Name: Quantificare le interazioni di legame tra Cu(II) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri la quantificazione delle interazioni di legame Cu(II)-peptidi mediante spettroscopia di assorbimento e calorimetria a titolazione isoterma. Queste tecniche ortogonali forniscono dati termodinamici completi per studi biochimici.

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SC ringrazia la Whitehead Summer Research Fellowship. MJS ringrazia gli Startup Funds e il Faculty Development Fund dell'Università di San Francisco. MCH riconosce i finanziamenti del National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) e della National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Questo articolo fornisce un metodo robusto per quantificare l'affinità e la termodinamica del legame di Cu(II) ai peptidi. I complessi con Cu(II) sono ideali per monitorare la banda di assorbimento d-d nel sito metallico grazie alla sua configurazione di elettroni d9 . Sebbene il coefficiente di estinzione sia piccolo, richiedendo quindi concentrazioni maggiori del complesso per produrre un segnale affidabile, le titolazioni di Cu(II) in peptide possono fornire rapidamente informazioni sulla stechiometria di l...

La biologia si è evoluta per utilizzare la diversa chimica degli ioni metallici necessari alla vita per adattarsi e sopravvivere nell'ambiente circostante. Si stima che il 25%-50% delle proteine utilizzi ioni metallici per la struttura e la funzione1. Il particolare ruolo e stato redox dello ione metallico è direttamente correlato alla composizione e alla geometria dei ligandi biologici che lo coordinano. Inoltre, gli ioni metallici redox-attivi come Cu(II) devono essere strettamente regolati per timore che interagiscano con agenti ossidanti attraverso la chimica simile a Fenton per formare specie reattive dell'ossigeno (ROS)2,3,4. Comprendere i modi di legame e l'affinità che guidano la sua biochimica dovrebbe aiutare a chiarire il ruolo biologico dello ione metallico.
Molte tecniche sono utilizzate per studiare le interazioni di legame di metalli e peptidi. Queste sono per lo più tecniche spettroscopiche, ma includono anche simulazioni al computer che utilizzano la dinamica molecolare, come visto attraverso le interazioni Cu (II) con un frammento di amiloide-beta (Aβ) 5. Una tecnica spettroscopica ampiamente utilizzata che è accessibile a molte università è la risonanza magnetica nucleare (NMR). Usando la natura paramagnetica di Cu(II), Gaggelli et al. sono stati in grado di mostrare dove lo ione metallico si lega su un petide attraverso il rilassamento dei nuclei vicini6. La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) può anche essere utilizzata per sondare la posizione e la modalità del legame ionico metallico paramagnetico7. Altre tecniche spettroscopiche come il dicroismo circolare (CD) possono descrivere il coordinamento su Cu(II) in sistemi come i sistemi tripartitici8, e la spettrometria di massa può mostrare stechiometria e a quali residui lo ione metallico è coordinato attraverso modelli di frammentazione 9,10.
Alcune di queste tecniche, come la NMR, sono prive di etichette ma richiedono grandi concentrazioni di peptide, ponendo sfide per lo studio. Un'altra tecnica comune chiamata spettroscopia di fluorescenza è stata utilizzata per mettere in relazione la posizione di una tirosina o triptofano con la tempra da un Cu(II)11,12. Allo stesso modo, questa tecnica può mostrare cambiamenti strutturali come risultato del legame Cu(II)13. Tuttavia, le sfide con questi studi di legame metallo-peptide sono che sondano gli amminoacidi cromoforici come la tirosina che non tutti i sistemi hanno, che lo ione metallico si lega sotto un modello classico e che la tecnica potrebbe non essere favorevole in condizioni fisiologiche. In effetti, stanno emergendo diversi peptidi che non contengono tali amminoacidi cromoforici o si legano sotto modelli classici, precludendo l'uso di queste tecniche14,15. Questo articolo descrive in dettaglio gli approcci per valutare le proprietà di legame in questi scenari in condizioni fisiologicamente rilevanti.
I ligandi biologici possono adottare diversi stati di protonazione che possono influenzare il legame con ioni metallici come l'anello imidazolo sull'istidina. Se il pH non viene mantenuto in modo coerente, i risultati possono essere contorti o conflittuali. Per questo motivo, i tamponi sono una componente essenziale nello studio delle interazioni metallo-proteina/peptide. Tuttavia, molti buffer hanno dimostrato di interagire favorevolmente con gli ioni metallici16,17. Oltre a competere con la molecola biologica di interesse, il buffer può avere atomi di coordinamento simili che possono essere difficili da distinguere dagli atomi coordinati del peptide o della proteina. In questo studio, l'attenzione si concentra sulla spettroscopia di assorbimento elettronico e sulla calorimetria a titolazione isotermica (ITC) come due tecniche complementari per lo studio delle interazioni Cu(II)-peptide, con considerazioni speciali riguardanti la scelta del tampone.
La spettroscopia elettronica di assorbimento è una tecnica rapida e ampiamente accessibile per lo studio delle interazioni metallo-legame. L'irradiazione con la luce nelle lunghezze d'onda ultraviolette (UV) o visibili può portare all'assorbimento di bande d-d centrate sul metallo, che forniscono preziose informazioni sulla classificazione dei ligandi, sulle geometrie dei metalli e sulle apparenti affinità di legame18,19. Per questi complessi, le titolazioni dirette di ioni metallici in soluzioni proteiche o peptidiche possono quantificare le stechiometrie di legame e le apparenti affinità di legame. In alcuni casi, come le configurazioni di elettroni d5 o d10, il complesso non assorbe la luce (cioè è spettroscopicamente silenzioso). In questi complessi di metalli di transizione spettroscopicamente silenziosi, queste limitazioni possono essere aggirate utilizzando un ligando concorrente che, coordinandosi con lo ione metallico, produce bande di trasferimento di carica rilevabili. In entrambi i casi, questo approccio si limita a quantificare solo la stechiometria e l'apparente affinità di legame, e nessuna comprensione dell'entalpia di legame è fornita senza approssimazioni.
Integrando le informazioni ottenute dalla spettroscopia elettronica di assorbimento, l'ITC è una tecnica interessante per la quantificazione diretta e rigorosa dell'entalpiadi legame 20. ITC misura direttamente il calore rilasciato o consumato durante un evento legante e, poiché la titolazione avviene a pressione costante, il calore misurato è l'entalpia di tutti gli equilibri (ΔHITC). Inoltre, la stechiometria dell'evento di legame (n) e l'apparente affinità di legame (KITC) sono quantificate. Da questi parametri vengono determinate l'energia libera (ΔGITC) e l'entropia (ΔSITC), fornendo un'istantanea termodinamica dell'evento di legame. Poiché non si basa sull'assorbimento della luce, ITC è una tecnica ideale per specie spettroscopicamente silenziose, ad esempio complessi di ioni metallici d5 o d10 . Tuttavia, poiché la calorimetria misura il calore, qualsiasi sistema tampone senza pari e gli equilibri non contabilizzati possono influire negativamente sull'analisi per determinare con precisione la termodinamica legante gli ioni metallici e occorre prestare molta attenzione per affrontare questi fattori20. Se eseguita con il rigore appropriato, l'ITC è una tecnica robusta per determinare la termodinamica dei complessi metallo-proteina/peptide.
Qui, un peptide legante il rame cromoforicamente silenzioso, il peptide C, viene utilizzato per dimostrare l'uso complementare delle due tecniche. Il peptide C è un prodotto di scissione di 31 residui (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formato durante la maturazione dell'insulina; manca di residui cromoforici ma ha dimostrato di legare Cu(II) con affinità fisiologicamente rilevante14,15. Il sito di legame Cu(II) è costituito dalle catene laterali di un glutammato e di un aspartato, nonché dall'N-terminale del peptide14,15. Questi atomi di coordinamento assomigliano molto a quelli di molti sistemi tamponati comunemente usati. Qui, viene mostrato l'uso in tandem delle bande d-d e di trasferimento di carica nella spettroscopia elettronica di assorbimento e ITC nel quantificare la termodinamica di legame Cu(II) al peptide C. L'approccio derivante dallo studio del legame di Cu(II) al peptide C può essere applicato ad altri ioni metallici e sistemi proteici/peptidici.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>131377-25G</td><td></td></tr><tr><td>bis-Tris tampone</td><td>Fisher</td><td>BP301-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana da 0,45 micron</td><td>Nalgene</td><td>296-4545</td><td>Qualsiasi sistema di filtrazione che rimuova la resina senza introdurre contaminanti è accettabile</td></tr><tr><td>Cloruro di rame (II)</td><td>Alfa Aesar</td><td>12458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro elettronico ad assorbimento</td><td>Varian</td><td>Cary 5000</td><td>Un altro spettrofotometro sensibile adatto è accettabile</td></tr><tr><td>resina ad alta affinità</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C7901-25G</td><td></td></tr><tr><td>Calorimetro di titolazione isotermica (ITC)</td><td>TA Instruments</td><td>Nano ITC Software</td> di analisi ITC a basso volume <td></td></tr><tr><td></td><td>TA Instruments</td><td>NanoAnalyze</td><td>SEDPHAT (Metodi. 2015, 76: 137&ndash; 148) può essere utilizzato anche</td></tr><tr><td>il software ITC</td><td>TA Instruments</td><td>ITCRun</td><td></td></tr><tr><td>tergicristallo delicato per impieghi leggeri</td><td>Kimwipe</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>siringa di caricamento</td><td>Hamilton</td><td>Syr 500 uL, 1750 cuvette abbinate TLL-SAL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Starna Cells, Inc</td><td>16.100-Q-10/Z20</td><td>Assicurarsi che la finestra per la cuvetta di piccolo volume corrisponda all'altezza del fascio dello spettrofotometro</td></tr><tr><td>tampone MOPS</td> Software per spettrofotometro <td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cary</td><td>WinUV Scan</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet Program</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>Qualsiasi programma di foglio di calcolo adatto funzionerà</td></tr><tr><td>siringa di titolazione</td><td>TA Instruments</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>acqua ultrapura</td><td>Millipore Sigma</td><td>Milli-Q</td><td>Qualsiasi acqua va bene purché >18 M&Omega; resistenza</td></tr></tbody></table>

quantificare le interazioni di legame tra cu(ii) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Il rame (II) è un metallo essenziale nei sistemi biologici, conferendo proprietà chimiche uniche alle biomolecole con cui interagisce. È stato riportato che si lega direttamente a una varietà di peptidi e svolge ruoli sia necessari che patologici che vanno dalla struttura mediatrice alle proprietà di trasferimento degli elettroni all'impartire la funzione catalitica. Quantificare l'affinità di legame e la termodinamica di questi complessi peptidici Cu(II) in vitro fornisce informazioni sulla forza motrice termodinamica del legame, sulle potenziali competizioni tra diversi ioni metallici per il peptide o tra diversi peptidi per Cu(II) e sulla prevalenza del complesso Cu(II)-peptide in vivo. Tuttavia, quantificare la termodinamica di legame può essere difficile a causa di una miriade di fattori, tra cui la contabilità di tutti gli equilibri concorrenti all'interno di un esperimento di titolazione, specialmente nei casi in cui vi è una mancanza di maniglie spettroscopiche discrete che rappresentano il peptide, lo ione metallico d-block e le loro interazioni.
Qui, viene fornita una robusta serie di esperimenti per la quantificazione accurata della termodinamica del peptide Cu(II). Questo articolo si concentra sull'uso della spettroscopia di assorbimento elettronico in presenza e assenza di ligandi cromoforici per fornire la necessaria maniglia spettroscopica su Cu (II) e l'uso della calorimetria isotermica a titolazione senza etichetta. In entrambe le tecniche sperimentali, viene descritto un processo per tenere conto di tutti gli equilibri concorrenti. Mentre il focus di questo articolo è su Cu(II), l'insieme descritto di esperimenti può applicarsi oltre le interazioni Cu(II)-peptide e fornire un quadro per una quantificazione accurata di altri sistemi metallo-peptidi in condizioni fisiologicamente rilevanti.

L'obiettivo era quello di quantificare e corroborare la termodinamica del legame di Cu(II) al peptide C utilizzando le tecniche complementari della spettroscopia elettronica di assorbimento e dell'ITC. A causa della natura robusta della spettroscopia elettronica di assorbimento, è stata eseguita una titolazione diretta di Cu(II) in 300 μM di peptide C (Figura 1). L'aggiunta di 150 μM di Cu(II) ha causato un immediato aumento della banda a 600 nm, attribuito alla banda d-d di Cu(II), e ha con...

Questo articolo si concentra sull'uso della spettroscopia di assorbimento elettronica e della calorimetria di titolazione isotermica per sondare e quantificare la termodinamica del legame di Cu(II) a peptidi e proteine.

Quantificare le interazioni di legame tra Cu(II) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Questo metodo consentirà al ricercatore di sondare sistemi difficili da studiare, come peptidi e ioni di metalli di transizione di prima fila, entrambi generalmente impegnativi utilizzando applicazioni più standard. Il vantaggio principale qui è l'utilizzo di tecniche ortogonali perché si completano a vicenda e possono dare maggiori informazioni sul sistema e aiutarci a non perdere alcun fenomeno. Il metodo descritto in questo video è molto adatto per lo studio di altri sistemi.Anche se lo mostriamo con Cu (II) e un peptide, può essere utilizzato per molte diverse interazioni di peptidi metallici e proteine metalliche. Penso che la parte più difficile sarà trovare una buona scelta tampone per il tuo ione metallico e peptide. Vorrei consultare la letteratura per vedere quali buffer sono stati usati da altri prima.A dimostrare la procedura sarà Sohee Choi, uno studente laureato nel mio laboratorio di ricerca. Per iniziare, accendere lo spettrofotometro elettronico ad assorbimento e lasciarlo riscaldare per circa 15-20 minuti prima dell'uso. Quindi avviare il software dello spettrofotometro e configurare i parametri, come l'intervallo di scansione da 200 a 900 nanometri, l'intervallo di scansione di 200 nanometri al secondo e la linea di base a doppio fascio corretta.Quindi, raccogliete una linea di base senza cuvette o campioni nei percorsi del fascio. Utilizzando due cuvette abbinate nello spettrofotometro a doppio raggio, caricare una cuvetta con 115 microlitri di acqua ultrapura e l'altra cuvetta con 115 microlitri di campione di peptide, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria nelle cuvette poiché interferiranno con il segnale. Successivamente, posizionare la cuvetta con acqua ultrapura nel fascio di riferimento e la cuvetta con peptide nel fascio del campione.Quindi raccogliere lo spettro di assorbimento del peptide privo di metalli. Aggiungere una quantità substechiometrica della soluzione di Cu(II) nella cuvetta con il campione di peptide e registrare il volume per l'analisi successiva. Versare delicatamente su e giù per mescolare la soluzione evitando la generazione di bolle d'aria.Dopo aver equilibrato per cinque minuti, rimettere la cuvetta nel supporto della cella del campione e registrare lo spettro di assorbimento. Quindi ripetere l'aggiunta di aliquote di Cu(II) nella soluzione peptidica per vari equivalenti e registrare il volume totale di Cu(II) aggiunto alla cuvetta. Dopo aver inizializzato il software come descritto in precedenza in due cuvette abbinate, caricare una cuvetta con 115 microlitri di acqua ultrapura e un'altra cuvetta con 115 microlitri della soluzione complessa rame-fene.Posizionare la cuvetta con acqua nella trave di riferimento e la cuvetta con soluzione complessa rame-fene nella trave campione. Quindi raccogliere lo spettro di assorbimento del complesso di leganti metallici. Successivamente, aggiungere una quantità stechiometrica di peptide alla soluzione complessa rame-fene e convogliare delicatamente su e giù per mescolare accuratamente facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.Quindi, incubare la soluzione per cinque minuti per raggiungere l'equilibrio. Rimettere la cuvetta nel supporto della cella del campione e registrare lo spettro di assorbimento. Successivamente, ripetere l'aggiunta di aliquote peptidiche nella soluzione complessa rame-fene per vari equivalenti e registrare il volume di peptide aggiunto in modo che la concentrazione diluita possa essere determinata.Per prima cosa accendi ITC e avvia il software ITC per eseguire lo strumento. Dopo la prima inizializzazione, riposizionare la buretta e seguire le istruzioni sullo schermo. Quindi rimuovere la buretta e il coperchio dalla cella di riferimento.Quindi, rimuovere l'acqua dalla cella di riferimento e risciacquare tre volte con 450 microlitri di acqua ultra pura degassata. Aspirare lentamente acqua ultra pura fino al segno di 450 microlitri di una siringa di carico facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella siringa. Quindi inserire la siringa di carico nella cella di riferimento fino a quando non si trova a circa un millimetro dal fondo e iniettare lentamente parte della soluzione fino a quando rimangono 150 microlitri nella siringa di carico.Successivamente, spostare rapidamente lo stantuffo della siringa di carico su e giù di circa 25 microlitri più volte per rimuovere eventuali bolle sulla superficie cellulare. Quindi iniettare lentamente fino a quando lo stantuffo raggiunge il segno di 100 microlitri sulla siringa di carico, erogando così un totale di 350 microlitri di acqua ultrapura nella cella di riferimento e sostituire il coperchio della cella di riferimento. Dopo aver rimosso qualsiasi soluzione residua dalla cella del campione, caricare 450 microlitri di EDTA 10 millimolari usando una siringa di carico e immergere per 10 minuti per assicurarsi che gli ioni di metalli in traccia vengano rimossi perché l'EDTA legherà i metalli in tracce.Dopo aver rimosso la soluzione di EDTA, sciacquare accuratamente la siringa di carico con abbondanti quantità di acqua ultra pura. Pulire l'ITC secondo le indicazioni del produttore risciacquando la cella del campione con acqua ultra pura. Rimuovere l'acqua residua dalla cella campione e quindi condizionare la cella campione risciacquando con 450 microlitri di tampone almeno tre volte.Quindi, rimuovere il tampone residuo che condiziona la cellula campione e caricare la soluzione peptidica nella cellula campione utilizzando la siringa di carico. Quindi sciacquare la siringa di titolazione con 200 microlitri di soluzione tamponata rimuovendo prima lo stantuffo. Utilizzando una micro pipetta, pipetta la soluzione tampone attraverso il foro nella parte superiore della siringa di titolazione di vetro attraverso la siringa ed fuori dall'ago sottostante.Successivamente, inserire completamente lo stantuffo nella siringa di titolazione. Quindi immergere la punta dell'ago della siringa di titolazione nella soluzione metallica e tirare lentamente lo stantuffo verso l'alto facendo sì che la soluzione metallica riempia la siringa e provochi un volume vuoto nella parte superiore della parte di vetro della siringa di titolazione. Per rimuovere il volume del vuoto, ruotare la siringa di titolazione parallelamente al pavimento.Quindi rimuovere lo stantuffo e inclinare leggermente la parte in vetro verso il pavimento. Agitare delicatamente la siringa di titolazione in modo che la soluzione si sposti nella parte in vetro della siringa di titolazione e riempia la maggior parte del volume del vuoto. Ma assicurati che rimangano da due a tre microlitri di volume vuoto.Mantenendo la siringa parallela al pavimento, reinserire lo stantuffo. Quindi tenere la siringa di titolazione in posizione verticale e immergere nuovamente la punta dell'ago nella soluzione metallica. Quindi, spingere lo stantuffo verso il basso fino a quando l'aria cessa di uscire dall'ago e caricare la siringa di titolazione tirando lentamente verso l'alto lo stantuffo appena sopra il segno di 50 microlitri mantenendo la punta dell'ago nella soluzione.Inserire con cautela la parte in vetro della siringa di titolazione nella buretta e avvitare fino a stringere le dita. Successivamente, utilizzando un tergicristallo delicato per impieghi leggeri, assorbire la soluzione che fuoriesce dalla siringa di titolazione a causa della compressione dello stantuffo senza toccare la punta dell'ago. Quindi, inserire la buretta con una siringa di titolazione nella cella del campione e fissarla saldamente.Per impostare i parametri del software ITC, selezionare Instrument Control. Impostare la velocità di agitazione e la temperatura. Quindi, in Dettagli esperimento, immettere le concentrazioni della siringa e delle cellule in unità millimolari.Successivamente, nella sezione Metodo esperimento selezionare Titolazione incrementale. Fare clic su Setup e specificare 20 iniezioni da 2,5 microlitri e se è richiesta una maggiore risoluzione per osservare l'evento di legame aumentare il numero di iniezioni e diminuire il volume per iniezione. Successivamente, immettere l'intervallo di tempo tra ogni iniezione in modo che sia abbastanza lungo da consentire al segnale di equilibrarsi e tornare alla linea di base, in genere 300 secondi.Quindi fai clic sul pulsante Esegui per avviare l'esperimento e specificare dove salvare i dati. La titolazione di Cu(II) è stata eseguita in C-Peptide dimostrando che l'aggiunta di 150 micromolari di Cu(II) ha causato un aumento immediato della banda a 600 nanometri attribuita alla banda d-d di Cu(II) e ha continuato ad aumentare fino all'aggiunta di 300 millimolari Cu(II). Un'ulteriore aggiunta al di sopra di 300 micromolari Cu(II) non ha aumentato l'assorbimento del ban d-d che indica la saturazione e che Cu(II) si lega al peptide C in un complesso 1:1 con un valore K logaritmico superiore a sei.Il peptide C è stato titolato in circa 10 complessi micromolari rame-fene e l'assorbimento dalla banda di trasferimento di carica a 265 nanometri è diminuito indicando che il peptide C era in grado di chelare Cu (II) dal ligando fenantropina con un valore K log da 7,4 a 7,8. Il termogramma ITC mostra la titolazione di 1,4 millimolari Cu(II) in 154 micromolari C-peptide in 15 millimolari tampone MOPS. L'affinità di legame è risultata avere un valore log K di otto con variazione di entalpia come 8 kilojoule per mole.Energia libera di Gibbs come meno 46 kilojoule per mole, e variazione di entropia come 120 joule per mole per kelvin. Una titolazione controllata di 1,4 millimolari Cu(II) in tampone MOPS 15 millimolare in assenza di C-peptide non mostra alcun legame nel termogramma. Direi di assicurarsi che tutto sia pulito.Se ci sono ioni metallici o peptidi rimasti da esperimenti precedenti, può influenzare drasticamente la stechiometria e fornire una competizione sconosciuta negli esperimenti di legame. Il dicroismo circolare è un altro metodo per studiare le interazioni tra peptidi metallici e proteine metalliche perché guarda alla chiralità. La spettrometria di massa può anche interrogare questi complessi osservando i cambiamenti di massa.Questo insieme di tecniche è stato utilizzato da molti laboratori che studiano gli ioni metallici che interagiscono con peptidi o proteine.

quantifying-binding-interactions-between-cu-ii-peptide-residues

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