Name: Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Impara la microdissezione laser con CEL-Seq2 per analisi trascrittomica di tessuti singoli in Caenorhabditis elegans. Questo metodo consente studi di espressione genica su specie non modello senza strumenti genetici specifici.

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Questo lavoro è stato finanziato da NIH (R01GM141395) e NSF (1656736) sovvenzioni a DF e NIH fellowship (F32GM136170) ad AW. La Figura 1 è stata creata con l'aiuto di BioRender.com.

<ol><li>Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+%26%2334%3Bthe+worm%26%2334%3B+to+%26%2334%3Bthe+worms%26%2334%3B+and+back+again%3A+the+evolutionary+developmental+biology+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">From &#34;the worm&#34; to &#34;the worms&#34; and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes.</a> Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).</li>
<li>Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+model+systems+in+evolution+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nematode model systems in evolution and development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).</li>
<li>WormBase. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormbase.org/#012-3-6">https://wormbase.org/#012-3-6</a> (2022).</li>
<li>WormAtlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormatlas.org">https://wormatlas.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://wormbook.org">http://wormbook.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook in Genetics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook">https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook</a> (2022).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Kaletsky, R., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+C.+elegans+adult+cells+and+tissues+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 365 (6459), 1971(2019).</li>
<li>Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bulk%3A+a+review+of+single+cell+transcriptomics+methodologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).</li>
<li>Von Stetina, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+microarray+profiling+experiments+reveal+a+comprehensive+picture+of+gene+expression+in+the+C.+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system.</a> Genome Biology. 8 (7), 135(2007).</li>
<li>Baugh, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+PAL-1+specifies+a+lineage-specific+regulatory+network+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo.</a> Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).</li>
<li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3%27-end-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS One. 6 (4), 19505(2011).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Yanai, I., Hashimshony, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2-single-cell+RNA+sequencing+by+multiplexed+linear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification.</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+grow+or+not+to+grow%3A+nutritional+control+of+development+during+Caenorhabditis+elegans+L1+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest.</a> Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+responses+throughout+the+Caenorhabditis+elegans+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle.</a> Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+defined+sub-stages+of+C.+elegans+vulval+development+in+the+fourth+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage.</a> BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).</li>
<li>Lytal, N., Ran, D., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+methods+on+single-cell+RNA-seq+data%3A+an+empirical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey.</a> Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).</li>
<li>Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((powsimR%3A+power+analysis+for+bulk+and+single+cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).</li>
<li>Bolkova, J., Lanctot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+expression+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+using+single+molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH.</a> Methods. 98, 42-49 (2016).</li>
<li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+of+C.+elegans+worms+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).</li>
<li>Baird, S. E., Chamberlin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+briggsae+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis briggsae methods.</a> WormBook. , 1-9 (2006).</li>
<li>Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+tipulae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Oscheius tipulae.</a> WormBook. , 1-8 (2006).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transgenesis+efficiency+and+CRISPR-associated+tools+through+codon+optimization+and+native+intron+addition+in+Pristionchus+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes.</a> Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).</li>
<li>Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+dissociation+protocol+for+FACS-based+isolation+of+rare+cell+types+from+Caenorhabditis+elegans+L1+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae.</a> MethodsX. 7, 100922(2020).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
<li>Steiner, F. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+affinity+purification+of+nuclei+for+chromatin+profiling+in+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).</li>
<li>Ebbing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).</li>
<li>Rödelsperger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+nematodes+identifies+sperm+cells+as+a+source+of+genomic+novelty+and+rapid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution.</a> Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Passaggi critici del metodo Se eseguito correttamente, il metodo qui descritto otterrà profili di RNA robusti con un numero relativamente piccolo di campioni sezionati al laser (70 punte di coda in questo esempio). Tuttavia, per i campioni provenienti da animali in via di sviluppo, una stretta sincronizzazione è fondamentale per ridurre la variabilità tra i campioni. Per questo motivo, il protocollo consiglia il metodo hatch-off per la sincronizzazione worm. Qui, il ricercatore può determinare e contr...

I nematodi, in particolare i nematodi rabditidi correlati al sistema modello Caenorhabditis elegans, sono un meraviglioso gruppo di animali per la biologia evolutiva dello sviluppo (EDB) per molte ragioni 1,2. I vantaggi includono il loro piccolo numero di cellule, lignaggi cellulari definiti e coerenti, la trasparenza e la facilità di coltura e allevamento. Ci sono anche molte risorse disponibili, tra cui genomi di alta qualità per più specie e per C. elegans, ampi strumenti genetici molecolari e conoscenze sullo sviluppo, la genetica, l'anatomia e la fisiologia 3,4,5,6.
Come per molti altri organismi, la capacità di caratterizzare la dinamica del trascrittoma in singoli tessuti o singole cellule ha rivoluzionato l'analisi dello sviluppo in C. elegans 7,8,9,10. Essere in grado di confrontare i trascrittomi unicellulari tra i nematodi trasformerebbe allo stesso modo l'EDB usando questi organismi. Ad esempio, tali confronti fornirebbero informazioni su come le reti di regolazione genica si sono evolute per i caratteri (tratti) che sono stati conservati, per i caratteri che si sono divergenti o per i caratteri che si sono evoluti in modo indipendente.

Tuttavia, isolare particolari tessuti o cellule dai nematodi è una delle grandi sfide. Per molti organismi, le singole cellule possono essere dissociate dai tessuti e raccolte in modo imparziale o possono essere etichettate con l'espressione tessuto-specifica di una proteina fluorescente e ordinate mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)11. In C. elegans, l'isolamento ad alto rendimento (HTP) delle cellule è stato limitato principalmente agli embrioni perché la cuticola esterna dura (e lo scheletro idrostatico) ha ostacolato l'isolamento cellulare da larve e adulti. Per aggirare questa sfida, alcuni metodi hanno impiegato strumenti genetici in interi vermi C. elegans, come l'mRNA12 specifico del tessuto e i confronti di espressione differenziale tra wild-type e mutanti che colpiscono un tipo di cellula13. Metodi più recenti hanno superato la sfida sciogliendo la cuticola per isolare nuclei14 o intere cellule 8,9,15. L'isolamento cellulare e la coltura cellulare hanno gli ovvi svantaggi, tuttavia, che le cellule vengono rimosse dal loro naturale contesto di sviluppo o anatomico , ad esempio lontano dalla segnalazione cellula-cellula e dal contatto con la matrice extracellulare - che dovrebbero avere un impatto sul profilo di espressione genica15. Inoltre, gli strumenti genetici e i marcatori tessuto-specifici sono specie-specifici (cioè, possono essere utilizzati solo in C. elegans).
LMD fornisce un metodo alternativo per isolare i tessuti senza interrompere il contesto naturale delle cellule. Significativamente per l'EDB, LMD consente anche di confrontare i trascrittomi di tessuti omologhi di diverse specie senza la necessità di toolkit genetici specie-specifici se sono disponibili sequenze di genoma o intere sequenze di trascrittomi di queste specie. LMD prevede il targeting dei tessuti mediante osservazione microscopica diretta e l'utilizzo di un microfascio laser, integrato nell'ottica del microscopio, per ritagliare e raccogliere (catturare) il tessuto di interesse16. I limiti di LMD sono che non è favorevole ad approcci molto HTP (anche se i profili di trascrizione per le punte di coda, come descritto in questo protocollo, erano robusti con ~ 70 campioni), alcuni campioni potrebbero essere difficili da sezionare e i tagli sono limitati alla precisione del laser e a ciò che può essere visualizzato al microscopio.
Lo scopo del presente protocollo è quello di descrivere come LMD, seguito da RNA-Seq a tessuto singolo, può essere utilizzato per ottenere dati sul trascrittoma specifico dello stadio e del tessuto dai nematodi. In particolare, dimostra LMD per isolare le punte della coda dalle larve del quarto stadio (L4) di C. elegans. Tuttavia, questo metodo può essere adattato ad altri tessuti e, naturalmente, a specie diverse.
In C. elegans, ci sono 4 cellule che fanno la punta della coda sia nei maschi che negli ermafroditi. Durante lo stadio L4 nei maschi, ma non negli ermafroditi, le cellule della punta della coda cambiano forma e migrano anteriormente e verso l'interno. Questo processo si verifica anche in alcune ma non in tutte le altre specie di nematodi rabditidi. Pertanto, la punta della coda è un buon modello per l'evoluzione della morfogenesi dimorfica sessuale. A causa della sua posizione, la punta della coda è anche facile da isolare da LMD.
Per ottenere profili di trascrittoma dalle punte della coda, il presente protocollo utilizza CEL-Seq2, un metodo RNA-seq sviluppato per singole cellule17,18. Questo metodo ha diversi vantaggi per i tessuti derivati da LMD. CEL-Seq2 è altamente sensibile ed efficiente, utilizzando identificatori molecolari univoci (UMI) per consentire una quantificazione diretta delle letture dell'mRNA, la trascrizione in vitro per garantire l'amplificazione lineare e il codice a barre che consente il multiplexing di singoli campioni di tessuto. L'unica limitazione di CEL-Seq2 è che le letture recuperate sono distorte verso l'estremità 3' degli mRNA, e la maggior parte delle isoforme quindi non può essere distinta.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 0,5 &micro; Vetrini a membrana M PEN 11600288 Leica senza RNasi</td><td></td><td></td><td>per LMD</td></tr><tr><td>500 & micro; L Provette PCR (senza nucleasi)</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>per tagliare le punte della coda in</td></tr><tr><td>Microscopio composto con obiettivo 40x e DIC</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>per controllare l'età dei vermi</td></tr><tr><td>Umidificatore da tavolo</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione con base a luce trasmessa</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>per tutti i lavori con vermi</td></tr><tr><td>Tortette in vetro pasteur</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>manico di plettro</td></tr><tr><td>vetrini e vetrini coprioggetti</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>per controllare l'età dei vermi Sistema di</td></tr><tr><td>microdissezione LMD6</td><td></td><td>Leica multiplo</td><td>per tagliare le punte della coda</td></tr><tr><td>Provette LoBind 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 Ricetta tampone</td><td></td><td></td><td>in WormBook</td></tr><tr><td>Metanolo 99,8%</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>per fissare i vermi</td></tr><tr><td>NGM terreno di crescita</td><td>US Biologico</td><td>N1000</td><td>È necessario aggiungere tamponi e sali: Ricetta in WormBook</td></tr><tr><td>P10 pipetta variablle volume</td><td>, ad es. pipetta Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 volume variabile</td><td>, ad es. pipetta Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 a volume variabile</td>, <td>ad es. puntali per pipette Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &; L</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 1-10 & micro; L filtrato</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filo di platino iridio</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td><td>per rendere</td></tr><tr><td>sterile il worm pick e privo di nucleasi Provette centrfughe da 1 mL</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Aggiungere una quantità molto piccola al tampone M9 per evitare che i vermi si attacchino alle punte della pipetta</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica da 6 mm ventilate</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Per CEL-Seq2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 Sistema TapeStation con reagenti per il rilevamento di RNA e DNA ad alta sensibilità</td><td>Sistema di elettroforesi automatizzato</td><td>Aligent</td><td></td></tr><tr><td>Perline AMPure XP</td><td>Perline Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Perline per la pulizia del DNA Tampone</td></tr><tr><td>legante le perle &nbsp; 20% PEG8000, 2,5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 primer (vedi Tabella S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Termociclatore con coperchio e blocco programmabili per 200 &5; L tubi.</td></tr><tr><td>DNA polimerasi I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>miscela dNTP 10 mM</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA ligasi</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT per la pulizia del prodotto PCR</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>soluzione esonucleasica</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit di trascrizione</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Per la fase 4.6.1</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HF NEB</td><td></td><td>M0531</td><td>PCR mix fase 4.9.7</td></tr><tr><td>hexamer casuale RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>un primer con 6 nucleotidi che sono</td></tr><tr><td>casuali RNA Fragmentation buffer</td><td>NEB</td><td>E6150S Tampone</td><td></td></tr><tr><td>di arresto della frammentazione dell'RNA</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primers (RPI1&ndash; RPI48)</td><td>Illumina, NEB o IDT</td><td></td><td>RPIX nel passaggio del protocollo 4.9.7, sequenze disponibili da Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>o qualsiasi altro prodotto simile</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Inibitore della ribonucleasi</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Tampone del secondo filamento</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>trascrittasi inversa</td></tr></tbody></table>

microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Le metodologie a singola cellula hanno rivoluzionato l'analisi dei trascrittomi di specifici tipi cellulari. Tuttavia, spesso richiedono "toolkit" genetici specie-specifici, come i promotori che guidano l'espressione tessuto-specifica di proteine fluorescenti. Inoltre, i protocolli che interrompono i tessuti per isolare le singole cellule rimuovono le cellule dal loro ambiente nativo (ad esempio, la segnalazione dai vicini) e possono causare risposte allo stress o altre differenze dagli stati di espressione genica nativa. Nel presente protocollo, la microdissezione laser (LMD) è ottimizzata per isolare le singole punte della coda dei nematodi per lo studio dell'espressione genica durante la morfogenesi della punta della coda maschile.
LMD consente l'isolamento di una parte dell'animale senza la necessità di interruzioni cellulari o toolkit specifici per specie ed è quindi applicabile a qualsiasi specie. Successivamente, i protocolli di preparazione della libreria RNA-seq a singola cellula come CEL-Seq2 possono essere applicati a singoli tessuti isolati da LMD e analizzati utilizzando pipeline standard, dato che per la specie è disponibile un genoma o trascrittoma ben annotato. Tali dati possono essere utilizzati per stabilire quanto siano conservati o diversi i trascrittomi che sono alla base dello sviluppo di quel tessuto in specie diverse.
Le limitazioni includono la possibilità di tagliare il tessuto di interesse e la dimensione del campione. Un'analisi di potenza mostra che sono necessarie solo 70 punte di coda per condizione per l'80% di potenza. È necessaria una stretta sincronizzazione dello sviluppo per ottenere questo numero di animali nella stessa fase di sviluppo. Pertanto, viene descritto anche un metodo per sincronizzare gli animali a intervalli di 1 ora.

Dopo la microdissezione di cattura laser, le singole punte della coda di maschi ed ermafroditi a 4 punti temporali (L3 22 h dopo la schiusa; L4 24, 26 e 28 h dopo la schiusa) sono stati preparati per il sequenziamento dell'RNA utilizzando il protocollo CEL-Seq2. I primer CEL-Seq2 contengono codici a barre univoci che consentono di identificare bioinformaticamente le letture di sequenziamento da un particolare campione (in questo caso una singola punta di coda). I dati di sequenziamento sono stati generati con questo meto...

Viene descritto un protocollo che utilizza la microdissezione laser per isolare i singoli tessuti nematodi per il sequenziamento dell'RNA. Il protocollo non richiede toolkit genetici specie-specifici, consentendo di confrontare i profili di espressione genica tra diverse specie a livello di campioni di tessuto singolo.

Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Combiniamo la microdissezione a cattura laser con un protocollo di ricerca dell'RNA a singola cellula chiamato CEL-Seq2 per generare set di dati trascrittomici per piccoli campioni di tessuto individuale. Questa tecnica ci consente di studiare l'espressione genica in tessuti o specie che non possono essere studiati utilizzando metodi tradizionali di selezione cellulare. Inoltre, fornisce più specificità rispetto a un approccio RNA-seq di massa.Qui abbiamo dimostrato questa tecnica per le quattro punte della coda cellule dei maschi del quarto stadio larvale di C.elegans e degli ermafroditi. Ma la bellezza di questo approccio è che può essere applicato anche a specie non modello. A dimostrare la procedura saranno la signora Raya Jallad, dottoranda del mio laboratorio e il dottor Antonio Herrera, attualmente scienziato biomedico capo presso la scuola Baylor di Chattanooga, Tennessee.Iniziare pipettando delicatamente da uno a due millilitri di tampone M9 contro la parete della piastra senza schizzare. Ruotare la piastra per rimuovere i vermi. Rimuovere e scartare tutto il liquido e i vermi posizionando la punta della pipetta contro la parete della piastra sul bordo dell'agar per evitare di bucare.Questo video mostra il piatto prima che le madri e la larva vengano rimosse. Solo gli embrioni dovrebbero essere lasciati dopo che le madri e la larva sono state rimosse. La larva L1 inizierà ad apparire dopo l'incubazione per un'ora o giù di lì.Quindi posizionare la piastra a 25 gradi Celsius. Dopo un'ora, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Lascia cadere con attenzione un millilitro di tampone M9 sull'agar e fai roteare la piastra per rimuovere gli L1 ma non gli embrioni.Centrifugare il tubo e pipettare gli L1 direttamente sul prato batterico di un piatto seminato. Mantenere i vermi a 25 gradi Celsius. Sotto un microscopio di dissezione con un ingrandimento da 30 a 50 X, inizia a raccogliere i maschi e gli ermafroditi dalle piastre di sincronizzazione su piastre separate non sedute.I maschi si distinguono dagli ermafroditi per la forma sporgente e il colore più chiaro delle code maschili rispetto alla forma appuntita e al colore più scuro delle code ermafrodite. Lavare i vermi dalla piastra con uno o due millilitri di tampone M9 utilizzando una punta della pipetta pre-lavata con tampone M9 contenente lo 0,01% di detergente. Trasferire i vermi in un tubo centrifuga da un millilitro, girare per un minuto e aggiungere un millilitro di tampone M9.Ancora una volta, gira per un minuto. Aggiungere un millilitro di metanolo ghiacciato al 70% e mescolare bene. Ripetere il lavaggio con un millilitro di metanolo, mescolare bene.Giralo per un minuto e aggiungi 500 microlitri di metanolo al 70%. Mescolare e conservare a quattro gradi Celsius per un'ora o durante la notte. Pipetta 20 microlitri dei vermi fissi sul lato rivestito di un vetrino in polietilene naftalato o membrana PEN.Attendere che il metanolo evapori. Rimuovere lo scudo di plastica sul palco e fare clic sul pulsante di scarico con la freccia verso l'alto per caricare le diapositive della membrana. Assicurarsi che la diapositiva sia completamente asciutta, capovolgere in modo che la membrana sia rivolta verso il basso e inserire la diapositiva.Fate clic su Continua (Continue) nella finestra cambia campione(Change Specimen). Il supporto della diapositiva si muoverà. Quindi sostituire lo scudo di plastica, nella parte inferiore dello schermo, scegliere quale porta diapositiva contiene la diapositiva e fare clic sul pulsante di scarico con la freccia verso il basso per caricare i tubi.Estrarre il vassoio e rimuovere il blocco del tubo. Inserire i tappi dei tubi di quattro tubi PCR da 500 microlitri nel supporto e piegare il tubo sotto. Riportare il blocco sul vassoio e riportarlo nella fase del microscopio.Nella finestra popup del dispositivo di raccolta delle modifiche, selezionare i tubi PCR e fare clic su OK. Fare clic sulla posizione del tubo vuoto in basso a sinistra dello schermo sotto i tappi del tubo del dispositivo di raccolta e nel pannello di controllo del microscopio selezionare TLBF per l'illuminazione del campo luminoso della luce trasmessa. Utilizzando l'obiettivo 2,5X, regolare la messa a fuoco fino a quando i vermi e la struttura superficiale della membrana PEN sono visibili.Passa all'obiettivo 20X e sposta il palco in una regione senza vermi. Regolare la messa a fuoco in modo tale che le strutture a bolle nella membrana abbiano un colore giallastro per focalizzare il laser sul piano focale corretto, quindi impostare i parametri laser. Per le punte di coda, iniziare con potenza 45 apertura 30 in velocità 20.Nel pannello di controllo laser, selezionare Calibra e seguire le istruzioni. Successivamente, nella parte inferiore dello schermo in corrispondenza dei tappi del tubo del dispositivo di raccolta fare clic sulla posizione A, sul lato destro dello schermo selezionare la forma singola, seguita da disegnare e tagliare. Quindi selezionare punto a punto e disegnare una linea.Fare clic su Avvia taglio in modo che il laser tagli attraverso la membrana. Trova un worm e passa a muoverti e tagliare. Usa il mouse per tagliare la coda.Per raccogliere il campione, passare all'impostazione di disegno e taglio con la funzione punto a punto e disegnare la forma per completare il taglio di una sezione di membrana. Selezionare il tubo successivo sul cappuccio del tubo del dispositivo di raccolta nella parte inferiore dello schermo e tagliare la punta della coda successiva. Una volta tagliate quattro code, scaricare il portatubi facendo clic su scarica con la freccia verso il basso.Trova le sezioni della membrana sotto un microscopio di dissezione e continua con l'elaborazione del campione a valle. Qui sequenziamento dell'RNA con CEL-Seq2. Pipettare 1,2 microlitri di una miscela master di primer CEL-Seq2 direttamente sopra il campione e chiudere il tubo.Etichettare con il numero di primer e posizionare immediatamente il tappo del tubo direttamente su un pezzo di ghiaccio secco per congelare il campione prevenendo così la degradazione dell'RNA. Ripetere l'operazione fino a quando tutti i campioni non sono stati raccolti. Infine conservare i tubi a meno 70 gradi Celsius.C.elegans L3 ermafroditi e maschi a 21-23 ore dopo la schiusa possono essere distinti al microscopio di dissezione dalla morfologia delle loro code. La storia dell'ermafrodita è stretta mentre quella dei maschi è gonfia e appare chiara. L'aspetto della struttura a scorrimento della membrana PEN e della coda a vite senza fine è mostrato in queste immagini.Qui la messa a fuoco è corretta per le lenti 20X e 40X al microscopio. La coda sezionata taglia in modo imparziale la membrana PEN è visibile qui. Dopo aver chiuso lo spazio nel taglio, il pezzo di membrana cadrà nel cappuccio del tubo sotto la diapositiva.Un cappuccio tubolare con una sezione a membrana PEN contenente una punta della coda sezionata è mostrato qui. L'immagine grafica rappresenta l'identificatore molecolare univoco trasformato in log naturale o conteggi UMI per singola punta di coda per diversi punti temporali e sessi. Il software powsimR viene utilizzato per determinare quanti campioni indipendenti sono necessari per rilevare geni differenziali espressi o DE a vari livelli di espressione.L'immagine grafica qui rappresenta il vero tasso positivo per rilevare i geni DE tra due condizioni per quattro diverse simulazioni che incorporano diverse dimensioni del campione per condizione. La linea tratteggiata indica un tasso positivo reale dell'80%. Il tasso di falsa scoperta e le stesse quattro simulazioni sono mostrate qui.La linea tratteggiata indica un tasso di falsa scoperta del 10%. I grafici hanno mostrato che una dimensione del campione di 70 punte di coda per condizione è sufficiente per rilevare i geni DE ad eccezione dei geni con livelli di espressione molto bassi. Per una corretta sincronizzazione, assicurarsi che solo gli embrioni siano presenti sulla piastra.Per evitare la perdita del campione, pipettare la miscela di primer direttamente sulla sezione della membrana PEN nel cappuccio ed essere estremamente delicati nella chiusura del tappo. Poiché è indipendente dalla specie, possiamo usare questo protocollo per esplorare come le reti di regolazione genica si sono evolute per le strutture omologhe in diverse specie.

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