Stabilire organoidi polmonari umani e differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree

Stiamo introducendo un metodo per stabilire la coltura organoide dell'epitelio delle vie aeree umane in piastre di coltura. Deriviamo organoidi polmonari umani direttamente dai tessuti polmonari primari ad alta efficienza. Gli organoidi polmonari umani derivati sono stabilmente espansi per oltre un anno e un protocollo di differenziazione prossimale consente la generazione di organoidi maturi delle vie aeree in grado di simulare fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico.

Pertanto, il sistema di coltura consente agli scienziati di ricostruire ed espandere l'epitelio delle vie aeree umane nelle piastre di coltura. A dimostrare la procedura saranno Man Chun Chiu e Yifei Yu, dottorandi nel nostro laboratorio Per iniziare l'isolamento cellulare dai tessuti polmonari umani per la coltura di organoidi 3D, tritare i tessuti polmonari in piccoli pezzi di un millimetro con un bisturi sterile e lavare i pezzi di tessuto con 10 millilitri di mezzo basale freddo. Centrifugare i tessuti a 400 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in otto millilitri di mezzo basale integrato con collagenasi ad una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro.

Quindi, digerire i pezzi di tessuto agitando il tubo a 120 RPM per 30-40 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la digestione, pipettare su e giù 20 volte usando una pipetta sierologica da 10 millilitri per tagliare i pezzi di tessuto digerito. Quindi, filtrare la sospensione con un filtro da 100 micron in un tubo da 50 millilitri.

Recuperare e trasferire i pezzi di tessuto dal filtro a un tubo di centrifuga da 15 millilitri con il mezzo basale. Per terminare la digestione, aggiungere il siero bovino fetale al flusso fino a una concentrazione finale del 2%, quindi centrifugare il tubo e risospescere il pellet cellulare in 10 millilitri del mezzo basale come descritto prima. Dopo la centrifugazione, risospesere il pellet in 80-160 microlitri di mezzo a matrice fredda del basamento e posizionare i tubi sul ghiaccio.

Quindi, erogare 40 microlitri della sospensione a ciascun pozzetto di una piastra di coltura di sospensione a 24 pozzetti preriscaldata. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Lasciare che la matrice del seminterrato si solidifichi e formi una goccia.

Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di organoidi polmonari umani mezzo di espansione integrato con cinque nanomolari di heregulin-beta 1 a ciascun pozzetto e incubare la piastra in un incubatore di colture cellulari. Dopo tre giorni, rimuovere il vecchio mezzo mantenendo intatta la goccia e aggiungere con cura il mezzo fresco. Dopo 10-14 giorni di passaggio, osservare gli organoidi al microscopio e assicurarsi che gli organoidi non siano incorporati con una densità cellulare molto elevata.

Per passare gli organoidi polmonari con la tosatura, rompere le goccioline tubando su e giù con una punta di un millilitro. Quindi, trasferire gli organoidi insieme al mezzo in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e regolare il volume a 10 millilitri con un mezzo basale freddo. Centrifugare il tubo a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante e lavare gli organoidi con 10 millilitri di mezzo basale freddo.

Quindi, risospese gli organoidi in due millilitri di mezzo basale freddo e tagliarli in piccoli pezzi con una pipetta Pasteur. Quindi, aggiungere il mezzo basale a un volume totale di 10 millilitri e centrifugare prima di risospescere i frammenti organoidi con una matrice basale fredda sufficiente per consentire un'espansione da 1:3 a 1:5 e posizionare i tubi sul ghiaccio. Erogare 40 microlitri di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti per incubare a 37 gradi Celsius per consentire alla matrice basale di solidificarsi per 10-15 minuti.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di terreno di espansione organoide polmonare a ciascun pozzetto e incubare in un incubatore di colture cellulari. Rinfrescare il mezzo ogni tre giorni e passare gli organoidi ogni due settimane. Per passare gli organoidi polmonari con tripsinizzazione, risospese gli organoidi polmonari raccolti in un millilitro di enzima di dissociazione.

Incubare l'organoide in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo basale al tubo e tagliare meccanicamente gli organoidi tubando su e giù. Controllare la dimensione dei pezzi organoidi al microscopio con ingrandimento 100X prima di terminare la digestione con 40 microlitri di siero bovino fetale.

Portare il volume a 10 millilitri con mezzo basale e centrifuga prima di risospendere i pezzi organoidi in una matrice fredda del basamento con un volume sufficiente al passaggio con un rapporto da 1:5 a 1:10. Successivamente, erogare 40 microlitri di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e coltivare la piastra come dimostrato in precedenza. Per generare organoidi 3D delle vie aeree, incubare gli organoidi polmonari nel mezzo di espansione per sette-10 giorni dopo il passaggio tramite taglio meccanico.

Quindi, sostituire il mezzo di espansione con il mezzo di differenziazione prossimale e incubare gli organoidi in un incubatore di colture cellulari. Dopo 14 giorni, scartare il mezzo in ciascun pozzetto e aggiungere un tampone di lisato cellulare per raccogliere l'organoide differenziato delle vie aeree per l'estrazione dell'RNA e il rilevamento dell'espressione genica cellulare mediante il test RT-qPCR. Pre-incubare gli inserti nell'incubatore di colture cellulari con 250 e 500 microlitri del mezzo basale nella camera superiore e inferiore di una piastra a 24 pozzetti, rispettivamente.

Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo basale al tubo e pipettare su e giù per tagliare gli organoidi in singole cellule. Osservare le cellule al microscopio prima di terminare la digestione con 40 microlitri di siero bovino fetale. Filtrare le celle attraverso un filtro da 40 micron in un tubo da 50 millilitri e trasferire la sospensione cellulare filtrata in un tubo da 15 millilitri.

Riempire la sospensione con mezzo basale per un volume totale di 10 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospesare il pellet raccolto da 24 goccioline in 1 a 2,5 millilitri di mezzo di espansione organoide polmonare, a seconda della densità cellulare. Contare il numero di cellule con il contatore cellulare al microscopio, quindi regolare la concentrazione cellulare a 1,3 volte 10 a sei per millilitro per inserti a 24 pozzetti.

Rimuovere il mezzo basale dalle camere superiore e inferiore prima di aggiungere 500 microlitri di terreno di espansione nella camera inferiore. Semina 100 microlitri di sospensione cellulare preparati in precedenza sulla camera apicale dell'inserto a 24 pozzetti e incubano. Dopo due giorni, sostituire il mezzo di espansione con il mezzo di differenziazione prossimale sia nella camera apicale che in quella inferiore della piastra.

Incubare gli organoidi per 14 giorni e rinfrescare il mezzo ogni tre giorni. Misurare la resistenza elettrica transepiteliale ogni giorno utilizzando un sistema di misurazione della resistenza elettrica. Nella microfotografia rappresentativa, le cellule polmonari appena isolate possono essere viste incorporate nella matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto di tipo due.

Gli organoidi cistici sono apparsi e cresciuti nel tempo. Gli organoidi polmonari dopo il quarto passaggio sono dimostrati qui. Entro due ore dalla cesoiatura meccanica, i frammenti organoidi incorporati nell'estratto della membrana basale formavano i domini cistici.

La microfotografia dello stesso campo il quinto giorno ha confermato la crescita organoide nel tempo. Gli organoidi in espansione ospitavano tutti e quattro i principali tipi di cellule epiteliali delle vie aeree, tra cui la cellula ciliata ACCTUB-positiva o FOXJ1-positiva, la cellula basale P63-positiva, la cellula club CC10-positiva e la cellula calice MUC5AC-positiva in uno stato prematuro. Gli organoidi incubati nel mezzo di espansione e differenziazione prossimale hanno sviluppato nel tempo una morfologia distinta.

Dopo due settimane di differenziazione nel mezzo di differenziazione prossimale, le ciglia mobili erano distinguibili in ogni organoide. È stato osservato che la celia che batte in modo sincrono ha guidato i detriti cellulari all'interno del lume organoide e li ha fatti roteare in modo unidirezionale per rimuovere le particelle inalate. Inoltre, l'analisi della citometria a flusso ha dimostrato che gli organoidi differenziati ospitavano quattro tipi di cellule epiteliali delle vie aeree nel mezzo di differenziazione ed espansione prossimale.

Dopo due settimane di differenziazione, gli organoidi delle vie aeree 2D hanno sviluppato una barriera epiteliale intatta. È stato eseguito un test di blocco del destro per valutare l'integrità della barriera epiteliale formata negli organoidi delle vie aeree 2D. Gli organoidi 2D contenevano abbondanti cellule ciliate.

L'organoide polmonare espandibile a lungo termine e l'organoide differenziato delle vie aeree forniscono un sistema modello fisiologicamente attivo e universale per lo studio della biologia e della patologia respiratoria, incluso COVID-19.