Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

La retrodiffusione neutronica misura la diffusione globale e la dinamica interna delle proteine e dell'acqua di idratazione senza danni da radiazioni. La spettroscopia neutronica accede simultaneamente alle correlazioni spaziali e temporali a livello molecolare. Nella materia soffice e nei materiali biologici, è particolarmente interessante ottenere informazioni indirette sull'ordine locale su questi sistemi di disordine a lungo raggio.

Quindi la retrodiffusione dei neutroni può essere utilizzata per studiare le dinamiche in biologia, chimica o senso materiale. Un altro campo forte è l'energia, con studi, ad esempio, su batterie e celle a combustibile. La retrodiffusione neutronica è stata utilizzata con successo per studiare la dinamica molecolare delle proteine coinvolte in malattie neurodegenerative come l'Alzheimer e il Parkinson.

I risultati ottenuti ci aiutano a comprendere meglio le caratteristiche molecolari di queste patologie e potrebbero aprire la strada allo sviluppo di una migliore diagnostica. Per preparare il portacampioni, iniziare pulendo accuratamente un portacampioni piatto in alluminio e la sua guarnizione in filo di indio e viti con acqua, seguita da etanolo, quindi lasciarlo asciugare. Pesare separatamente le diverse parti del portacampioni, inclusi il fondo, il coperchio e il filo di indio, su una bilancia di precisione.

Posizionare il sigillo di filo di indio di un millimetro nella scanalatura della parte inferiore del portacampioni, lasciando una piccola sovrapposizione nel punto in cui le due estremità si uniscono. Aggiungere circa 100 milligrammi di proteine liofilizzate in modo tale da riempire la superficie interna della parte inferiore del portacampioni. Quindi, posizionare il portacampioni in un essiccatore con una capsula di Petri contenente polvere di anidride fosforica per 24 ore per asciugare completamente la polvere proteica.

Pesare la parte inferiore essiccata del portacampioni contenente il sigillo di indio e la polvere essiccata per ottenere la massa del campione essiccato. Rimuovere il pentossido di fosforo dall'essiccatore e mettere una capsula di Petri con ossido di deuterio e il campione all'interno per idratare la polvere. Ripetere l'essiccazione e l'idratazione tre volte per completare lo scambio da idrogeno a deuterio.

Misurare regolarmente la massa di polvere per controllare il livello di idratazione e quando l'idratazione è leggermente superiore al livello desiderato, attendere che la massa diminuisca lentamente. Una volta ottenuta l'idratazione desiderata, posizionare rapidamente il coperchio sulla parte inferiore e chiudere prima il portacampioni con quattro viti per interrompere lo scambio di vapore. Posizionare e serrare tutte le viti rimanenti fino a quando non è visibile alcuno spazio tra la parte inferiore e il coperchio.

Pesare il portacampioni sigillato per verificare eventuali perdite di idratazione dovute a perdite dopo l'esperimento neutronico. Per preparare il campione allo stato liquido, sciogliere la proteina nel tampone deuterato. Utilizzando acqua, determinare il volume appropriato di liquido da inserire nel portacampioni.

Prima di manipolare qualsiasi materiale, assicurarsi che la dose di radiazioni ionizzanti sia inferiore a 100 microsievert all'ora. Quindi, asciugare accuratamente lo stick del campione e rimuovere qualsiasi campione precedente. Posizionare il campione sul bastoncino del campione, verificare la corretta centratura rispetto al centro del fascio e inserire il bastoncino del campione nel forno criogenico.

Per acquisire dati in Nomad, vai alla scheda di esecuzione e trascina e rilascia un controller di criostato del forno nella rampa di lancio. Impostare la temperatura su 200 Kelvin. Utilizzare la modalità veloce e un timeout di 30 minuti in modo che la temperatura abbia il tempo di stabilizzarsi.

Fare clic sull'icona di aggiornamento per eseguire la rampa di temperatura in background per l'acquisizione dei dati durante la diminuzione della temperatura. Trascinare e rilasciare il controller delle impostazioni Doppler IN16 nella finestra di avvio. Impostare il profilo di velocità su velocità precisa, l'impostazione di al delta massimo E, l'offset di energia a 0,00 micro elettronvolt e il numero di canali su 128 per ottenere una configurazione elastica di scansioni fisse della finestra.

Trascina e rilascia un controller di conteggio nella rampa di avvio, compila il campo dei sottotitoli con un nome che consenta una facile identificazione dei dati e imposta scansioni di 30 secondi con 60 ripetizioni. Quindi, trascina e rilascia il controller delle impostazioni Doppler IN16 nella finestra di avvio. Impostare il profilo di velocità da firmare, l'impostazione di velocità con un valore di 4,5 metri al secondo e il numero di canali a 2048 per ottenere una configurazione di scattering neutronico quasi elastica.

Trascina e rilascia un controller di conteggio e compila il campo dei sottotitoli con un nome che consenta una facile identificazione dei dati. Imposta scansioni di 30 minuti con quattro ripetizioni. Per la rampa di temperatura, trascinare e rilasciare un controller di criostato del forno, impostare la temperatura su 310 Kelvin e impostare la rampa sul set point con un delta di 0,05 Kelvin per sei secondi.

Utilizzare un timeout di 200 minuti. Usa un ciclo for con 65 ripetizioni. All'interno, inserire un controller delle impostazioni doppler IN16, seguito dal controller di conteggio e impostare una singola scansione di 30 secondi.

Successivamente, inserire le impostazioni Doppler IN16 come descritto in precedenza, ma utilizzando un offset di energia di 1,5 micro elettronvolt e 1024 canali. Quindi, inserire il controller di conteggio e impostare una singola scansione di tre minuti. Per acquisire l'ultimo scattering neutronico quasi elastico di 312 Kelvin, trascinare e rilasciare le impostazioni Doppler IN16 e i controller di conteggio configurati come dimostrato in precedenza.

Quindi, premere il pulsante Start per eseguire lo script. Le scansioni a finestra fissa elastica e anelastica del lisosoma hanno mostrato un aumento del segnale a basso trasferimento di quantità di moto e basso trasferimento di energia, mentre il segnale a trasferimento di alta energia e basso trasferimento di quantità di moto è diminuito. Il coefficiente iniziale di diffusione del centro di massa era di 15 angstrom quadrati per nanosecondo, che poi diminuiva esponenzialmente nel tempo.

A temperature superiori a 220 Kelvin, l'acqua di idratazione intorno alle fibre tau era significativamente più mobile rispetto ai monomeri tau. La frazione di molecole d'acqua sottoposte a movimento traslazionale e i coefficienti di diffusione traslazionale e di rotazione delle molecole d'acqua sono stati aumentati attorno alle fibre. La concentrazione proteica deve essere di 2000 milligrammi per ml o di almeno 20 milligrammi per ml per le proteine proteinate a causa delle limitazioni di retrodiffusione dei neutroni dovute al flusso neutronico o al fondo tampone del supporto del campione.

Il retroscattering neutronico è stato recentemente applicato, ad esempio, per capire come l'acqua, che è la proteina ambientale naturale, possa essere completamente sostituita da un polimero sintetico per applicazioni biotecnologiche come, ad esempio, la somministrazione di farmaci.