Name: Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dellacqua di idratazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri la spettroscopia neutronica per studiare la dinamica delle proteine amiloidi e dell'acqua di idratazione. Questo metodo non distruttivo aiuta a comprendere le malattie neurodegenerative.

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Gli autori sono grati a Michaela Zamponi del Jülich Centre for Neutron Science presso l'Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Germania, per parte degli esperimenti di scattering neutronico condotti sullo strumento SPHERES. Questo lavoro ha beneficiato delle attività del consorzio Deuteration Laboratory (DLAB) finanziato dall'Unione Europea nell'ambito dei contratti HPRI-2001-50065 e RII3-CT-2003-505925, e dell'attività finanziata dal UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) all'interno dell'Institut Laue Langevin EMBL DLAB nell'ambito delle sovvenzioni GR/R99393/01 e EP/C015452/1. Il sostegno della Commissione europea nell'ambito del 7° programma quadro attraverso l'azione chiave: rafforzare lo Spazio europeo della ricerca, le infrastrutture di ricerca è riconosciuto [contratto 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot e Christian Beck ringraziano il Ministero Federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF, numero di sovvenzione 05K19VTB) per il finanziamento delle loro borse di studio post-dottorato.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La spettroscopia neutronica è l'unico metodo che consente di sondare la dinamica ps-ns mediata dall'insieme di campioni proteici indipendentemente dalle dimensioni della proteina o dalla complessità della soluzione quando viene utilizzata la deuterazione6. In particolare, sondando l'autodiffusione di gruppi proteici in soluzione, la dimensione idrodinamica di tali assemblaggi può essere determinata in modo inequivocabile. Tuttavia, il metodo è comunemente limitato dal basso flusso di neutroni, che...

Il neutrone è una particella massiccia e priva di carica che è stata utilizzata con successo nel corso degli anni per sondare campioni in vari campi, dalla fisica fondamentale alla biologia1. Per le applicazioni biologiche, lo scattering neutronico a piccolo angolo, lo scattering neutronico anelastico, la cristallografia neutronica e la riflettometria sono ampiamente utilizzati 2,3,4. Lo scattering anelastico di neutroni fornisce una misura mediata dell'insieme della dinamica senza richiedere un'etichettatura specifica di per sé e una qualità del segnale che non dipende dalla dimensione o dalla proteina5. La misurazione può essere effettuata utilizzando un ambiente altamente complesso per la proteina in studio che imita il mezzo intracellulare, come un lisato batterico deuterato o anche in vivo 3,6,7. Diverse configurazioni sperimentali possono essere utilizzate per studiare le dinamiche, vale a dire i) l'accesso al tempo di volo alle dinamiche sub-ps-ps, ii) l'accesso alla dinamica ps-ns e iii) l'accesso alle dinamiche da ns a centinaia di ns. La retrodiffusione neutronica fa uso della legge di Bragg 2d sinθ = nλ, dove d è la distanza tra i piani in un cristallo, θ l'angolo di scattering, n l'ordine di scattering e λ la lunghezza d'onda. L'uso di cristalli per il backscattering verso i rivelatori consente di ottenere un'alta risoluzione in energia, tipicamente ~ 0,8 μeV. Per misurare lo scambio di energia, viene utilizzato un azionamento Doppler che trasporta un cristallo in retrodiffusione per definire e sintonizzare la lunghezza d'onda dei neutroni in arrivo 8,9,10 (Figura 1), oppure è possibile utilizzare una configurazione del tempo di volo al costo di una diminuzione della risoluzione energetica 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63664/63664fig01.jpg"> Figura 1: Schizzo di uno spettrometro di retrodiffusione di neutroni con un drive Doppler. Il fascio in entrata colpisce il chopper PST (Phase Space Transformation)42, che aumenta il flusso nella posizione del campione. Viene quindi retrodiffuso verso il campione dall'azionamento Doppler, che seleziona un'energia E1 (freccia ciano). I neutroni vengono poi dispersi dal campione (con energie diverse rappresentate dal colore delle frecce) e gli analizzatori, costituiti da cristalli di Si 111, disperderanno solo neutroni con una specifica energia E0 (qui frecce colorate di rosso). Quindi, il trasferimento di quantità di moto q è ottenuto dalla posizione rilevata del neutrone sull'array del rivelatore e il trasferimento di energia è ottenuto dalla differenza E1- E0. Il tempo di volo previsto per l'impulso neutronico prodotto dal PST viene utilizzato per scartare il segnale dai neutroni sparsi direttamente verso i tubi del rivelatore. Abbreviazione: PST = trasformazione dello spazio delle fasi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63664/63664fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Per la spettroscopia di retrodiffusione, il principale contributo al segnale da campioni ricchi di protoni di idrogeno, come le proteine, proviene dallo scattering incoerente, per il quale l'intensità di scattering Sinc(q, ω) è mostrata da Eq (1)12
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Dove σinc è la sezione trasversale incoerente dell'elemento considerato, k' è la norma del vettore d'onda diffuso, k la norma del vettore d'onda entrante, q (= k - k') il trasferimento di quantità di moto, r j(t) il vettore posizione dell'atomo j al tempo t e ω la frequenza corrispondente al trasferimento di energia tra il neutrone entrante e il sistema. Le parentesi angolari indicano la media dell'ensemble. Quindi, lo scattering incoerente sonda l'autocorrelazione delle singole particelle mediata dall'insieme delle posizioni degli atomi con il tempo e fornisce l'autodinamica mediata su tutti gli atomi nel sistema e le diverse origini temporali (media dell'insieme). La funzione di scattering è la trasformata di Fourier nel tempo della funzione di scattering intermedia I(q, t), che può essere vista come la trasformata di Fourier nello spazio della funzione di correlazione di van Hove mostrata da Eq (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Dove ρ(r,t) è la densità di probabilità di trovare un atomo in posizione r e tempo t 13.
Per un processo di diffusione di Fick, la funzione di autodiffusione risulta (vedi Eq (3)) dopo una doppia trasformata di Fourier in una funzione di scattering consistente in un lorentziano di larghezza di linea data da γ = Dq2.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq10.jpg" style="margin: auto;"> (3)
Sono stati sviluppati e trovati utili modelli più sofisticati come il modello di diffusione a salto di Singwi e Sjölander per la dinamica interna delle proteine ps-ns14 o il modello di rotazione di Sears per l'acqua di idratazione15,16,17.
Sullo strumento di retrodiffusione neutronica (NBS) IN16B 8,9 presso l'ILL, Grenoble, Francia (Figura supplementare S1), una configurazione comunemente usata con le proteine è costituita da cristalli di Si 111 per gli analizzatori con un drive Doppler per la regolazione della lunghezza d'onda in entrata (Figura supplementare S2A), dando così accesso all'intervallo di trasferimento della quantità di moto ~0,2 Å-1 &lt; q &lt; ~2 Å-1 e intervallo di trasferimento di energia di -30 μeV &lt; <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> &lt; 30 μeV, corrispondenti a scale temporali che vanno da pochi ps a pochi ns e distanze di pochi Å. Inoltre, IN16B offre la possibilità di eseguire scansioni elastiche e anelastiche a finestra fissa (E/IFWS)10, che includono l'acquisizione dei dati a un trasferimento di energia fisso. Poiché il flusso è limitato quando si lavora con neutroni, E/IFWS consente di massimizzare il flusso per un trasferimento di energia, riducendo così il tempo di acquisizione necessario per ottenere un soddisfacente rapporto segnale-rumore. Un'opzione più recente è il backscattering and time-of-flight spectrometer (BATS) mode11, che consente la misurazione di un'ampia gamma di trasferimenti di energia, (ad esempio, -150 μeV &lt; &lt; <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63664/63664eq03.jpg" style="margin: auto;"> 150 μeV), con un flusso più elevato rispetto al Doppler, ma al costo di una risoluzione energetica inferiore (Figura supplementare S2B).
Una proprietà importante dello scattering neutronico è che la sezione d'urto incoerente σinc ha un valore 40 volte superiore per l'idrogeno che per il deuterio ed è trascurabile per altri elementi che si trovano comunemente nei campioni biologici. Pertanto, la dinamica delle proteine in un ambiente liquido può essere studiata utilizzando un tampone deuterato e lo stato della polvere consente lo studio della dinamica interna delle proteine con polvere proteica idrogenata idratata conD 2 O, o lo studio dell'acqua di idratazione per proteine perdeuterate in polvere idratate con H2O. Allo stato liquido, la retrodiffusione neutronica consente tipicamente l'accesso simultaneo all'autodiffusione del centro di massa delle proteine (diffusione di tipo Fickiano) e alla loro dinamica interna. Questi ultimi sono movimenti della spina dorsale e della catena laterale solitamente descritti dal cosiddetto modello di diffusione del salto o altri 3,18. Nelle polveri proteiche idrogenate, la diffusione proteica è assente e deve essere modellata solo la dinamica interna. Per l'acqua di idratazione, i contributi dei moti traslazionali e rotazionali delle molecole d'acqua presentano una diversa dipendenza dal trasferimento di quantità di moto q, che consente la loro distinzione nel processo di analisi dei dati17.
Questo articolo illustra il metodo di retrodiffusione neutronica con lo studio di proteine che sono risultate in grado di dispiegarsi, aggregarsi in una forma canonica costituita da pile di β-filamenti - il cosiddetto modello di β incrociato19,20 - e formare fibre allungate. Si tratta della cosiddetta aggregazione amiloide, ampiamente studiata per il suo ruolo centrale nelle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer o il Parkinson21,22. Lo studio delle proteine amiloidi è anche motivato dal ruolo funzionale che possono svolgere 23,24 o dal loro elevato potenziale per lo sviluppo di nuovi biomateriali25. I determinanti fisico-chimici dell'aggregazione amiloide rimangono poco chiari e non è disponibile alcuna teoria generale dell'aggregazione amiloide, nonostante gli enormi progressi compiuti negli ultimi anni21,26.
L'aggregazione amiloide implica cambiamenti nella struttura e nella stabilità delle proteine nel tempo, il cui studio implica naturalmente dinamiche, legate alla stabilità della conformazione delle proteine, alla funzione proteica e al panorama energetico delle proteine27. La dinamica è direttamente collegata alla stabilità di uno stato specifico attraverso il contributo entropico per i moti più veloci28, e la funzione proteica può essere sostenuta da movimenti su varie scale temporali da sub-ps per proteine sensibili alla luce29 a ms per movimenti di dominio, che possono essere facilitati dalla dinamica picosecondo-nanosecondo30.
Saranno presentati due esempi di utilizzo della spettroscopia di retrodiffusione neutronica per studiare le proteine amiloidi, uno allo stato liquido per studiare la dinamica delle proteine e uno allo stato di polvere idratata per studiare la dinamica dell'acqua di idratazione. Il primo esempio riguarda l'aggregazione del lisozima in sfere di dimensioni μm (chiamate particolato) seguite in tempo reale5, e il secondo un confronto della dinamica dell'acqua negli stati nativi e aggregati della proteina umana tau31.
Il lisozima è un enzima coinvolto nella difesa immunitaria ed è composto da 129 residui di aminoacidi. Il lisozima può formare particolato in tampone deuterato a pD di 10,5 e ad una temperatura di 90 °C. Con lo scattering neutronico, abbiamo dimostrato che l'evoluzione temporale del coefficiente di diffusione del centro di massa del lisozima segue la singola cinetica esponenziale della fluorescenza T della tioflavina (una sonda fluorescente utilizzata per monitorare la formazione di modelli di β incrociato amiloide32), indicando che le sovrastrutture particolate di formazione e i modelli di cross-β si verificano in un unico passaggio con la stessa velocità. Inoltre, la dinamica interna è rimasta costante durante tutto il processo di aggregazione, che può essere spiegato sia da un rapido cambiamento conformazionale che non può essere osservato sugli strumenti NBS, sia dall'assenza di cambiamenti significativi nell'energia interna della proteina dopo l'aggregazione.
La proteina umana tau è una proteina intrinsecamente disordinata (IDP) costituita da 441 aminoacidi per la cosiddetta isoforma 2N4R, che è particolarmente coinvolta nella malattia di Alzheimer33. Utilizzando la retrodiffusione neutronica su polveri di proteina tau perdeuterata, abbiamo dimostrato che la dinamica dell'acqua di idratazione è aumentata allo stato di fibra, con una maggiore popolazione di molecole d'acqua sottoposte a movimenti traslazionali. Il risultato suggerisce che un aumento dell'entropia dell'acqua di idratazione potrebbe guidare la fibrillazione amiloide della tau.

<table><tbody><tr><td>Supporto per</td><td></td><td></td> campioni in alluminio <td>Non disponibile in commercio. Il referente locale sullo strumento può fornirglieli oppure possono essere prodotti sulla base di un disegno tecnico che può essere fornito dal referente locale.</td></tr><tr><td>Cloruro di deuterio, 35 % in peso in D2O, &ge; 99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> 543047</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio (D, 99,9%)</td><td>Eurisotop</td><td>DLM-4DR-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning grasso siliconico per alto vuoto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%, EMSURE Reag. </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.5901</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore in vetro</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 75871-660</td><td></td></tr><tr><td>Piastra essiccante in vetro, 140 mm</td><td>VWR</td><td>89038-068</td><td></td></tr><tr><td>Filo di indio, diametro 1,0 mm (0,04 pollici), Puratronic, 99,999%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>00470.G1</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima da albume d'uovo di gallina dializzato, liofilizzato, polvere, ~100.000 U/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62970</td><td></td></tr><tr><td>nPDyn</td><td></td><td>v3.x</td><td>vedi github.com/kpounot/nPDyn, funzioni del modello per il montaggio incluso anche nel software</td></tr><tr><td>OHAUS AX324 Bilancia Adventurer, calibrazione interna</td><td>Dutscher</td><td>92641</td><td></td></tr><tr><td>Anidride fosforica, ReagentPlus, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214701</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta ErgoOne 0,5-10 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S7100-0510</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta ErgoOne 100-1.000 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta ErgoOne 20-200 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S7100-2200</td><td></td></tr><tr><td>Puntale per pipetta TipOne 1.000 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Puntale per pipetta TipOne 10 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-3200</td><td></td></tr><tr><td>Puntale per pipetta TipOne 200 &mu; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di deuterossido di sodio, 40 % in peso in D2O, 99,5 % atomi D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372072</td><td></td></tr></tbody></table>

spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Lo scattering neutronico offre la possibilità di sondare la dinamica all'interno dei campioni per una vasta gamma di energie in modo non distruttivo e senza etichettatura diversa dal deuterio. In particolare, la spettroscopia di retrodiffusione neutronica registra i segnali di scattering a più angoli di scattering simultaneamente ed è adatta per studiare la dinamica dei sistemi biologici sulla scala temporale ps-ns. Impiegando D2O-e possibilmente componenti tampone deuterati, il metodo consente il monitoraggio sia della diffusione del centro di massa che dei movimenti della spina dorsale e della catena laterale (dinamica interna) delle proteine allo stato liquido.
Inoltre, la dinamica dell'acqua di idratazione può essere studiata impiegando polveri di proteine perdeuterate idratate con H2O. Questo documento presenta il flusso di lavoro impiegato sullo strumento IN16B presso l'Institut Laue-Langevin (ILL) per studiare la dinamica delle proteine e dell'idratazione dell'acqua. Viene spiegata la preparazione di campioni di soluzione e campioni di polvere proteica idrata utilizzando lo scambio di vapore. La procedura di analisi dei dati per la dinamica delle proteine e dell'acqua di idratazione è descritta per diversi tipi di set di dati (spettri quasielastici o scansioni a finestra fissa) che possono essere ottenuti su uno spettrometro di retrodiffusione di neutroni.
Il metodo è illustrato con due studi che coinvolgono proteine amiloidi. L'aggregazione del lisozima in aggregati sferici di dimensioni μm - particolato indicato - è dimostrato che avviene in un processo in un'unica fase sull'intervallo di spazio e tempo sondato su IN16B, mentre la dinamica interna rimane invariata. Inoltre, la dinamica dell'acqua di idratazione della tau è stata studiata su polveri idratate di proteine perdeuterate. È dimostrato che i movimenti traslazionali dell'acqua si attivano sulla formazione di fibre amiloidi. Infine, vengono discussi i passaggi critici del protocollo su come lo scattering neutronico è posizionato per quanto riguarda lo studio della dinamica rispetto ad altri metodi biofisici sperimentali.

L'aggregazione del lisozima in particolato è stata effettuata a 90 °C con una concentrazione proteica di 50 mg/ml in un tampone deuterato (0,1 M NaCl a pD 10,5). La formazione di particolato è innescata dall'aumento della temperatura a 90 °C e avviene entro 6 ore (figura supplementare S8). L'acquisizione dei dati è stata eseguita su IN16B, come descritto nel protocollo sopra (i dati sono curati in modo permanente dall'ILL e accessibili a http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
<p class="jove_co...

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

La retrodiffusione neutronica misura la diffusione globale e la dinamica interna delle proteine e dell'acqua di idratazione senza danni da radiazioni. La spettroscopia neutronica accede simultaneamente alle correlazioni spaziali e temporali a livello molecolare. Nella materia soffice e nei materiali biologici, è particolarmente interessante ottenere informazioni indirette sull'ordine locale su questi sistemi di disordine a lungo raggio.Quindi la retrodiffusione dei neutroni può essere utilizzata per studiare le dinamiche in biologia, chimica o senso materiale. Un altro campo forte è l'energia, con studi, ad esempio, su batterie e celle a combustibile. La retrodiffusione neutronica è stata utilizzata con successo per studiare la dinamica molecolare delle proteine coinvolte in malattie neurodegenerative come l'Alzheimer e il Parkinson.I risultati ottenuti ci aiutano a comprendere meglio le caratteristiche molecolari di queste patologie e potrebbero aprire la strada allo sviluppo di una migliore diagnostica. Per preparare il portacampioni, iniziare pulendo accuratamente un portacampioni piatto in alluminio e la sua guarnizione in filo di indio e viti con acqua, seguita da etanolo, quindi lasciarlo asciugare. Pesare separatamente le diverse parti del portacampioni, inclusi il fondo, il coperchio e il filo di indio, su una bilancia di precisione.Posizionare il sigillo di filo di indio di un millimetro nella scanalatura della parte inferiore del portacampioni, lasciando una piccola sovrapposizione nel punto in cui le due estremità si uniscono. Aggiungere circa 100 milligrammi di proteine liofilizzate in modo tale da riempire la superficie interna della parte inferiore del portacampioni. Quindi, posizionare il portacampioni in un essiccatore con una capsula di Petri contenente polvere di anidride fosforica per 24 ore per asciugare completamente la polvere proteica.Pesare la parte inferiore essiccata del portacampioni contenente il sigillo di indio e la polvere essiccata per ottenere la massa del campione essiccato. Rimuovere il pentossido di fosforo dall'essiccatore e mettere una capsula di Petri con ossido di deuterio e il campione all'interno per idratare la polvere. Ripetere l'essiccazione e l'idratazione tre volte per completare lo scambio da idrogeno a deuterio.Misurare regolarmente la massa di polvere per controllare il livello di idratazione e quando l'idratazione è leggermente superiore al livello desiderato, attendere che la massa diminuisca lentamente. Una volta ottenuta l'idratazione desiderata, posizionare rapidamente il coperchio sulla parte inferiore e chiudere prima il portacampioni con quattro viti per interrompere lo scambio di vapore. Posizionare e serrare tutte le viti rimanenti fino a quando non è visibile alcuno spazio tra la parte inferiore e il coperchio.Pesare il portacampioni sigillato per verificare eventuali perdite di idratazione dovute a perdite dopo l'esperimento neutronico. Per preparare il campione allo stato liquido, sciogliere la proteina nel tampone deuterato. Utilizzando acqua, determinare il volume appropriato di liquido da inserire nel portacampioni.Prima di manipolare qualsiasi materiale, assicurarsi che la dose di radiazioni ionizzanti sia inferiore a 100 microsievert all'ora. Quindi, asciugare accuratamente lo stick del campione e rimuovere qualsiasi campione precedente. Posizionare il campione sul bastoncino del campione, verificare la corretta centratura rispetto al centro del fascio e inserire il bastoncino del campione nel forno criogenico.Per acquisire dati in Nomad, vai alla scheda di esecuzione e trascina e rilascia un controller di criostato del forno nella rampa di lancio. Impostare la temperatura su 200 Kelvin. Utilizzare la modalità veloce e un timeout di 30 minuti in modo che la temperatura abbia il tempo di stabilizzarsi.Fare clic sull'icona di aggiornamento per eseguire la rampa di temperatura in background per l'acquisizione dei dati durante la diminuzione della temperatura. Trascinare e rilasciare il controller delle impostazioni Doppler IN16 nella finestra di avvio. Impostare il profilo di velocità su velocità precisa, l'impostazione di al delta massimo E, l'offset di energia a 0,00 micro elettronvolt e il numero di canali su 128 per ottenere una configurazione elastica di scansioni fisse della finestra.Trascina e rilascia un controller di conteggio nella rampa di avvio, compila il campo dei sottotitoli con un nome che consenta una facile identificazione dei dati e imposta scansioni di 30 secondi con 60 ripetizioni. Quindi, trascina e rilascia il controller delle impostazioni Doppler IN16 nella finestra di avvio. Impostare il profilo di velocità da firmare, l'impostazione di velocità con un valore di 4,5 metri al secondo e il numero di canali a 2048 per ottenere una configurazione di scattering neutronico quasi elastica.Trascina e rilascia un controller di conteggio e compila il campo dei sottotitoli con un nome che consenta una facile identificazione dei dati. Imposta scansioni di 30 minuti con quattro ripetizioni. Per la rampa di temperatura, trascinare e rilasciare un controller di criostato del forno, impostare la temperatura su 310 Kelvin e impostare la rampa sul set point con un delta di 0,05 Kelvin per sei secondi.Utilizzare un timeout di 200 minuti. Usa un ciclo for con 65 ripetizioni. All'interno, inserire un controller delle impostazioni doppler IN16, seguito dal controller di conteggio e impostare una singola scansione di 30 secondi.Successivamente, inserire le impostazioni Doppler IN16 come descritto in precedenza, ma utilizzando un offset di energia di 1,5 micro elettronvolt e 1024 canali. Quindi, inserire il controller di conteggio e impostare una singola scansione di tre minuti. Per acquisire l'ultimo scattering neutronico quasi elastico di 312 Kelvin, trascinare e rilasciare le impostazioni Doppler IN16 e i controller di conteggio configurati come dimostrato in precedenza.Quindi, premere il pulsante Start per eseguire lo script. Le scansioni a finestra fissa elastica e anelastica del lisosoma hanno mostrato un aumento del segnale a basso trasferimento di quantità di moto e basso trasferimento di energia, mentre il segnale a trasferimento di alta energia e basso trasferimento di quantità di moto è diminuito. Il coefficiente iniziale di diffusione del centro di massa era di 15 angstrom quadrati per nanosecondo, che poi diminuiva esponenzialmente nel tempo.A temperature superiori a 220 Kelvin, l'acqua di idratazione intorno alle fibre tau era significativamente più mobile rispetto ai monomeri tau. La frazione di molecole d'acqua sottoposte a movimento traslazionale e i coefficienti di diffusione traslazionale e di rotazione delle molecole d'acqua sono stati aumentati attorno alle fibre. La concentrazione proteica deve essere di 2000 milligrammi per ml o di almeno 20 milligrammi per ml per le proteine proteinate a causa delle limitazioni di retrodiffusione dei neutroni dovute al flusso neutronico o al fondo tampone del supporto del campione.Il retroscattering neutronico è stato recentemente applicato, ad esempio, per capire come l'acqua, che è la proteina ambientale naturale, possa essere completamente sostituita da un polimero sintetico per applicazioni biotecnologiche come, ad esempio, la somministrazione di farmaci.

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Scopri la spettroscopia neutronica per studiare la dinamica delle proteine amiloidi e dell'acqua di idratazione. Questo metodo non distruttivo aiuta a comprendere le malattie neurodegenerative.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dellacqua di idratazione (Video) | JoVE Journal

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

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