Name: Sondare la meccanica dellensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Impara a misurare la meccanica degli ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche. Questo metodo modulare permette di studiare la dinamica delle proteine motorie con alta precisione.

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Questo lavoro è supportato in parte dalla University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), dall'Università del Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), dal Mississippi Space Grant Consortium con il numero di sovvenzione NNX15AH78H (JCW, DNR) e dall'American Heart Association con il numero di sovvenzione 848586 (DNR).

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Uno studio in vitro utilizzando pinzette ottiche combinate con imaging a fluorescenza è stato eseguito per studiare la dinamica degli insiemi di miosina che interagiscono con i filamenti di actina. I fasci di actina-miosina-actina sono stati assemblati utilizzando miosina muscolare II, actina rodamina nella parte inferiore del fascio e sulla superficie del coprislip e filamenti di actina biotinilati marcati con 488 sulla parte superiore del fascio. La proteina actina del muscolo di coniglio è stata polimerizzata...

Le proteine motorie sono essenziali per la vita, convertendo l'energia chimica in lavoro meccanico 1,2,3. I motori della miosina interagiscono con i filamenti di actina prendendo passi lungo i filamenti simili a una traccia, e la dinamica delle reti actina-miosina svolge la contrazione muscolare, la motilità cellulare, l'anello contrattile durante la citochinesi e il movimento del carico all'interno della cellula, tra gli altri compiti essenziali 3,4,5,6,7,8 . Poiché le miosine hanno così tanti ruoli essenziali, il fallimento nella funzionalità della rete miosina-actina può portare allo sviluppo di malattie, come mutazioni nella catena pesante della miosina che causano ipercontrattilità cardiaca nella cardiomiopatia ipertrofica (HCM)9,10,11,12,13,14 . Nella contrazione muscolare, i singoli motori della miosina cooperano tra loro lavorando come un insieme per fornire l'energia meccanica richiesta che esegue lo scorrimento relativo delle AF 4,15,16,17,18. I motori della miosina formano ponti trasversali tra le AF e utilizzano cambiamenti conformazionali dovuti al suo ciclo meccanochimico per spostarsi collettivamente verso l'estremità spinata dei filamenti allineati 17,18,19,20,21.
Lo sviluppo di saggi quantitativi di motilità in vitro a livello SM utilizzando tecniche come l'intrappolamento ottico ha facilitato la raccolta di dettagli senza precedenti su come funzionano i singoli motori della miosina, compresa la misurazione della generazione della forza SM e delle dimensioni dei passi 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. hanno sviluppato il saggio di intrappolamento ottico "a tre perle" o "manubri" per sondare la meccanica di generazione della forza dei motori a singola miosina II23,31. Poiché la miosina muscolare II lavora in team per contrarre la fibrillazione atriale ma non è processiva a livello SM, l'orientamento del saggio di intrappolamento ottico ha dovuto essere riorganizzato dal classico approccio a perline legate al motore32. Per formare il test con manubri, sono state utilizzate due trappole ottiche per tenere un AF su un motore di miosina legato a un tallone attaccato al coprifoglio, e la forza emessa dal singolo motore è stata misurata attraverso i movimenti dell'AF all'interno della trappola23.
Tuttavia, le forze SM e l'utilizzo di un singolo motore / singolo filamento di orientamento del saggio non forniscono un'immagine completa della generazione di forza a livello di sistema poiché molte proteine motorie, inclusa la miosina II, non funzionano isolatamente e spesso non funzionano come somma delle loro parti 15,16,17,32,33,34,35,36 . Strutture più complesse che includono più di un motore che interagisce con più di un filamento sono necessarie per comprendere meglio la sinergia delle reti di filamenti di miosina e actina 15,32. L'orientamento del saggio con manubri è stato sfruttato per studiare la generazione di piccole forze d'insieme avendo miosine multiple attaccate a una perlina o usando un filamento spesso miosina attaccato a una superficie e consentendo ai motori di interagire con l'AF sospeso 4,23,34,37,38,39,40.
Altri piccoli saggi di ensemble includono un saggio di scorrimento a filamento in vitro in cui i motori della miosina sono rivestiti su una superficie di copertura e un tallone legato a un AF viene utilizzato per sondare la forza generata dal team di motori 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . In entrambi i casi, le miosine sono legate a una superficie rigida – perlina o coprislip – e utilizzano una fibrillazione atriale. In questi casi, i motori non sono in grado di muoversi liberamente o comunicare tra loro, né avere miosine rigidamente legate riflette l'ambiente gerarchico e conforme in cui i motori lavorerebbero insieme nel sarcomero32. Studi precedenti hanno suggerito che la miosina II può percepire il suo ambiente e adattarsi di conseguenza alle mutevoli condizioni di concentrazione viscoelastica o motoria alterando caratteristiche come la generazione di forza e il rapporto di lavoro41,44,45. Pertanto, è necessario sviluppare un saggio di intrappolamento ottico che promuova e catturi la comunicazione motoria e la conformità del sistema per dipingere un quadro più realistico delle basi meccanicistiche della generazione della forza dell'insieme di miosina II.
Qui, abbiamo sviluppato un metodo per accoppiare la struttura gerarchica in vitro con l'intrappolamento ottico formando fasci di actomiosina o sandwich costituiti da più motori di miosina che interagiscono tra due filamenti di actina. Questa geometria di saggio modulare ha la capacità di sondare direttamente come i fattori molecolari e ambientali influenzano la generazione della forza della miosina dell'insieme. Inoltre, studiare i meccanismi di generazione della forza attraverso questi insiemi di actina-miosina ha il potenziale per aiutare a modellare e comprendere come i compiti cellulari su larga scala, come la contrazione muscolare, si propagano dal livello molecolare 9,10,13.

<table><tbody><tr><td>Proteina dell'actina (biotina): muscolo scheletrico</td><td>Citoscheletro</td><td>AB07-A</td><td>Proteina dell'actina biotinilata</td></tr><tr><td>Proteina dell'actina, muscolo scheletrico del coniglio</td><td>Citoscheletro</td><td>AKL99-A</td><td>Proteina dell'actina</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Stabilizzatore dell'actina e Alexa Fluor 488 colorazione</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>Richiesto per l'actina assemblaggio e motilità della miosina</td></tr><tr><td>Beta-D-glucosio</td><td>Fisher scientific</td><td>MP218069110</td><td>Parte del sistema di evacuazione dell'ossigeno utilizzato per ridurre il fotosbiancamento durante l'imaging a fluorescenza</td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker (caseina)</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>Utilizzato per bloccare la superficie dal legame non specifico</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>C79500</td><td>Cloruro di calcio, fornisce il controllo necessario sulla dinamica della rete di actina e miosina</td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Fisher scientific</td><td>ICN10040280</td><td>Parte del sistema di evacuazione dell'ossigeno utilizzato per ridurre il fotosbiancamento durante l'imaging a fluorescenza</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>Utilizzato per produrre celle a flusso</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher scientific</td><td>AC327190010</td><td>Utilizzato per la preparazione</td></tr> <tr><td>di tamponiEtanolo</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>Regent utilizzato per la pulizia dei vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>Parte del sistema di evacuazione dell'ossigeno utilizzato per ridurre il fotosbiancamento durante l'imaging a fluorescenza</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>Utilizzato per la preparazione del tampone</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>Utilizzato per mordenzare i vetrini coprioggetti e regolare tampone</td></tr><tr><td>pH MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>Utilizzato per la preparazione di</td></tr><tr><td>tamponi Vetrini per microscopio</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>Utilizzato per creare cellule a flusso</td></tr><tr><td>Proteina della miosina II: muscolo scheletrico di coniglio</td><td>Citoscheletro</td><td>MY02</td><td>Proteina motrice della miosina a lunghezza intera isolata dal muscolo scheletrico di coniglio</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>Strumento di intrappolamento ottico</td></tr><tr><td>Poli-l-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Facilita l'adesione dei filamenti di actina sulla superficie del vetro del vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>Citoscheletro</td> di<td>falloidina</td><td>PHDR1</td><td>Stabilizzatore di actina e colorante fluorescente di rodamina</td></tr><tr><td>Perle di streptavidina, 1 &mu; m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>Impugnatura di cattura ottica</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>Utilizzato per la preparazione del tampone</td></tr></tbody></table>

sondare la meccanica dell'ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Le miosine sono proteine motorie che idrolizzano l'ATP per camminare lungo le tracce del filamento di actina (AF) e sono essenziali nei processi cellulari come la motilità e la contrazione muscolare. Per comprendere i loro meccanismi di generazione della forza, la miosina II è stata studiata sia a livello di singola molecola (SM) che come team di motori in vitro utilizzando metodi biofisici come l'intrappolamento ottico.
Questi studi hanno dimostrato che il comportamento di generazione della forza della miosina può differire notevolmente quando si passa dal livello di singola molecola in una disposizione a tre sfere a gruppi di motori che lavorano insieme su una superficie rigida di tallone o di copertura in una disposizione di scorrimento. Tuttavia, queste costruzioni di saggi non consentono di valutare la dinamica di gruppo della miosina all'interno della gerarchia strutturale viscoelastica come farebbero all'interno di una cellula. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza pinzette ottiche per studiare la meccanica della generazione di forza da parte di insiemi di miosina che interagiscono con più filamenti di actina.
Questi fasci di actomiosina facilitano l'indagine in un ambiente gerarchico e conforme che cattura la comunicazione motoria e l'output della forza d'insieme. La natura personalizzabile del test consente di alterare le condizioni sperimentali per capire come le modifiche all'insieme di miosina, al fascio di filamenti di actina o all'ambiente circostante si traducono in diversi output di forza.

Le celle a flusso contenenti i sistemi di fasci di actomiosina hanno un design standard, costituito da un vetrino da microscopio e da un coprivetrino inciso separati da un canale costituito da nastro adesivo biadesivo (Figura 1). Il test viene quindi costruito dal coverslip up utilizzando introduzioni graduali come descritto nel protocollo. Il test finale consiste in filamenti di actina marcati con rodamina; la concentrazione di miosina desiderata (1 μM è stato utilizzato per i risultati rap...

Viene presentata e discussa la formazione di fasci di actomiosina in vitro e la misurazione della generazione della forza dell'insieme di miosina utilizzando pinzette ottiche.

Sondare la meccanica dell'ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Studiare il comportamento dell'actina utilizzando questo protocollo è significativo perché consente all'utente di sondare la dinamica dell'insieme proteico motorio utilizzando la precisione dell'intrappolamento ottico. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di misurare la meccanica della miosina all'interno della gerarchia strutturale delle actine, in contrasto con il tradizionale orientamento a filamento singolo a motore singolo utilizzato in molti esperimenti di intrappolamento ottico. Un altro vantaggio di questo protocollo è la sua natura modulare, che consente all'utente di personalizzare il test al sistema di citoscheletro gerarchico di propria scelta.Per iniziare, applicare due pezzi di nastro adesivo biadesivo al centro di un vetrino da microscopio a tre o quattro millimetri di distanza l'uno dall'altro. Quindi strappare o tagliare il nastro in eccesso che pende dal bordo della diapositiva. Quindi, aggiungere la linguetta di copertura rivestita in PLL sulla parte superiore del nastro perpendicolare all'asse lungo del vetrino del microscopio per formare un canale.Utilizzando un piccolo tubo per comprimere la scivolata di copertura sul nastro e sul microscopio, far scorrere accuratamente fino a quando il nastro è trasparente, assicurandosi che non ci siano bolle nel nastro in quanto ciò può causare perdite dal canale di flusso. Aggiungere 15 microlitri di rodamina actina diluita alla cella di flusso PLL e asciugare la soluzione in eccesso attraverso la cella di flusso, ma non lasciare che il canale di flusso si asciughi. Quindi, incubare per 10 minuti in una camera di umidità.Quindi, preparare una soluzione di caseina da un milligrammo per millilitro in tampone di polimerizzazione dell'actina e aggiungere 15 microlitri della soluzione per evitare il legame non specifico dei componenti successivi. Quindi, incubare per cinque minuti in una camera di umidità. Successivamente, aggiungere la concentrazione desiderata di miosina all'actina biotinilata preparata e alla sospensione di perline e mescolare delicatamente con una punta di pipetta.Quindi, aggiungere immediatamente 15 microlitri della sospensione insieme alla concentrazione di miosina desiderata alla cella di flusso e incubare per 20 minuti. Quindi, sigillare le estremità aperte della cella di flusso con smalto per unghie per prevenire l'evaporazione durante gli esperimenti di imaging e di intrappolamento ottico. Una volta che il sistema è pronto, accendere il laser utilizzando il pulsante di accensione laser nell'angolo in basso a sinistra dello schermo a 50 milliwatt e lasciarlo stabilizzare per 30 minuti.Fare clic in sequenza sui pulsanti di illuminazione, fotocamera, obiettivo e movimento scenico all'interno del software per visualizzare quelle finestre per la visualizzazione e la manipolazione durante l'esperimento. Accendere l'illuminazione del microscopio facendo clic sul pulsante On/Off e impostandola sulla massima potenza facendo clic e trascinando la barra fino in fondo verso destra. Aprire l'area del campione e rimuovere il supporto del campione dallo stadio del microscopio.Quindi aggiungere la cella di flusso e fissarla con i portacampioni metallici, assicurandosi che il vetrino di copertura sia sul fondo. Successivamente, aggiungere 30 microlitri di acqua RO al centro dell'obiettivo inferiore e reinserire lo stadio del campione. Quindi sollevare l'obiettivo inferiore utilizzando l'L2 sul telecomando fino a quando il tallone d'acqua tocca il vetrino del coperchio.Quindi, abbassare l'obiettivo superiore fino a raggiungere circa la metà della distanza dalla cella di flusso utilizzando l'R2 sul telecomando. Quindi, aggiungere 170 microlitri di acqua RO nella parte superiore della cella di flusso direttamente sotto l'obiettivo superiore e abbassare l'obiettivo superiore fino a quando non rompe la tensione superficiale dell'acqua e forma un menisco. Successivamente, spostare lo stadio del microscopio utilizzando il pad freccia sul telecomando fino a raggiungere il bordo del nastro adiacente al canale di flusso, quindi chiudere lo sportello del campione.Utilizzando la finestra dell'obiettivo sullo schermo, portare il bordo del nastro e mettere a fuoco portando l'obiettivo inferiore denominato Obiettivo laser verso l'alto facendo clic sulla freccia superiore e sull'obiettivo superiore facendo clic sulla freccia inferiore utilizzando i controlli sullo schermo. Trova una perlina galleggiante e intrappolala facendo clic sul pulsante di scatto della trappola, che aprirà l'otturatore e consentirà al laser di intrappolare il campione. Quindi, fai clic sul cursore dell'abbondanza sullo schermo e trascinalo per spostare la posizione del laser di trapping.Una volta intrappolato, calibrare il tallone facendo clic sul pulsante di calibrazione. Quindi, fai clic su Impostazioni e digita il diametro del tallone e la temperatura del palco che si trova in basso a sinistra della finestra del software. Quindi, fai clic su Trappola 1, quindi su X Signal ed esegui l'adattamento della frequenza d'angolo facendo clic su Esegui.Quindi fare clic e trascinare all'interno della finestra per ottimizzare la funzione di adattamento. Successivamente, fare clic su Usalo per i valori di sensibilità e rigidità e quindi accettare i valori. Successivamente, chiudi la finestra.Trova un fascio di actomiosina cercando perline legate alle AF sulla superficie del vetrino di copertina e cercando entrambe le AF fluorescenti co-localizzate. Accendere la sorgente di luce bianca e utilizzare il cubo filtrante appropriato per visualizzare ciascun filamento di actina ruotando la torretta. Una volta verificato, intrappolare il tallone attaccato al filamento superiore del fascio facendo clic sul pulsante di scatto della trappola.Quindi, registrare i dati facendo clic sul pulsante dell'oscilloscopio utilizzando i controlli su schermo. Per visualizzare le misurazioni senza registrare i dati, fare clic su Start e quindi fare clic su Autosave per salvare tutti i dati. Per registrare le misurazioni, clicca su Start record e scegli quali dati devono essere visualizzati in tempo reale scegliendo dal menu a tendina X Signal o Y Signal.La traccia di forza dei motori scheletrici della miosina che generano forza all'interno della gerarchia strutturale di actina costruita in vitro mostra una rampa costante in forza fino a raggiungere un plateau in due o cinque minuti. Tuttavia, si osserva anche che alcuni fasci di actomiosina che non generano alcuna forza netta e le tracce di forza appaiono come rumore basale o non mostrano un sostanziale aumento netto della forza oltre i 90 secondi a causa di una bassa concentrazione del motore o di un orientamento parallelo sfavorevole dei filamenti. Questo sviluppo del protocollo aprirà la strada alla costruzione di saggi citoscheletrici in vitro più complessi che aiuteranno ulteriormente a modellare compiti cellulari su larga scala, come la divisione cellulare e la contrazione muscolare dal basso verso l'alto.

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