Sondare la meccanica dell'ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche
4 maggio 2022
Viene presentata e discussa la formazione di fasci di actomiosina in vitro e la misurazione della generazione della forza dell'insieme di miosina utilizzando pinzette ottiche.
Studiare il comportamento dell'actina utilizzando questo protocollo è significativo perché consente all'utente di sondare la dinamica dell'insieme proteico motorio utilizzando la precisione dell'intrappolamento ottico. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di misurare la meccanica della miosina all'interno della gerarchia strutturale delle actine, in contrasto con il tradizionale orientamento a filamento singolo a motore singolo utilizzato in molti esperimenti di intrappolamento ottico. Un altro vantaggio di questo protocollo è la sua natura modulare, che consente all'utente di personalizzare il test al sistema di citoscheletro gerarchico di propria scelta.
Per iniziare, applicare due pezzi di nastro adesivo biadesivo al centro di un vetrino da microscopio a tre o quattro millimetri di distanza l'uno dall'altro. Quindi strappare o tagliare il nastro in eccesso che pende dal bordo della diapositiva. Quindi, aggiungere la linguetta di copertura rivestita in PLL sulla parte superiore del nastro perpendicolare all'asse lungo del vetrino del microscopio per formare un canale.
Utilizzando un piccolo tubo per comprimere la scivolata di copertura sul nastro e sul microscopio, far scorrere accuratamente fino a quando il nastro è trasparente, assicurandosi che non ci siano bolle nel nastro in quanto ciò può causare perdite dal canale di flusso. Aggiungere 15 microlitri di rodamina actina diluita alla cella di flusso PLL e asciugare la soluzione in eccesso attraverso la cella di flusso, ma non lasciare che il canale di flusso si asciughi. Quindi, incubare per 10 minuti in una camera di umidità.
Quindi, preparare una soluzione di caseina da un milligrammo per millilitro in tampone di polimerizzazione dell'actina e aggiungere 15 microlitri della soluzione per evitare il legame non specifico dei componenti successivi. Quindi, incubare per cinque minuti in una camera di umidità. Successivamente, aggiungere la concentrazione desiderata di miosina all'actina biotinilata preparata e alla sospensione di perline e mescolare delicatamente con una punta di pipetta.
Quindi, aggiungere immediatamente 15 microlitri della sospensione insieme alla concentrazione di miosina desiderata alla cella di flusso e incubare per 20 minuti. Quindi, sigillare le estremità aperte della cella di flusso con smalto per unghie per prevenire l'evaporazione durante gli esperimenti di imaging e di intrappolamento ottico. Una volta che il sistema è pronto, accendere il laser utilizzando il pulsante di accensione laser nell'angolo in basso a sinistra dello schermo a 50 milliwatt e lasciarlo stabilizzare per 30 minuti.
Fare clic in sequenza sui pulsanti di illuminazione, fotocamera, obiettivo e movimento scenico all'interno del software per visualizzare quelle finestre per la visualizzazione e la manipolazione durante l'esperimento. Accendere l'illuminazione del microscopio facendo clic sul pulsante On/Off e impostandola sulla massima potenza facendo clic e trascinando la barra fino in fondo verso destra. Aprire l'area del campione e rimuovere il supporto del campione dallo stadio del microscopio.
Quindi aggiungere la cella di flusso e fissarla con i portacampioni metallici, assicurandosi che il vetrino di copertura sia sul fondo. Successivamente, aggiungere 30 microlitri di acqua RO al centro dell'obiettivo inferiore e reinserire lo stadio del campione. Quindi sollevare l'obiettivo inferiore utilizzando l'L2 sul telecomando fino a quando il tallone d'acqua tocca il vetrino del coperchio.
Quindi, abbassare l'obiettivo superiore fino a raggiungere circa la metà della distanza dalla cella di flusso utilizzando l'R2 sul telecomando. Quindi, aggiungere 170 microlitri di acqua RO nella parte superiore della cella di flusso direttamente sotto l'obiettivo superiore e abbassare l'obiettivo superiore fino a quando non rompe la tensione superficiale dell'acqua e forma un menisco. Successivamente, spostare lo stadio del microscopio utilizzando il pad freccia sul telecomando fino a raggiungere il bordo del nastro adiacente al canale di flusso, quindi chiudere lo sportello del campione.
Utilizzando la finestra dell'obiettivo sullo schermo, portare il bordo del nastro e mettere a fuoco portando l'obiettivo inferiore denominato Obiettivo laser verso l'alto facendo clic sulla freccia superiore e sull'obiettivo superiore facendo clic sulla freccia inferiore utilizzando i controlli sullo schermo. Trova una perlina galleggiante e intrappolala facendo clic sul pulsante di scatto della trappola, che aprirà l'otturatore e consentirà al laser di intrappolare il campione. Quindi, fai clic sul cursore dell'abbondanza sullo schermo e trascinalo per spostare la posizione del laser di trapping.
Una volta intrappolato, calibrare il tallone facendo clic sul pulsante di calibrazione. Quindi, fai clic su Impostazioni e digita il diametro del tallone e la temperatura del palco che si trova in basso a sinistra della finestra del software. Quindi, fai clic su Trappola 1, quindi su X Signal ed esegui l'adattamento della frequenza d'angolo facendo clic su Esegui.
Quindi fare clic e trascinare all'interno della finestra per ottimizzare la funzione di adattamento. Successivamente, fare clic su Usalo per i valori di sensibilità e rigidità e quindi accettare i valori. Successivamente, chiudi la finestra.
Trova un fascio di actomiosina cercando perline legate alle AF sulla superficie del vetrino di copertina e cercando entrambe le AF fluorescenti co-localizzate. Accendere la sorgente di luce bianca e utilizzare il cubo filtrante appropriato per visualizzare ciascun filamento di actina ruotando la torretta. Una volta verificato, intrappolare il tallone attaccato al filamento superiore del fascio facendo clic sul pulsante di scatto della trappola.
Quindi, registrare i dati facendo clic sul pulsante dell'oscilloscopio utilizzando i controlli su schermo. Per visualizzare le misurazioni senza registrare i dati, fare clic su Start e quindi fare clic su Autosave per salvare tutti i dati. Per registrare le misurazioni, clicca su Start record e scegli quali dati devono essere visualizzati in tempo reale scegliendo dal menu a tendina X Signal o Y Signal.
La traccia di forza dei motori scheletrici della miosina che generano forza all'interno della gerarchia strutturale di actina costruita in vitro mostra una rampa costante in forza fino a raggiungere un plateau in due o cinque minuti. Tuttavia, si osserva anche che alcuni fasci di actomiosina che non generano alcuna forza netta e le tracce di forza appaiono come rumore basale o non mostrano un sostanziale aumento netto della forza oltre i 90 secondi a causa di una bassa concentrazione del motore o di un orientamento parallelo sfavorevole dei filamenti. Questo sviluppo del protocollo aprirà la strada alla costruzione di saggi citoscheletrici in vitro più complessi che aiuteranno ulteriormente a modellare compiti cellulari su larga scala, come la divisione cellulare e la contrazione muscolare dal basso verso l'alto.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la formazione di fasci di actomiosina in vitro e la misurazione della generazione di forza da parte di un insieme di miosina mediante pinzette ottiche. Il metodo consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle proteine motrici con elevata precisione.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biophysica
Sfondo
- Actina e miosina sono componenti fondamentali del citoscheletro.
- Comprendere le loro interazioni è essenziale per ottenere informazioni sulle meccaniche cellulari.
- I metodi tradizionali si concentrano spesso sulle interazioni di singoli motori.
- Questo protocollo migliora lo studio degli insiemi di proteine motrici.
Scopo dello studio
- Misurare la meccanica della miosina all'interno della gerarchia strutturale dell'actina.
- Fornire un saggio personalizzabile per diversi sistemi citoscheletrici.
- Migliorare la comprensione della dinamica delle proteine motrici.
Metodi Utilizzati
- Applicazione di nastro adesivo doppia faccia per creare un canale su un vetrino per microscopio.
- Utilizzo di coprioggetti rivestiti con PLL per il trattenimento ottico.
- Misurazione della generazione di forza da parte di complessi di miosina.
- Personalizzazione del saggio per diverse configurazioni sperimentali.
Risultati principali
- Il protocollo consente una misurazione precisa delle forze del miosina.
- Illustra i vantaggi delle misurazioni di ensemble rispetto agli studi su singoli motori.
- Permette l'esplorazione del comportamento dell'actina in un contesto gerarchico.
- Fornisce un quadro flessibile per future ricerche sul citoscheletro.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la comprensione delle interazioni actomiosiniche.
- Offre un notevole progresso nello studio della dinamica delle proteine motrici.
- La natura modulare del protocollo consente diverse applicazioni nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi quantitativa della meccanica di un insieme di miosina all'interno di fasci di filamenti di actina mediante pinzette ottiche colma una lacuna fondamentale nella comprensione della generazione di forza in sistemi gerarchici biologicamente rilevanti. Questa capacità aumenta la sicurezza predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, consentendo l'eliminazione dei rischi meccanicistici associati ai bersagli del citoscheletro e supportando decisioni di portafoglio in contesti in cui la dinamica actomiosina è implicata in modelli di malattia. La progettazione modulare del saggio permette un'adattabilità rapida a diverse esigenze di ricerca e sviluppo nel corso della scoperta e della ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della dinamica di ensemble delle proteine motrici in un contesto strutturalmente rilevante.
- Supporta la validazione funzionale delle molecole bersaglio quantificando la generazione di forza in condizioni variabili.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico per i bersagli citoscheletrici coinvolti in percorsi patologici.
- Fornisce una piattaforma per la verifica di ipotesi riguardo alla comunicazione actomiosinica e alla produzione di forza.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi attina-miosina validati per flussi di lavoro di screening di composti successivi.
- Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili della forza per la standardizzazione dei saggi.
- Consente scalabilità e riutilizzo della piattaforma attraverso configurazioni personalizzabili dei saggi.
- Supporta la valutazione affidabile di modulatori che influenzano la meccanica del citoscheletro.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le misurazioni della forza in vitro a comportamenti del citoscheletro rilevanti per la malattia.
- Fornisce continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione del modello preclinico.
- Informa le decisioni di avanzamento con aggiustamento del rischio per programmi mirati al citoscheletro.
- Potenzia il valore predittivo per lo sviluppo di biomarcatori traslazionali quando supportato da dati sull'output di forza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo basato su pinzette ottiche si integra nel percorso della scoperta, dalle prime fasi di studio meccanicistico fino allo sviluppo di saggi e alla ricerca preclinica, sostenendo sia la validazione del bersaglio che la continuità traslazionale.
- Biologia della scoperta: Quantifica la generazione di forza collettiva per chiarire i meccanismi delle vie actomiosiniche.
- Screening: Fornisce letture di forza standardizzate e riproducibili per la valutazione di composti.
- Analisi: Permette la misurazione in tempo reale e il confronto statistico delle tracce di forza tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla funzione citoscheletrica rilevante per le malattie quando l'output di forza corrisponde a parametri fisiologici di riferimento.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare e adattabile per un uso ripetuto in diversi programmi di ricerca e sviluppo mirati alla dinamica del citoscheletro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi citoscheletrici.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per la misurazione delle forze.
- Valore strategico: Migliora i processi decisionali di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza del capitale chiarificando precocemente i rischi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione dei programmi mirati alla meccanica actomiosinica, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nel campo del trapping ottico e della biofisica del citoscheletro.
- Richiede l'accesso a strumentazione di precisione e a infrastrutture analitiche per la misurazione delle forze.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per l'allestimento dei saggi e i protocolli di analisi dei dati.
- Permette l'adattamento a diverse configurazioni dei fasci di actina-miosina e a diverse condizioni ambientali.
- I limiti pratici includono la sensibilità alla concentrazione dei motori molecolari e all'orientamento dei filamenti, come osservato nella variabilità dei tracciati di forza.
