol>
<li>Estrazione di proteine<ol>
<li>Raccogliere 2 × 107 cellule Aa23 e Aa23-T dalla piastra a sei pozzetti (dal punto 2) in un tubo microcentrifuga, lavarle tre volte con PBS e centrifugarle a 100 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
			<li>Preparare 1 mL di lisati con tampone di lisi RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desossicolato di sodio, 0,1% sodio dodecil solfato [SDS], 2 mM pirofosfato di sodio, 25 mM β-glicerofosfato, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/mL leupeptina) e PMSF (concentrazione finale 1 mM).</li>
			<li>Aggiungere 200 μL di tampone di lisi al pellet cellulare e mantenere per 30 minuti sul ghiaccio. Centrifugare i lisati a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analizzare la concentrazione di wsp del surnatante utilizzando un kit di analisi proteica dell'acido bicinchoninico (BCA) (vedere la tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Caricare quantità uguali di proteine su un gel SDS-PAGE al 15% [10% acqua distillata; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% persolfato di ammonio), 0,04% TEMED].</li>
		<li>Trasferire la proteina alle membrane nitrocellulose, bloccare le membrane con il 5% di latte scremato per 2 ore26,27 a temperatura ambiente, quindi lavare le membrane tre volte con TBST (1 mL di Tween 20 in 1 L di TBS) (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Incubare le membrane durante la notte a 4 °C con 100 μL di anticorpo policlonale anti-wsp (preparato internamente, vedere File supplementare)), preparato diluendo l'anticorpo primario con il 5% di latte scremato (1:12.000).</li>
		<li>Lavare l'anticorpo primario tre volte con TBST.</li>
		<li>Incubare le membrane in 100 μL di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) su uno shaker per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare le membrane tre volte con TBST e miscelare 20 μL di soluzione A (HRP Substrate Luminol Reagent) e 20 μL di soluzione B (HRP Substrate Peroxide Reagent) nel kit di rilevamento della chemiluminescenza con un rapporto di 1:1. Immergere contemporaneamente l'intera membrana nella soluzione di luminescenza e osservare i segnali utilizzando un sistema di imaging multifunzionale.</li>
	</ol></li>
	<li>Localizzazione in immunofluorescenza della proteina Wolbachia<ol>
<li>Incubare 5 × 105 cellule Aa23 e Aa23-T a 28 °C su una capsula di Petri confocale laser con uno spessore di 0,17 mm nella parte inferiore, sotto un'atmosfera di CO2 al 5% per 3-4 giorni 7,24. Attendere che la cella abbia una confluenza del 60%-70% e lavare le cellule tre volte con PBS.</li>
		<li>Fissare le celle per 20 minuti a 4 °C in 1 mL di paraformaldeide al 4% (p/v) in PBS.</li>
		<li>Lavare le celle fisse utilizzando PBST (0,2% v/v Triton X-100 in PBS) per 5 minuti e lavare nuovamente le celle due volte con PBS.</li>
		<li>Incubare i vetrini per 1 ora a 37 °C in 1 mL di albumina sierica bovina al 3% (p/v) in PBS.</li>
		<li>Incubare i vetrini durante la notte in 100 μL di anticorpo policlonale anti-wsp di topo (preparato internamente) e siero di topo (diluizione 1:1.000 in PBS) in una scatola bagnata (può mantenere l'umidità e impedire l'evaporazione dell'umidità) a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere le diapositive dalla scatola bagnata e riportarle a temperatura ambiente; lavarli tre volte con PBS e rimuovere il PBS. NOTA: dal passaggio 4.4.7 in poi, tutte le operazioni devono essere protette dalla luce.</li>
		<li>Incubare i vetrini con 100 μL di un anticorpo anti-topo di capra coniugato Alexa Fluor 488 (diluizione 1:2.000 in PBS) a 37 °C per 30 min.</li>
		<li>Incubare i vetrini campione con 50 μL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI diluito in PBS a 10 μg/mL, si lega fortemente al DNA) a 37 °C per 5 minuti e poi lavarli tre volte con PBS.</li>
		<li>Osservare l'immunocolorazione al microscopio confocale.<ol>
<li>Accendi l'alimentazione e il laser.</li>
			<li>Accendere le normali lampade al mercurio del microscopio.</li>
			<li>Avviare il sistema ed eseguire il software operativo. Metti una goccia di olio di cedro sui vetrini del campione, posiziona i vetrini del campione sul palco del microscopio e sposta il palco nella posizione appropriata.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante di osservazione della lampada al mercurio nel software, aprire l'otturatore della lampada al mercurio e osservare il campione al microscopio invertito per mettere a fuoco.</li>
			<li>Utilizzare il pannello di controllo manuale per selezionare la fluorescenza verde e blu per scattare foto a fluorescenza con ingrandimento 100x.</li>
			<li>Spegni il pulsante di osservazione della lampada al mercurio e inizia ad acquisire immagini.</li>
			<li>Per garantire una buona qualità dell'immagine, eseguire la scansione preliminare in base alle dimensioni della scansione (512 pixel x 512 pixel). Regolare le dimensioni della scansione per ottenere immagini chiare (1.024 pixel x 1.024 pixel).</li>
			<li>Eseguire la riduzione del rumore se il rumore di fondo è troppo alto.</li>
			<li>Interrompere la scansione e salvare le immagini.</li>
			<li>Spegnere la lampada al mercurio e i laser.</li>
			<li>Pulire l'obiettivo con il 75% di alcol e abbassare l'obiettivo alla posizione più bassa.</li>
			<li>Spegnere l'otturatore e l'alimentazione del microscopio.</li>
			<li>Dopo che lo strumento si è raffreddato, coprirlo con il coperchio antipolvere.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Il rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia è essenziale per lo studio delle interazioni Wolbachia-ospite e la conferma del successo della trasfezione di cellule con nuovi ceppi. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine. Questi quattro metodi sperimentali hanno corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule da Wolbachia...

La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Ditteri: Culicidae), che è un vettore chiave del virus della dengue (DENV) in Asia e in altre parti del mondo1, è un ospite naturale di due tipi di batteri intracellulari, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), che sono distribuiti in tutta la linea germinale e nel tessuto somatico 2,3. La linea cellulare Aa23 derivata da embrioni di A. albopictus è costituita da almeno due tipi di cellule morfologiche, entrambe supportano l'infezione4 e possono essere curate dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici (Aa23-T). Dato che Aa23 conserva solo wAlbB, è un modello utile per lo studio delle interazioni ospite-endosimbionte 4,5,6.
Wolbachia è trasmesso per via materna e infetta circa il 65% delle specie di insetti 8,9 e il 28% delle specie di zanzare10. Infetta una varietà di tessuti e forma un'intima relazione simbiotica con l'ospite, di solito inducendo incompatibilità citoplasmatica (CI)11 e sostituzione della popolazione manipolando il sistema riproduttivo dell'ospite12,13. Queste risposte dell'ospite sono state osservate in popolazioni naturali di Drosophila simulans14 e in A. aegypti in una gabbia di laboratorio e in una prova sul campo15. Un'importante manipolazione non riproduttiva suscitata da Wolbachia è la resistenza indotta dell'ospite a una varietà di agenti patogeni, tra cui DENV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus del Nilo occidentale (WNV)16,17, che può essere mediata da un sistema immunitario innato migliorato del simbionte18,19, competizione tra Wolbachia e virus per le risorse essenziali dell'ospite20 e manipolazione delle vie di difesa virale dell'ospite21 .
Questo protocollo è stato sviluppato per studiare questi meccanismi alla base delle risposte antivirali dell'ospite indotte da Wolbachia. Utilizza quattro metodi di rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia delle cellule Aa23. Questi metodi forniscono una solida base teorica per gli studi sull'infezione intracellulare da Wolbachia di altre specie ospiti. Il primo metodo, la PCR, una potente tecnica che consente l'amplificazione enzimatica di specifiche regioni del DNA senza utilizzare procedure di clonazione convenzionali, è stato utilizzato per rilevare il DNA di Wolbachia e determinare la presenza / assenza di infezione da Wolbachia 22. Il secondo metodo misura la densità di copia del DNA di Wolbachia utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) per il rilevamento e la misurazione affidabili dei prodotti generati durante ogni ciclo PCR che è direttamente proporzionale alla quantità di modello prima della PCR23. Il terzo metodo rileva la presenza di proteine Wolbachia intracellulari , utilizzando western blot, uno degli strumenti più potenti per rilevare proteine specifiche in miscele complesse combinando l'elevato potere di separazione dell'elettroforesi, la specificità degli anticorpi e la sensibilità delle reazioni enzimatiche cromogeniche. Il metodo finale è un test di immunofluorescenza (IFA) che combina immunologia, biochimica e microscopia per rilevare la proteina di superficie wolbachia (wsp) attraverso una reazione antigene-anticorpo per confermare l'assorbimento cellulare di Wolbachia e determinarne la localizzazione cellulare.
Questo documento descrive i quattro metodi sopra elencati per verificare l'esistenza di Wolbachia nelle cellule, che possono essere utilizzati per rilevare se la Wolbachia esogena è stata trasfetta con successo e la Wolbachia nella cellula è stata eliminata. Dopo aver determinato se Wolbachia è presente nelle cellule o meno, è possibile eseguire una varietà di analisi diverse, tra cui genomica, proteomica o metabolomica. Questo protocollo dimostra il rilevamento di Wolbachia attraverso le cellule Aa23, ma può essere utilizzato anche in altre cellule.

<table><tbody><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Petri Pipetta</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pipetman</td><td>F167380</td> Piattaforma <td>P10</td></tr><tr><td>inSituX</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>Granato</td> di ittrio e alluminio drogato con cerio sviluppato <td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, substrati monocristallini YAG</td></tr><tr><td>Portachip</td><td>Sviluppato</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Software di controllo</td><td>Olio da immersione sviluppato</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Tipo A bassa viscosità 150 cSt</td></tr><tr><td>piattaforma inSituX</td><td>Sorgente</td> di luce IR sviluppata <td></td><td></td></tr><tr><td>internamente&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED con lente in vetro, 1085 nm, 5 mW, anello esterno TO-18</td></tr><tr><td></td>Laser <td>a pompa sviluppati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>internamente</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash; 9 mm, codice pin E, diodo laser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Anello</td> di ritenzione per <td></td><td></td>fondazione</tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 Anello di ritenzione per &Oslash; 1" tubi per lenti e supporti</td></tr><tr><td>in cristallo di quarzo senza semi</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm di diametro Z-cut 0,05 mm di spessore doppia lucidatura laterale 8 mm su -X</td></tr><tr><td>Shim</td> Arresto <td></td> del fascio di raggi X sviluppato <td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento del ceppo wolbachia walbb nelle linee cellulari aedes albopictus

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Come endosimbionte materno, Wolbachia infetta grandi proporzioni di popolazioni di insetti. Gli studi hanno recentemente riportato il successo della regolazione della trasmissione del virus a RNA utilizzando zanzare trasfettate da Wolbachia. Le strategie chiave per controllare i virus includono la manipolazione della riproduzione dell'ospite attraverso l'incompatibilità citoplasmatica e l'inibizione dei trascritti virali attraverso l'innesco immunitario e la competizione per le risorse derivate dall'ospite. Tuttavia, i meccanismi alla base delle risposte delle zanzare trasfettate da Wolbachia all'infezione virale sono poco compresi. Questo documento presenta un protocollo per l'identificazione in vitro dell'infezione da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine nelle cellule Aa23 di Aedes albopictus (Ditteri: Culicidae) per migliorare la comprensione delle interazioni tra Wolbachia e i suoi insetti vettori. Attraverso l'uso combinato di reazione a catena della polimerasi (PCR), PCR quantitativa, western blot e metodi analitici immunologici, è stato descritto un protocollo morfologico standard per il rilevamento di cellule infette da Wolbachia che è più accurato dell'uso di un singolo metodo. Questo approccio può anche essere applicato alla rilevazione dell'infezione da Wolbachia in altri taxa di insetti.

Prima che Wolbachia fosse rilevata , le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare eventuali differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e Aa23-T hanno almeno due morfologie cellulari ma nessuna evidente differenza morfologica tra i due tipi di cellule (Figura 1). Qui, le cellule Aa23 sono state utilizzate come sistema modello per rilevare l'infezione da Wolbachia utilizzando quattro metodi. L'am...

Sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare Wolbachia intracellulare, che si sono completati a vicenda e hanno migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia di Aa23 derivato da Aedes albopictus e Aa23-T curato dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici.

Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Questo protocollo aiuta a verificare l'esistenza di Wolbachia nelle cellule, che è la base per comprendere l'interazione tra Wolbachia e il suo ospite. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia, che ha corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule di Wolbachia. A dimostrare la procedura sarà Qiuqiu Xiao, un post-laurea del Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Inizia osservando le cellule Aa23 e Aa23-T non macchiate con ingrandimento 100x usando la microscopia ottica. Coltivare le cellule per cinque-sette giorni per raggiungere il 70-80% di confluenza per pallone. Utilizzando una pipetta, trasferire 1 mL del terreno di coltura in un tubo di microcentrifuga.Centrifugare a 100 RCF per cinque minuti per raccogliere le cellule. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet cellulare risultante a meno 20 gradi Celsius. Coltivare le cellule per cinque-sette giorni per raggiungere il 90-100% di confluenza per pallone.Sospendere il pellet in 0,40 ml di PBS e trasferire 50 microlitri di questa soluzione in un tubo microcentrifuga. Aggiungere cinque microlitri di 20 mg/mL di proteinasi K e incubare a 55 gradi Celsius per un'ora. Quindi incubare i tubi a 99 gradi Celsius per 15 minuti per ottenere il DNA grezzo e conservarlo a meno 20 gradi Celsius.Per eseguire la PCR, preparare una miscela di reazione totale di 20 microlitri e impostare le condizioni pcr come descritto nel manoscritto di testo. Rileva il DNA su un gel di agarosio all'1% usando un imager in gel. Eseguire l'amplificazione QUANTITATIVA PCR utilizzando TB Green in un sistema PCR in tempo reale e registrare i risultati di ogni reazione.Analizzare il DNA in un volume di reazione totale di 20 microlitri e impostare le condizioni quantitative di PCR come descritto nel manoscritto di testo. Calcola i numeri di copia del gene WSP e RPS6 nelle cellule secondo la curva standard stabilita. Quindi calcolare la densità relativa di Wolbachia in base al numero di copie di wsp/RPS6.Analizzare i dati utilizzando un t-test di campioni indipendenti. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi al pellet cellulare e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i lisati a 12.000 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante.Analizzare la concentrazione di wsp del surnatante utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA, seguendo le istruzioni del produttore. Carica quantità uguali di proteine su un gel SDS-PAGE al 15%. Trasferire la proteina alle membrane nitrocellulosiche e bloccare le membrane con latte scremato al 5% per due ore a temperatura ambiente.Quindi lavare le membrane tre volte con TBST. Incubare le membrane durante la notte a 4 gradi Celsius con 100 microlitri di anticorpo policlonale anti-wsp preparati diluendo l'anticorpo primario con il 5% di latte scremato. Lavare l'anticorpo primario tre volte con TBST.Aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano alle membrane e incubarlo su uno shaker per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le membrane tre volte con TBST e mescolare 20 microlitri di soluzione A e 20 microlitri di soluzione B nel kit di rilevamento della chemiluminescenza con un rapporto di uno a uno. Immergere contemporaneamente l'intera membrana nella soluzione di luminescenza e osservare i segnali utilizzando un sistema di imaging multifunzionale.Su una capsula di Petri confocale laser, incubare le cellule Aa23 e Aa23-T per tre o quattro giorni a 28 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica atmosferica. Quando la cellula raggiunge il 60-70% di confluenza, lavare le cellule tre volte con PBS. Fissare le cellule in un mL di paraformaldeide al 4% per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Lavare le celle fisse usando PBST per cinque minuti e lavare nuovamente le cellule due volte con PBS. Incubare la capsula di Petri in un mL di albumina sierica bovina al 3% per un'ora a 37 gradi Celsius. Aggiungere 100 microlitri di anticorpi policlonali anti-wsp di topo e siero di topo ai vetrini e incubarlo durante la notte in una scatola bagnata a quattro gradi Celsius.Rimuovere la capsula di Petri dalla scatola bagnata e riportarla a temperatura ambiente. Lavarli tre volte con PBS e rimuovere il PBS. Proteggere le seguenti procedure dalla luce.Incubare la capsula di Petri con 100 microlitri di un anticorpo anti-topo di capra coniugato Alexa Fluor 488 a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Incubare la capsula di Petri campione con 50 microlitri di DAPI diluiti in PBS a 10 microgrammi/ml a 37 gradi Celsius per cinque minuti e poi lavarli tre volte con PBS. Osservare l'immunocolorazione al microscopio confocale.Prima di rilevare Wolbachia, le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare le differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e AA23-T avevano almeno due morfologie cellulari, ma non sono state osservate apparenti differenze morfologiche tra i due tipi di cellule. Utilizzando i primer diagnostici 81F/691R, l'amplificazione positiva del gene Wolbachia wsp è stata rilevata nelle cellule Aa23 ma non nelle cellule Aa23-T.L'analisi della densità di Wolbachia nelle linee cellulari ha mostrato un rapporto wsp/rps6 di 2,4 nelle cellule Aa23 ma nessun Wolbachia nelle cellule Aa23-T. L'analisi Western blot degli estratti proteici ha mostrato un forte segnale wsp per Aa23, ma nessun segnale è stato rilevato per Aa23-T. Il test di immunofluorescenza indiretta ha rilevato la proteina wsp nelle cellule Aa23, mentre solo il DNA colorato con DAPI è stato rilevato nelle cellule Aa23-T.Assicurarsi che i palloni di coltura siano incubati a 28 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica atmosferica per cinque-sette giorni. Questa procedura può essere seguita dalla microscopia elettronica in cui è necessario prestare particolare attenzione alla preparazione del campione e al sezionamento. I quattro metodi sperimentali utilizzati in questo studio hanno confermato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia nelle cellule, che è applicabile anche ad altri tipi di cellule e tessuti.

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Wolbachia infezione batterica in Drosophila

Questo video descrive un metodo per purificare Wolbachia pipientis da una linea di cellule Anopheles gambiae e poi la coltura endosymbiont nella cella senza medium. Un test per la vitalità del batterio è dimostrata.

Il mantenimento di Wolbachia in Cell-free medio

Le analisi dell'RNA-Seq stanno diventando sempre più importanti per identificare le basi molecolari dei tratti adattativi negli organismi non modello. Qui, viene descritto un protocollo per identificare i geni differenzialmente espressi tra zanzare Aedes albopictus in diapausa e non in diapausa, dall'allevamento delle zanzare, al sequenziamento dell'RNA e alle analisi bioinformatiche dei dati RNA-Seq.

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre, Aedes albopictus

Le zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia vengono rilasciate in popolazioni naturali di sopprimere la trasmissione dell'arbovirus. Descriviamo i metodi retro Ae. aegypti con Wolbachia infezioni in laboratorio per esperimenti e rilascio di campo, prendendo precauzioni per ridurre al minimo la selezione e l'adattamento di laboratorio.

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Questo protocollo viene descritto come stabilire l'infezione virale in vivo in Drosophila melanogaster utilizzando il metodo di nano-iniezione e tecniche di base per analizzare l'interazione virus-ospite.

Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster

Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Un protocollo per la coltura del parassita microsporidiano Edhazardia aedis. Il parassita viene trasferito da una generazione di zanzare Aedes aegypti all'altra tramite trasferimento orizzontale nella fase larvale seguita da trasmissione verticale nella fase adulta. Gli sporoplasmi vivi sopravvivono a lungo termine nelle uova infette.

Propagazione del parassita microsporidiano Edhazardia aedis nelle zanzare Aedes aegypti

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la competitività dell'accoppiamento di Aedes aegypti maschi usando il colorante fluorescente come marcatore. Le zanzare femmine sono esposte a maschi sia marcati che non contrassegnati per la copulazione. Dopo l'accoppiamento, le loro spermatece vengono esaminate al microscopio a fluorescenza per determinare il loro partner di accoppiamento.

Utilizzo del colorante fluorescente, Rhodamine B, per studiare la competitività dell'accoppiamento nelle zanzare Aedes aegypti maschili

La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .

Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Le comunità microbiche nelle zanzare sono molto promettenti per le strategie di biocontrollo dei vettori. La maggior parte dei simbionti non sono coltivabili e richiedono analisi metagenomiche. Descriviamo un metodo per sezionare le zanzare femmine e separare le ovaie, l'intestino medio e le ghiandole salivari prevenendo la contaminazione incrociata, facilitando gli studi sul microbioma a livello di organo e migliorando la comprensione dei ruoli dei microrganismi nella biologia delle zanzare.

Dissezione delle ovaie, dell'intestino medio e delle ghiandole salivari delle zanzare per l'analisi del microbioma a livello d'organo

Le linee cellulari sono utili negli studi su organismi intracellulari che non possono essere coltivati al di fuori delle loro cellule ospiti. Sebbene le linee infettate da Wolbachia abbiano permesso molte scoperte, l'eterogeneità all'interno di queste linee può portare a risultati sperimentali variabili. Presentiamo un protocollo per la generazione di cloni di singole cellule e colture continue da cellule JW18 infettate da Wolbachia.

Generazione di colture monoclonali da linea cellulare JW18 di Drosophila melanogaster infettata da Wolbachia

Scopri quattro metodi complementari per rilevare Wolbachia nelle cellule di Aedes albopictus. Questo protocollo migliora l'accuratezza della diagnosi e supporta la ricerca sulle interazioni batterio-ospite.

Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

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