Name: Indagine sullinterazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Scopri il metodo CLARITY per studiare le interazioni tra astrociti e neuroni nell'ippocampo del topo. Questa tecnica di clearing tissutale consente la visualizzazione tridimensionale di oltre 300 cellule con microscopia confocale e a due fotoni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 803589), dalla Israel Science Foundation (sovvenzione ISF n. 1815/18) e dalle sovvenzioni Canada-Israele (CIHR-ISF, sovvenzione n. 2591/18). Ringraziamo Nechama Novick per aver commentato l'intero manoscritto.

I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università ebraica e hanno soddisfatto le linee guida della Guida dell'Istituto Nazionale di Salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Trasduzione del vettore virale
NOTA: La trasduzione del vettore virale viene utilizzata per esprimere fluorofori nel cervello.
<ol><li>Utilizzare un atlante (ad esempio, Allen Brain Atlas) per individuare il coordinamento pertinente dell'area target. NOTA: gli atlanti 3D possono essere trovati online (ad esempio, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).</li>
	<li>Utilizzando la chirurgia stereotassica, iniettare i vettori virali nella struttura cerebrale pertinente. Vedere9 per un protocollo dettagliato.</li>
	<li>Attendere 3-6 settimane per l'espressione del fluoroforo. NOTA: un breve periodo di tempo è sufficiente se è necessario contrassegnare solo i corpi cellulari. Sarà necessario un lungo periodo di tempo se le proiezioni assonali sono rilevanti per la domanda, poiché ci vuole più tempo perché i fluorofori si esprimano negli assoni, che possono essere lunghi diversi millimetri.</li>
	<li>Convalidare in anticipo la specificità e la penetranza dell'espressione del fluoroforo (sia di espressione virale che di animali TG) (Figura 1A). Prima di procedere con la procedura CLARITY, designare almeno un cervello per fette sottili e assicurarsi che l'espressione del fluoroforo sia forte e specifica per la caratteristica della cellula bersaglio.</li>
</ol>2. CHIAREZZA
NOTA: Questo metodo rende il cervello trasparente entro 2-6 settimane.
<ol><li>Eseguire la perfusione transcranica su animali utilizzando soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) seguita da paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS. Rimuovere il cervello e tenerlo in PFA durante la notte a 4 °C in un tubo da 50 ml o in un contenitore simile. NOTA: Prima di eseguire la perfusione transcranica, l'animale deve essere profondamente anestetizzato. Negli esempi presentati in questo protocollo, tutti gli animali sono stati anestetizzati usando ketamina e xilazina (rispettivamente 90% e 10%).</li>
	<li>Sostituire pfa con soluzione di idrogel (HS; vedere Tabella 1) per 48 ore a 4 °C. NOTA: Non lasciare che i materiali diventino più caldi della temperatura di refrigerazione (4-8 °C) in questa fase, altrimenti l'idrogel polimerizzerà. L'HS utilizzato in questo protocollo contiene il 2% di acrilammide, a differenza dei protocolli precedenti che suggerivano il 4% 22 o l'1% 17. Il vantaggio del 2% è dettagliato nella sezione di discussione. Quando si prepara l'HS, lavorare su una superficie ghiacciata. Conservare a -20 °C.</li>
	<li>Degasaggio NOTA: Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere tutto l'ossigeno libero dal tessuto poiché O2 interferisce con il processo di polimerizzazione. È possibile utilizzare qualsiasi gas diverso da O2 (ad esempio, N2, CO2); N2 è raccomandato.<ol>
<li>Trasferire l'N2 dal serbatoio tramite un tubo flessibile (interno) da 5 mm, collegato a un ago da 19 G alla sua estremità (Figura 1B).</li>
		<li>Praticare due piccoli fori (larghi un ago) nel cappuccio del tubo: uno per introdurre il gas e l'altro per consentire all'aria di lasciare il tubo (Figura 1C).</li>
		<li>Collegare il tubo dal gas N2 al tubo e sostituire i gas per circa 30 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Rimuovere il tubo e sigillare immediatamente i fori con argilla modellante su ogni tubo (Figura 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire i tubi sigillati degassati in un bagno a 37 °C per 3,5 ore per polimerizzare l'HS, che diventerà un gel. Fare attenzione a non scuotere i tubi (Figura 1E).</li>
	<li>Estrarre il cervello dal tubo e rimuovere delicatamente il gel polimerizzato da intorno ad esso usando salviette da laboratorio. Assicurarsi che nessun gel residuo rimanga attaccato alla superficie del tessuto, in quanto potrebbe reagire con la soluzione nei passaggi seguenti, inibendo il processo di pulizia dei tessuti (Figura 1F). NOTA: Poiché il gel conteneva PFA, l'estrazione deve essere effettuata sotto una cappa aspirante.</li>
	<li>Taglia il cervello se la domanda a portata di mano richiede solo una parte di esso. Dividerlo a metà o in fette molto spesse che contengono tutte le aree di interesse (Figura 1G).</li>
	<li>Introdurre le fette nella prima soluzione di compensazione (CS1, vedere tabella 2) in un nuovo contenitore e agitare a 70 giri/min per 24 ore a 37 °C.</li>
	<li>Seguire i passaggi descritti di seguito per trasferire il cervello da CS1 alla seconda soluzione di compensazione (CS2, vedere Tabella 2).<ol>
<li>Preparare un tubo perforato per il cervello in anticipo (Figura 1H).</li>
		<li>Preriscaldare CS2 a 40-45 °C in un becher abbastanza grande da contenere il tubo. Fallo su una piastra elettrica con un agitatore. Assicurarsi che la temperatura non raggiunga i 55 °C per evitare lo sbiancamento delle proteine espresse.</li>
		<li>Posizionare il becher riempito con CS2 e il tubo perforato su un dispositivo di agitazione (un becher da 2 L nella Figura 1I). Impostare una velocità di agitazione moderata che causerà il flusso del liquido senza distorcere il tessuto. NOTA: Entro 2-6 settimane, il tessuto diventerà trasparente (il processo inizia alla periferia e si muove verso l'interno verso le strutture cerebrali centrali). La decisione su quando il tessuto è "abbastanza chiaro" dipende dal giudizio personale. Il cervello dovrebbe essere sufficientemente trasparente per l'imaging al microscopio senza interferenze (Figura 1J non abbastanza chiara; Figura 1K abbastanza chiaro). Superare il punto in cui il tessuto è abbastanza chiaro può causare la perdita di rigidità del tessuto.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferimento da CS2 a PBST (0,5% Triton X-100 in PBS, vedere Tabella 2) in un nuovo contenitore a 37 °C con lieve agitazione (70 giri/min) per 24 ore. NOTA: Nel PBST, il tessuto diventerà biancastro (Figura 1L). La chiarezza tornerà (e migliorerà) quando incorporata nella soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS, vedere il passaggio 2.14).</li>
	<li>Sostituire il PBST con il nuovo PBST. Conservare nelle stesse condizioni (37 °C con lieve agitazione) per altre 24 ore.</li>
	<li>Sostituire nuovamente PBST con il nuovo PBST e mantenere a RT per 24 ore.</li>
	<li>Trasferimento a PBS a RT per 24 ore.</li>
	<li>Sostituire il PBS e partire a RT per ulteriori 24 ore.</li>
	<li>Rimuovere il cervello da PBS e trasferirlo a RIMS a 37 °C durante la notte. NOTA: Inizialmente, le increspature nei RIMS possono circondare il cervello. Questo protocollo è stato progettato e convalidato utilizzando due SPECIFICI RIMS commerciali (vedi Tabella 3). Tuttavia, il protocollo non dovrebbe differire quando si utilizzano altri RIMS (commerciali o autoprodotti).</li>
	<li>Mantenere il tessuto a RT per altre 24 ore o fino a quando la soluzione raggiunge il pieno equilibrio, cioè quando il tessuto diventa trasparente e la soluzione non contiene più increspature visibili (Figura 1M).</li>
	<li>Se il tessuto è trasparente, procedere alla preparazione della camera. Se a questo punto, il tessuto diventa bianco anziché trasparente (a causa di aggregati di molecole SDS residue), pulire nuovamente il campione ripetendo i passaggi 2.9 e 2.10 e trasferire il tessuto a CS2 (passaggio 2.8) per alcuni giorni, seguiti da tutti i passaggi fino al passaggio 2.15.</li>
</ol>3. Preparazione della camera
NOTA: Ogni campione richiede un vetrino con una camera di imaging in cui verrà posizionato il campione.
<ol><li>Posizionare il campione al centro della diapositiva.</li>
	<li>Usando una pistola per colla a caldo, crea pareti ai bordi della diapositiva, alte quasi quanto il tessuto. Assicurarsi di lasciare un piccolo spazio (circa 5 mm) in uno degli angoli (Figura 2A,B).</li>
	<li>Applicare 1-2 gocce di RIMS sul campione per mantenere umida la superficie superiore ed evitare la formazione di bolle tra il coverslip e il tessuto.</li>
	<li>Subito dopo aver applicato le gocce RIMS, aggiungere l'ultimo strato di colla a caldo alle pareti (in modo che raggiungano l'altezza del cervello / fetta) e procedere immediatamente (mentre la colla a caldo è ancora liquida) al punto 3.5.</li>
	<li>Sigillare la parte superiore con una cartella, posizionandola nel modo più uniforme possibile sulla parte superiore dello strato di colla a caldo ancora caldo (Figura 2C).</li>
	<li>Riempire la camera con il RIMS attraverso lo spazio lasciato nelle pareti della colla a caldo (Figura 2D,E).</li>
	<li>Chiudere lo spazio con la colla a caldo. Non lasciare aria all'interno (Figura 2F).</li>
	<li>Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi di estensione (Figura 2G).</li>
	<li>Se l'obiettivo utilizzato per l'imaging è immerso, aggiungere altri 2-3 mm di colla alle pareti sopra il coperchio in modo che la soluzione di immersione duri per un periodo più lungo (Figura 2H).</li>
</ol>4. Imaging (confocale o a due fotoni)
<ol><li>Verificare se il palco può contenere la camera, poiché lo spessore della camera può raggiungere diversi millimetri. NOTA: Ad esempio, il microscopio confocale (vedi la Tabella dei materiali) utilizzato in questo protocollo è dotato di diversi stadi (ad esempio, circolare, rettangolare). Qualunque stadio venga scelto per contenere la camera è irrilevante fintanto che i suoi parametri si adattano alle dimensioni della camera.</li>
	<li>Lavora con un obiettivo con una distanza di lavoro sufficiente, cioè una distanza di lavoro minima ≥3 mm, poiché la regione del cervello di interesse può essere profonda pochi millimetri e il coverslip potrebbe non essere completamente dritto poiché è stato posizionato manualmente. NOTA: A titolo dimostrativo, i risultati presentati in Figura 1, Video 1 e Video 2 sono stati ottenuti al microscopio a due fotoni utilizzando un obiettivo 16x ad immersione in acqua con una distanza di lavoro di 3 mm e un ingrandimento di 2,4 per ottenere un campo visivo di 652 x 483 μm e una pila z con intervalli di 0,937 μm tra i piani.</li>
	<li>Eseguire l'imaging multi-area, che potrebbe richiedere alcune ore o addirittura giorni. Assicurati che ci sia un ampio spazio di archiviazione libero nel computer poiché la dimensione di ogni immagine può raggiungere fino a decine di gigabit. NOTA: l'imaging CLARITY può comportare un numero significativamente maggiore di sezioni di immagine in profondità. Pertanto, le intensità utilizzate per acquisire l'espressione dovrebbero essere relativamente basse per evitare la sovraespressione durante la sommatoria dell'immagine.</li>
	<li>Per gli obiettivi di immersione, controllare il liquido di routine durante l'imaging e integrare con liquido aggiuntivo, se necessario. NOTA: Durante l'imaging dei dati presentati nel Video 3, l'acqua è stata aggiunta alla superficie della camera ogni 6-8 ore per combattere l'evaporazione.</li>
	<li>Dopo che l'immagine è stata acquisita, visualizzala e analizzala utilizzando diversi pacchetti software. NOTA: il software consigliato include Imaris e SyGlass sia per la visualizzazione che per l'analisi. La pipeline precisa per la ricostruzione ottimizzata degli astrociti utilizzando il software Imaris è stata descritta in precedenza9. In breve, le caratteristiche di Imaris utilizzate in questo studio erano Filamenti per ricostruire completamente le strutture cellulari e Macchie per estrarre la posizione nello spazio di tutti i somata.</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
<li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li>
<li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+in+memory+function%3A+pioneering+findings+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li>
<li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li>
<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

I metodi di compensazione dei tessuti rappresentano uno strumento rivoluzionario nella ricerca sul cervello, invitando a domande che in precedenza non avrebbero potuto essere poste. Dal targeting delle proprietà di un piccolo gruppo di cellule, una singola cellula o anche una singola sinapsi, CLARITY ora consente il targeting di popolazioni cellulari totali o funzionalità di connettività a lungo raggio utilizzando fluorofori pertinenti.
Il risultato dell'espressione del fluoroforo e della comb...

Negli ultimi anni, la conoscenza della funzione degli astrociti e di come interagiscono con i circuiti neuronali è aumentata drasticamente. Gli astrociti possono influenzare la plasticità 1,2, aiutare nel recupero neuronale post-infortunio 3,4 e persino indurre un potenziamento neuronale de novo, con studi recenti che mostrano l'importanza degli astrociti nell'acquisizione e nella ricompensa della memoria, precedentemente considerate come funzioni puramente neuronali 5,6,7 . Una caratteristica di particolare interesse nella ricerca sugli astrociti è la disposizione spaziale delle cellule, che mantengono organizzazioni spaziali uniche nell'ippocampo e in altre strutture cerebrali 8,9,10. A differenza dei dendriti neuronali che si intrecciano tra i somata cellulari, gli astrociti ippocampali abitano territori visivamente distinguibili con una leggera sovrapposizione tra i loro processi, creando domini distinti 8,11,12,13. Le prove a sostegno della partecipazione degli astrociti nei circuiti neuronali non supportano la mancanza di una descrizione anatomica dettagliata di tali popolazioni e dei neuroni nei loro domini14.
Le procedure di trasduzione del vettore virale, insieme agli animali transgenici (TG), sono state rese popolari come set di strumenti per studiare le strutture cerebrali, le funzioni e le interazioni cellulari15,16. L'utilizzo di diversi promotori consente il targeting di cellule specifiche in base alle loro proprietà genetiche, ai livelli di attivazione17,18 o agli obiettivi di proiezione. Virus diversi possono esprimere fluorofori di colore diverso in diverse popolazioni. Un virus può essere combinato con l'espressione endogena di fluorofori in TG, oppure gli animali TG possono essere utilizzati senza la necessità di virus. Queste tecniche sono ampiamente utilizzate per la marcatura neuronale e alcuni laboratori hanno iniziato a utilizzarle con modifiche specializzate per il targeting di altri tipi di cellule, come gli astrociti 5,9,19.
La tecnica CLARITY, descritta per la prima volta nel 201320,21, consente lo studio di spesse fette di cervello rendendo trasparente l'intero cervello lasciando intatte le strutture microscopiche. Combinando i due metodi - trasduzione virale del vettore e pulizia dei tessuti - è ora disponibile l'opzione di esaminare le interazioni spaziali tra diverse popolazioni di tipi cellulari. La maggior parte degli studi di interazione astrociti-neuroni sono stati eseguiti su fette di cervello sottili, con conseguente immagine di astrociti incompleti a causa dei loro grandi domini, limitando così radicalmente il numero di cellule analizzate. L'uso della tecnica CLARITY consente la caratterizzazione simultanea della risoluzione di singole cellule di popolazioni cellulari in volumi su larga scala. L'imaging di popolazioni cellulari con tag fluorescenti in cervelli chiari non fornisce una risoluzione sinaptica, ma consente una caratterizzazione approfondita delle interazioni spaziali tra astrociti e una varietà di tipi di cellule neuronali.
Per questo motivo, abbiamo sfruttato queste tecniche all'avanguardia per studiare le proprietà degli astrociti in tutto il CA1 dorsale, immaginando tutte le lamina (Stratum Radiatum, strato piramidale e Stratum Oriens). Abbiamo misurato decine di migliaia di astrociti (con penetranza virale di >96%5), analizzando così le informazioni dell'intera popolazione astrocitica intorno a CA1. Con un'efficace penetranza dei marcatori neuronali, abbiamo potuto registrare le interazioni tra l'intera popolazione di astrociti CA1 e i quattro tipi di cellule neuronali: parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neuroni inibitori VIP e cellule piramidali eccitatorie9.
Diversi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una combinazione di fluorescenza da animali TG e vettori virali di colore diverso (tutte le cellule inibitorie), mentre altri (eccitatori) hanno utilizzato due vettori virali che esprimono diversi fluorofori sotto diversi promotori9. Questo documento presenta un protocollo dettagliato, che include l'etichettatura delle cellule desiderate nel cervello, rendendo il cervello trasparente utilizzando una procedura CLARITY modificata, nonché l'imaging e l'analisi di strutture cerebrali complete, utilizzando varie procedure e software.

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>vettore virale utilizzato per rilevare gli astrociti</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>vettore virale utilizzato per rilevare i neuroni</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>vettore virale utilizzato per rilevare i nuclei neuronali</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>vettore virale utilizzato per rilevare i neuroni</td></tr><tr><td>Acrilammide (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrilammide (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td>#B7901</td><td>Peso molecolare - 61,83 g/mol Microscopio</td></tr><tr><td>confocale, scansione, obiettivo FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>4x (UPlanSApo, 0,16 NA)</td></tr><tr><td>Software</td> <td>ImarisBitplane, Regno Unito</td><td></td><td>Un software che consente l'analisi 3D delle immagini</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>EMS</td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> SyGlass <td>Un software che consente l'analisi 3D delle immagini utilizzando la realtà virtuale</td></tr><tr><td>Tris base 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>Peso molecolare - 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>Laser Ti:sapphire (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubi fotomoltiplicatori GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro passa-banda (Semrock), obiettivo 16x ad immersione in acqua (Nikon, 0,8 NA)&nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 Iniziatore</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione dei tessuti utilizzando il metodo CLARITY consente di studiare contemporaneamente diversi tipi di cellule cerebrali e le loro interazioni. La trasduzione del vettore virale consente la marcatura di diversi tipi di cellule in diversi colori di fluorescenza all'interno dello stesso tessuto. Le cellule possono essere identificate geneticamente per attività o proiezione. Utilizzando un protocollo CLARITY modificato, la dimensione potenziale del campione di astrociti e neuroni è cresciuta di 2-3 ordini di grandezza. L'uso di CLARITY consente l'imaging di astrociti completi, che sono troppo grandi per adattarsi nella loro interezza a fette, e l'esame dei somata con tutti i loro processi. Inoltre, offre l'opportunità di studiare l'interazione spaziale tra astrociti e diversi tipi di cellule neuronali, vale a dire, il numero di neuroni piramidali in ciascun dominio astrocitico o la vicinanza tra astrociti e specifiche popolazioni di neuroni inibitori. Questo documento descrive, in dettaglio, come questi metodi devono essere applicati.

La corretta eliminazione di spesse fette di tessuto cerebrale si traduce in una nuova gamma di domande che possono essere poste riguardo alle proprietà di grandi popolazioni cellulari rispetto alle proprietà di singole cellule o gruppi vicini di cellule. Per ottenere risultati di successo, si dovrebbe rispettare rigorosamente il protocollo CLARITY, in quanto esiste una vasta gamma di parametri che devono essere considerati per ridurre la varianza tra i campioni (ad esempio, percentuale di chiarezza, informazioni sulla fl...

La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.

Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

La tecnica di chiarezza descritta per la prima volta nel 2013 è una tecnica di compensazione dei tessuti che consente il campionamento di grandi quantità di cellule, vasi sanguigni, quindi anche proteine come una singola risoluzione cellulare in spesse fette di cervello. Questa tecnica consente lo studio di strutture microscopiche intatte rendendo trasparente l'intero cervello. Questo protocollo è un chip semplice e una pipeline diretta per la pulizia dei tessuti.Questa tecnica può essere utilizzata per eliminare i tessuti in altri sistemi oltre ai tessuti cerebrali. Per iniziare, sigillare il tubo e il cappuccio usando il parafilm e forare due fori nel cappuccio. Quindi trasferire il gas azoto dal serbatoio utilizzando un tubo flessibile con un diametro interno di cinque millimetri e un ago calibro 19 collegato alla sua estremità.Iniziare il degasaggio attaccando il tubo al tubo e consentendo lo scambio di gas per 30 minuti a temperatura ambiente. Staccare il tubo e sigillare immediatamente i fori con argilla modellante. Quindi trasferire i tubi sigillati degas in un bagno di 37 gradi Celsius per 3 1/2 ore per polimerizzare la soluzione di idrogel.Togli il cervello dal tubo. Utilizzando salviette da laboratorio, rimuovere l'idrogel polimerizzato intorno al cervello assicurando che nessun gel residuo rimanga attaccato alla superficie del cervello. Dividi il cervello in fette spesse che contengono tutte le aree di interesse.Mettere le fette nella prima soluzione di compensazione e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Nel frattempo, prepara un tubo perforato per posizionare il cervello. Mettere il tubo perforato in un becher riempito con una seconda soluzione di compensazione su un dispositivo di agitazione.Quindi posizionare il cervello nel becher e sigillarlo con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento. Dopo che il tessuto diventa trasparente, trasferire il cervello in PBST in incubazione a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Sostituire la soluzione con PBST fresco e continuare l'incubazione per altre 24 ore.Quindi trasferire il cervello a PBS a temperatura ambiente per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il cervello dalla PBS e trasferirlo in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Incubare il cervello a 37 gradi Celsius durante la notte.Innanzitutto, posizionare il campione al centro della diapositiva. Usando la colla a caldo, crea pareti sui bordi della diapositiva, quasi alte come il tessuto. Assicurati di lasciare un piccolo spazio in uno degli angoli.Quando lo strato di colla a caldo si avvicina all'altezza della fetta di cervello, applicare una o due gocce della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione sul campione per inumidire la superficie superiore e prevenire la formazione di bolle. Mentre la colla a caldo è ancora liquida, sigillare la parte superiore con un coperchio, posizionandolo nel modo più uniforme possibile, quindi riempire la camera con la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Chiudere lo spazio con la colla a caldo.Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi estensibili. Se per l'imaging viene utilizzato un obiettivo di immersione in olio, aggiungere altri due o tre millimetri di colla alle pareti sopra lo slittamento del coperchio per mantenere la soluzione di immersione. Dopo questo protocollo, il tessuto cerebrale verrà eliminato.Sono state preparate chiare fette di cervello utilizzando questo protocollo per visualizzare popolazioni di astrociti e neuroni nella regione CA1 dell'ippocampo del topo. Tutti gli astrociti hanno espresso tdTomato e neuroni eccitatori che hanno espresso H2B-GFP nei loro nuclei. La camera preparata per il tessuto chiarificato era ottimale per l'imaging al microscopio a due fotoni o confocali.Utilizzando un microscopio a due fotoni, sono stati osservati oltre 300 astrociti in una sezione eliminata della regione CA1 dell'ippocampo del topo. Gli astrociti ippocampali nelle cellule rosse e piramidali, i somata in verde erano visibili e il tessuto spesso e trasparente che rappresentava la vicinanza spaziale tra questi due tipi di cellule. Utilizzando un microscopio confocale laser a scansione, i fasci assonali dei neuroni eccitatori sono stati tracciati su un intero emisfero.I fasci verdi sono stati tracciati dall'ippocampo dorsale verso i corpi super mamillari. I fasci rossi sono stati tracciati dai corpi mamillari verso la loro origine nell'ippocampo di sfiato. Fattori come la temperatura, le concentrazioni e il tempo di incubazione hanno influenzato l'esito della procedura di chiarezza.Pertanto, la precisione in ogni fase del protocollo è vitale per il successo del raggiungimento di tessuti chiari. Usando questa tecnica, misuriamo le distanze tra neuroni e astrociti in diverse strutture cerebrali. Questo protocollo ha permesso l'analisi di due o tre ordini di grandezza in più di cellule rispetto agli studi precedenti.

investigation-spatial-interaction-between-astrocytes-neurons-cleared

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Questo video illustra un metodo per stabilire una co-coltura indiretta neurone-astrocita utilizzando un approccio compartimentato. In questa configurazione, i neuroni e gli astrociti sono spazialmente separati ma condividono un mezzo condizionato. I fattori neurotrofici rilasciati dagli astrociti promuovono la differenziazione dei neuroni e la formazione di connessioni sinaptiche, suggerendo interazioni neurone-glia.

Una tecnica di co-coltura indiretta neurone-astrocita per lo studio delle interazioni neurone-glia

Fonte: Refaeli, R., et al., Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni in cervelli chiariti. J. Vis. Exp. (2022) Il video mostra la preparazione di una camera e il neuroimaging del tessuto ippocampale di topo ripulito utilizzando la microscopia a due fotoni per visualizzare le interazioni spaziali tra astrociti marcati in fluorescenza e neuroni eccitatori.

Microscopia a due fotoni di astrociti e neuroni eccitatori in un tessuto ippocampale di topo cancellato

Gli astrociti nel SNC cambiano le loro proprietà funzionali e strutturali in risposta a stimoli dannosi. Questo rapporto presenta un protocollo per la valutazione della morfologia tridimensionale degli astrociti in condizioni di malattia o dopo interventi terapeutici.

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all'interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato "ponteggi vivente", che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Qui presentiamo un protocollo per valutare l'organizzazione di reti astrocytic. Il metodo descritto riduce al minimo la distorsione per fornire misure descrittivi di queste reti come il conteggio delle cellule, dimensioni, area e posizione all'interno di un nucleo. Anisotropia è valutato con un'analisi vettoriale.

Analizzando le dimensioni, la forma e la direzionalità delle reti dei Astrocytes accoppiato

La pipeline descritta è progettata per la segmentazione di set di dati di microscopia elettronica più grandi di gigabyte, per estrarre morfologie intere celle. Una volta che le celle sono state ricostruite in 3D, software personalizzato progettato intorno alle esigenze individuali può essere utilizzato per eseguire un'analisi qualitativa e quantitativa direttamente in 3D, utilizzando anche la realtà virtuale per superare vista occlusione.

Un metodo per la ricostruzione 3D e l'analisi della realtà virtuale delle cellule gliali e neuronali

Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Questo protocollo descrive i metodi per il sezionamento, la colorazione e l'imaging di sezioni di tessuto fluttuanti del cervello del topo, seguito da una descrizione dettagliata dell'analisi del volume del territorio degli astrociti e della sovrapposizione o della piastrellatura del territorio degli astrociti.

Analisi del volume e della piastrellatura del territorio degli astrociti in sezioni di tessuto fluttuanti spesse

Scopri il metodo CLARITY per studiare le interazioni tra astrociti e neuroni nell'ippocampo del topo. Questa tecnica di clearing tissutale consente la visualizzazione tridimensionale di oltre 300 cellule con microscopia confocale e a due fotoni.

Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Esplora altri video