Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie

Combiniamo la microdissezione a cattura laser con un protocollo di ricerca dell'RNA a singola cellula chiamato CEL-Seq2 per generare set di dati trascrittomici per piccoli campioni di tessuto individuale. Questa tecnica ci consente di studiare l'espressione genica in tessuti o specie che non possono essere studiati utilizzando metodi tradizionali di selezione cellulare. Inoltre, fornisce più specificità rispetto a un approccio RNA-seq di massa.

Qui abbiamo dimostrato questa tecnica per le quattro punte della coda cellule dei maschi del quarto stadio larvale di C.elegans e degli ermafroditi. Ma la bellezza di questo approccio è che può essere applicato anche a specie non modello. A dimostrare la procedura saranno la signora Raya Jallad, dottoranda del mio laboratorio e il dottor Antonio Herrera, attualmente scienziato biomedico capo presso la scuola Baylor di Chattanooga, Tennessee.

Iniziare pipettando delicatamente da uno a due millilitri di tampone M9 contro la parete della piastra senza schizzare. Ruotare la piastra per rimuovere i vermi. Rimuovere e scartare tutto il liquido e i vermi posizionando la punta della pipetta contro la parete della piastra sul bordo dell'agar per evitare di bucare.

Questo video mostra il piatto prima che le madri e la larva vengano rimosse. Solo gli embrioni dovrebbero essere lasciati dopo che le madri e la larva sono state rimosse. La larva L1 inizierà ad apparire dopo l'incubazione per un'ora o giù di lì.

Quindi posizionare la piastra a 25 gradi Celsius. Dopo un'ora, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Lascia cadere con attenzione un millilitro di tampone M9 sull'agar e fai roteare la piastra per rimuovere gli L1 ma non gli embrioni.

Centrifugare il tubo e pipettare gli L1 direttamente sul prato batterico di un piatto seminato. Mantenere i vermi a 25 gradi Celsius. Sotto un microscopio di dissezione con un ingrandimento da 30 a 50 X, inizia a raccogliere i maschi e gli ermafroditi dalle piastre di sincronizzazione su piastre separate non sedute.

I maschi si distinguono dagli ermafroditi per la forma sporgente e il colore più chiaro delle code maschili rispetto alla forma appuntita e al colore più scuro delle code ermafrodite. Lavare i vermi dalla piastra con uno o due millilitri di tampone M9 utilizzando una punta della pipetta pre-lavata con tampone M9 contenente lo 0,01% di detergente. Trasferire i vermi in un tubo centrifuga da un millilitro, girare per un minuto e aggiungere un millilitro di tampone M9.

Ancora una volta, gira per un minuto. Aggiungere un millilitro di metanolo ghiacciato al 70% e mescolare bene. Ripetere il lavaggio con un millilitro di metanolo, mescolare bene.

Giralo per un minuto e aggiungi 500 microlitri di metanolo al 70%. Mescolare e conservare a quattro gradi Celsius per un'ora o durante la notte. Pipetta 20 microlitri dei vermi fissi sul lato rivestito di un vetrino in polietilene naftalato o membrana PEN.

Attendere che il metanolo evapori. Rimuovere lo scudo di plastica sul palco e fare clic sul pulsante di scarico con la freccia verso l'alto per caricare le diapositive della membrana. Assicurarsi che la diapositiva sia completamente asciutta, capovolgere in modo che la membrana sia rivolta verso il basso e inserire la diapositiva.

Fate clic su Continua (Continue) nella finestra cambia campione(Change Specimen). Il supporto della diapositiva si muoverà. Quindi sostituire lo scudo di plastica, nella parte inferiore dello schermo, scegliere quale porta diapositiva contiene la diapositiva e fare clic sul pulsante di scarico con la freccia verso il basso per caricare i tubi.

Estrarre il vassoio e rimuovere il blocco del tubo. Inserire i tappi dei tubi di quattro tubi PCR da 500 microlitri nel supporto e piegare il tubo sotto. Riportare il blocco sul vassoio e riportarlo nella fase del microscopio.

Nella finestra popup del dispositivo di raccolta delle modifiche, selezionare i tubi PCR e fare clic su OK. Fare clic sulla posizione del tubo vuoto in basso a sinistra dello schermo sotto i tappi del tubo del dispositivo di raccolta e nel pannello di controllo del microscopio selezionare TLBF per l'illuminazione del campo luminoso della luce trasmessa. Utilizzando l'obiettivo 2,5X, regolare la messa a fuoco fino a quando i vermi e la struttura superficiale della membrana PEN sono visibili.

Passa all'obiettivo 20X e sposta il palco in una regione senza vermi. Regolare la messa a fuoco in modo tale che le strutture a bolle nella membrana abbiano un colore giallastro per focalizzare il laser sul piano focale corretto, quindi impostare i parametri laser. Per le punte di coda, iniziare con potenza 45 apertura 30 in velocità 20.

Nel pannello di controllo laser, selezionare Calibra e seguire le istruzioni. Successivamente, nella parte inferiore dello schermo in corrispondenza dei tappi del tubo del dispositivo di raccolta fare clic sulla posizione A, sul lato destro dello schermo selezionare la forma singola, seguita da disegnare e tagliare. Quindi selezionare punto a punto e disegnare una linea.

Fare clic su Avvia taglio in modo che il laser tagli attraverso la membrana. Trova un worm e passa a muoverti e tagliare. Usa il mouse per tagliare la coda.

Per raccogliere il campione, passare all'impostazione di disegno e taglio con la funzione punto a punto e disegnare la forma per completare il taglio di una sezione di membrana. Selezionare il tubo successivo sul cappuccio del tubo del dispositivo di raccolta nella parte inferiore dello schermo e tagliare la punta della coda successiva. Una volta tagliate quattro code, scaricare il portatubi facendo clic su scarica con la freccia verso il basso.

Trova le sezioni della membrana sotto un microscopio di dissezione e continua con l'elaborazione del campione a valle. Qui sequenziamento dell'RNA con CEL-Seq2. Pipettare 1,2 microlitri di una miscela master di primer CEL-Seq2 direttamente sopra il campione e chiudere il tubo.

Etichettare con il numero di primer e posizionare immediatamente il tappo del tubo direttamente su un pezzo di ghiaccio secco per congelare il campione prevenendo così la degradazione dell'RNA. Ripetere l'operazione fino a quando tutti i campioni non sono stati raccolti. Infine conservare i tubi a meno 70 gradi Celsius.

C.elegans L3 ermafroditi e maschi a 21-23 ore dopo la schiusa possono essere distinti al microscopio di dissezione dalla morfologia delle loro code. La storia dell'ermafrodita è stretta mentre quella dei maschi è gonfia e appare chiara. L'aspetto della struttura a scorrimento della membrana PEN e della coda a vite senza fine è mostrato in queste immagini.

Qui la messa a fuoco è corretta per le lenti 20X e 40X al microscopio. La coda sezionata taglia in modo imparziale la membrana PEN è visibile qui. Dopo aver chiuso lo spazio nel taglio, il pezzo di membrana cadrà nel cappuccio del tubo sotto la diapositiva.

Un cappuccio tubolare con una sezione a membrana PEN contenente una punta della coda sezionata è mostrato qui. L'immagine grafica rappresenta l'identificatore molecolare univoco trasformato in log naturale o conteggi UMI per singola punta di coda per diversi punti temporali e sessi. Il software powsimR viene utilizzato per determinare quanti campioni indipendenti sono necessari per rilevare geni differenziali espressi o DE a vari livelli di espressione.

L'immagine grafica qui rappresenta il vero tasso positivo per rilevare i geni DE tra due condizioni per quattro diverse simulazioni che incorporano diverse dimensioni del campione per condizione. La linea tratteggiata indica un tasso positivo reale dell'80%. Il tasso di falsa scoperta e le stesse quattro simulazioni sono mostrate qui.

La linea tratteggiata indica un tasso di falsa scoperta del 10%. I grafici hanno mostrato che una dimensione del campione di 70 punte di coda per condizione è sufficiente per rilevare i geni DE ad eccezione dei geni con livelli di espressione molto bassi. Per una corretta sincronizzazione, assicurarsi che solo gli embrioni siano presenti sulla piastra.

Per evitare la perdita del campione, pipettare la miscela di primer direttamente sulla sezione della membrana PEN nel cappuccio ed essere estremamente delicati nella chiusura del tappo. Poiché è indipendente dalla specie, possiamo usare questo protocollo per esplorare come le reti di regolazione genica si sono evolute per le strutture omologhe in diverse specie.