Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato
31 marzo 2022
La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.
La tecnica di chiarezza descritta per la prima volta nel 2013 è una tecnica di compensazione dei tessuti che consente il campionamento di grandi quantità di cellule, vasi sanguigni, quindi anche proteine come una singola risoluzione cellulare in spesse fette di cervello. Questa tecnica consente lo studio di strutture microscopiche intatte rendendo trasparente l'intero cervello. Questo protocollo è un chip semplice e una pipeline diretta per la pulizia dei tessuti.
Questa tecnica può essere utilizzata per eliminare i tessuti in altri sistemi oltre ai tessuti cerebrali. Per iniziare, sigillare il tubo e il cappuccio usando il parafilm e forare due fori nel cappuccio. Quindi trasferire il gas azoto dal serbatoio utilizzando un tubo flessibile con un diametro interno di cinque millimetri e un ago calibro 19 collegato alla sua estremità.
Iniziare il degasaggio attaccando il tubo al tubo e consentendo lo scambio di gas per 30 minuti a temperatura ambiente. Staccare il tubo e sigillare immediatamente i fori con argilla modellante. Quindi trasferire i tubi sigillati degas in un bagno di 37 gradi Celsius per 3 1/2 ore per polimerizzare la soluzione di idrogel.
Togli il cervello dal tubo. Utilizzando salviette da laboratorio, rimuovere l'idrogel polimerizzato intorno al cervello assicurando che nessun gel residuo rimanga attaccato alla superficie del cervello. Dividi il cervello in fette spesse che contengono tutte le aree di interesse.
Mettere le fette nella prima soluzione di compensazione e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Nel frattempo, prepara un tubo perforato per posizionare il cervello. Mettere il tubo perforato in un becher riempito con una seconda soluzione di compensazione su un dispositivo di agitazione.
Quindi posizionare il cervello nel becher e sigillarlo con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento. Dopo che il tessuto diventa trasparente, trasferire il cervello in PBST in incubazione a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Sostituire la soluzione con PBST fresco e continuare l'incubazione per altre 24 ore.
Quindi trasferire il cervello a PBS a temperatura ambiente per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il cervello dalla PBS e trasferirlo in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Incubare il cervello a 37 gradi Celsius durante la notte.
Innanzitutto, posizionare il campione al centro della diapositiva. Usando la colla a caldo, crea pareti sui bordi della diapositiva, quasi alte come il tessuto. Assicurati di lasciare un piccolo spazio in uno degli angoli.
Quando lo strato di colla a caldo si avvicina all'altezza della fetta di cervello, applicare una o due gocce della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione sul campione per inumidire la superficie superiore e prevenire la formazione di bolle. Mentre la colla a caldo è ancora liquida, sigillare la parte superiore con un coperchio, posizionandolo nel modo più uniforme possibile, quindi riempire la camera con la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Chiudere lo spazio con la colla a caldo.
Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi estensibili. Se per l'imaging viene utilizzato un obiettivo di immersione in olio, aggiungere altri due o tre millimetri di colla alle pareti sopra lo slittamento del coperchio per mantenere la soluzione di immersione. Dopo questo protocollo, il tessuto cerebrale verrà eliminato.
Sono state preparate chiare fette di cervello utilizzando questo protocollo per visualizzare popolazioni di astrociti e neuroni nella regione CA1 dell'ippocampo del topo. Tutti gli astrociti hanno espresso tdTomato e neuroni eccitatori che hanno espresso H2B-GFP nei loro nuclei. La camera preparata per il tessuto chiarificato era ottimale per l'imaging al microscopio a due fotoni o confocali.
Utilizzando un microscopio a due fotoni, sono stati osservati oltre 300 astrociti in una sezione eliminata della regione CA1 dell'ippocampo del topo. Gli astrociti ippocampali nelle cellule rosse e piramidali, i somata in verde erano visibili e il tessuto spesso e trasparente che rappresentava la vicinanza spaziale tra questi due tipi di cellule. Utilizzando un microscopio confocale laser a scansione, i fasci assonali dei neuroni eccitatori sono stati tracciati su un intero emisfero.
I fasci verdi sono stati tracciati dall'ippocampo dorsale verso i corpi super mamillari. I fasci rossi sono stati tracciati dai corpi mamillari verso la loro origine nell'ippocampo di sfiato. Fattori come la temperatura, le concentrazioni e il tempo di incubazione hanno influenzato l'esito della procedura di chiarezza.
Pertanto, la precisione in ogni fase del protocollo è vitale per il successo del raggiungimento di tessuti chiari. Usando questa tecnica, misuriamo le distanze tra neuroni e astrociti in diverse strutture cerebrali. Questo protocollo ha permesso l'analisi di due o tre ordini di grandezza in più di cellule rispetto agli studi precedenti.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio utilizza il metodo CLARITY combinato con la trasduzione virale per esplorare le relazioni spaziali tra neuroni e astrociti nell'ippocampo del topo. Rendendo il tessuto trasparente, questa tecnica permette ai ricercatori di investigare un numero maggiore di cellule, rivelando informazioni sull'organizzazione e le interazioni cellulari.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di clearing dei tessuti
- Imaging cellulare
Contesto
- La tecnica CLARITY consente la visualizzazione del tessuto cerebrale a livello cellulare.
- Permette l'analisi di grandi popolazioni di neuroni e astrociti in tessuti intatti.
- Questo metodo migliora la chiarezza delle sezioni cerebrali spesse rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
- Lo studio enfatizza il ruolo della trasparenza dei tessuti nella comprensione dell'architettura neuronale.
Obiettivo dello studio
- Investigare le relazioni strutturali tra astrociti e neuroni nell'ippocampo del topo.
- Misurare le distanze tra diversi tipi di cellule attraverso varie strutture cerebrali.
- Dimostrare l'efficacia del metodo CLARITY per l'imaging cellulare.
Metodi utilizzati
- Lo studio ha utilizzato la tecnica CLARITY per il clearing dei tessuti nelle sezioni cerebrali.
- Il tessuto dell'ippocampo del topo è stato utilizzato per visualizzare astrociti e neuroni eccitatori.
- Non sono stati menzionati flussi di lavoro multiomics.
- I passaggi chiave includevano la degassificazione, la polimerizzazione dell'idrogel e l'incubazione in soluzioni di clearing.
- Il tessuto è stato visualizzato utilizzando microscopia bifotonica e confocale.
Risultati principali
- Sono stati visualizzati oltre 300 astrociti in sezioni dell'ippocampo rese trasparenti.
- È stato stabilito il contesto spaziale degli astrociti e dei neuroni eccitatori, mostrando la loro vicinanza.
- Sono state fatte osservazioni significative di fasci assonali tra le popolazioni neuronali nei tessuti resi trasparenti.
- Vari fattori hanno influenzato la chiarezza dei tessuti, evidenziando la necessità di una metodologia precisa.
Conclusioni
- Questo studio dimostra che il metodo CLARITY può migliorare significativamente la visualizzazione delle relazioni cellulari nel cervello.
- I risultati permettono una migliore comprensione dell'organizzazione spaziale dei neuroni e delle cellule gliali.
- Le intuizioni acquisite da questo metodo possono avere implicazioni per la ricerca sui meccanismi neuronali e potenziali modelli di malattia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
