Caratterizzazione della peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi

La sepsi è una risposta immunitaria dell'ospite disregolata all'invasione microbica o al danno tissutale, che porta a lesioni d'organo in un sito distante da quello dell'infezione o del danno. Il grande pubblico è diventato più consapevole di questo disturbo, durante la pandemia di COVID-19. Nel 2017, ci sono stati 48,9 milioni di incidenze di sepsi e 11 milioni di morti in tutto il mondo, che rappresentano quasi il 20% di tutti i decessi globali.

Come ci si può aspettare, la maggior parte dei casi sono negli ospedali. Infatti, uno studio ha rilevato che quasi il 62% degli isolati positivi dei pazienti in terapia intensiva con sepsi erano organismi gram-negativi. Esistono diversi modelli e alcuni dei modelli di sepsi murina comunemente usati includono l'endotossiemia indotta da LPS, il modello di legatura e puntura cecale e i sistemi modello di infezione monobatterica.

Nel nostro laboratorio, abbiamo standardizzato un sistema di modelli murini, per indurre la sepsi peritoneale utilizzando Salmonella Typhimurium. Questo modello è vantaggioso rispetto ad altri, poiché Salmonella Typhimurium è un agente patogeno intracellulare che imita la condizione clinicamente rilevante della sepsi gram-negativa. L'esito della sepsi da peritonite in questo modello, è sistemico con mortalità al 100%, entro 96 ore dopo l'infezione.

Pertanto, questo modello è strumentale nello studio delle risposte infiammatorie dell'ospite. In questo modello, la sepsi è indotta dall'iniezione intraperitoneale di 0,5 milioni di CFU di Salmonella Typhimurium, in un topo C57BL/6 di 8-10 settimane. L'infezione sistemica può essere confermata, valutando la carica batterica degli organi, circa 16 ore dopo l'infezione.

Gli esperimenti che utilizzano Salmonella Typhimurium, richiedono la struttura BSL-2 e l'aderenza alle linee guida BSL-2. Bisogna fare attenzione a utilizzare DPI adeguati e a garantire la sicurezza e seguire i metodi standard di smaltimento a rischio biologico BSL-2. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato istituzionale di etica animale.

Preparazione della coltura di Salmonella Typhimurium. Aggiungere un centinaio di microlitro di Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glicerolo, in 3 ml di brodo LB. Incubare la cultura a 160 giri al minuto, a 37 gradi Celsius durante la notte.

Strisciare 50 microlitri della coltura coltivata durante la notte in brodo LB, su una piastra di agar Salmonella Shigella e incubare a 37 gradi Celsius per 12 ore. Scegli una singola colonia dalla piastra di agar SS striata, usando un microtip. Espellere il microtipo in 3 ml di brodo LB e coltivare a 160 RPM a 37 gradi Celsius durante la notte.

Aggiungere 0,1 mL della coltura batterica in 50 mL di brodo LB e incubare a 37 gradi Celsius, in un incubatore shaker a 160 RPM, per tre o quattro ore, per raggiungere la fase logaritmica di crescita. Diluire la coltura di un fattore due usando il brodo LB. Misurare la densità ottica della coltura a 600 nanometri di lunghezza d'onda della luce in uno spettrofotometro.

Una volta che l'OD raggiunge uno, fare due aliquote di 1 mL di coltura, in tubi di microfuga da 1,5 mL. Centrifugare i tubi a 7.750 G per 15 minuti. Scartare questo surnatante e lavare il pellet con 1 mL di 1XPBS due volte.

Centrifugare i tubi a 7.750 G per 15 minuti. Risospendare il pellet in 0,5 mL di 1XPBS, in due diversi tubi microfuga da 1,5 mL. Combinare le sospensioni di entrambi i tubi, in un tubo da 1,5 ml, ora contenente, circa due moltiplicati per 10 sollevati alla potenza otto unità formanti colonie per mL.

Preparare una sospensione cellulare batterica di 10 CFU/mL di potenza, diluendo la soluzione madre. Nota importante, ottimizza il CFU corrispondente a OD nel tuo laboratorio, per determinare il CFU per OD uno, prima di iniziare gli esperimenti. Topi e infezioni.

Il giorno dell'infezione, tenere il mouse con una mano, pulire la pelle addominale con etanolo al 70% e allargare le zampe posteriori per una migliore accessibilità della parete addominale. Iniettare 0,5 mL di 10 elevati alla potenza sei CFU/mL sospensione batterica per via intraperitoneale, con l'aiuto di una siringa da 1 mL. Post-infezione, placcare la coltura per verificare l'effettivo CFU iniettato, che può variare da 0,2 a 0,8 milioni di CFU per 0,5 ml.

Valutazione CFU degli organi. Il topo è stato sacrificato usando l'asfissia di anidride carbonica. Dopo aver sacrificato il topo infetto, pulire l'addome con un pezzo di cotone, immerso nel 70% di etanolo.

Tagliare la pelle addominale. Fare riferimento all'articolo di Ray e Dittle, per un protocollo video, su come raccogliere il liquido di lavaggio peritoneale. Tagliare la cavità peritoneale e raccogliere l'organo di interesse.

In questo video, stiamo dimostrando l'enumerazione dei CFU d'organo dal fegato. Il fegato subisce un esteso danno istopatologico, in questo modello di sepsi. Tagliare un piccolo pezzo di fegato e metterlo in un tubo di microfuga.

Questo può essere conservato nel ghiaccio per due o tre ore, prima di procedere al passaggio successivo. Pesare il pezzo e trasferirlo in un tubo di microfuga. Preferibilmente, tagliare i pezzi del peso di circa 10-15 mg, per una corretta omogeneizzazione.

Aggiungere 0,5 ml di 1XPBS nel tubo e omogeneizzare gli organi utilizzando un omogeneizzatore manuale. Assicurarsi che gli organi siano completamente omogeneizzati. Aumentare il volume a 1 mL, aggiungendo 0,5 mL di 1XPBS.

Centrifugare i tubi a 200 G per cinque minuti, a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in tubi di microfuga freschi. Preparare diluizioni di 10 alla potenza meno uno e 10 alla potenza meno due, in una piastra da 96 pozzetti.

Distribuire 50 microlitri del diluente, su piastre di agar SS fresche, e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12 ore. Contare il numero di colonie che appaiono in ogni condizione e normalizzare i dati con il peso dell'organo, utilizzando la seguente formula. CFU/mg è uguale al numero di colonie, moltiplicato per 20, moltiplicato per il fattore di diluizione, il tutto diviso per il peso dell'organo in mg.

Nota, il numero 20 viene utilizzato nella formula, per convertire le colonie per piastra in CFU / mL. Questo numero è raggiunto, dividendo 1 mL della quantità di un dato volume di coltura placcato. In questo caso, 50 microlitro.

Ad esempio, se trovi un centinaio di colonie in una piastra di agar SS, dove vengono distribuiti 50 microlitri di 10 potenze meno una diluizione di organo omogeneizzato, del peso di 10 mg, allora CFU / mg sarà uguale a 100 moltiplicato per 20, moltiplicato per 10, il tutto diviso per 10, che è pari a 2000 CFU / mg. Analisi citometrica a flusso di varie popolazioni di cellule immunitarie nell'essudato peritoneale. Raccogliere le cellule peritoneali come descritto in precedenza, da Ray e Dittle.

Risospese il pellet cellulare dal liquido di lavaggio peritoneale, in 1 mL di RPMI integrato con il 10% di FBS. Enumerare i numeri totali delle cellule nel lavaggio peritoneale, utilizzando un emocitometro. Regolare il numero di cella in modo tale che ogni tubo riceva da due a cinque moltiplicato per 10 sollevato alla potenza cinque celle.

Ruotare le cellule verso il basso a 200 G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il surnatante. Lavare le celle una volta con 1XPBS.

Centrifugare le cellule a 200 G per 10 minuti. Bloccare i recettori Fc usando il bloccante FcR. Uno è a 400 diluizione, preparato in tampone di blocco, costituito da 5% FBS e 0,02% azide di sodio in PBS.

Incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Centrifugare le cellule a 200 G per 10 minuti. Scartare il surnatante.

Diluire gli anticorpi coniugati al fluorocromo di interesse nel tampone bloccante. Qui, ne usiamo uno è a 500 diluizione di anti-mouse Ly6G, per macchiare i neutrofili. Nota, possono anche essere mostrate altre popolazioni di cellule immunitarie, usando anti-topo B220 per le cellule B, anti-topo CD3 per le cellule T, anti-topo F4/80 per i macrofagi, eccetera.

Incubare circa 0,2 milioni di cellule in 200 microlitri di soluzioni diluite di anticorpi, in tubi separati. Come controllo negativo, mettere da parte un tubo in ogni tipo di fluorocromo, per un controllo non macchiato. In questo tubo, incubare le cellule con 200 microlitri di tampone bloccante senza anticorpi.

Incubare i campioni sul ghiaccio per 45 minuti, con picchiettamento intermittente ogni 15 minuti. Centrifugare le cellule a 200 G per 10 minuti, a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante.

Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide per 15 minuti a temperatura ambiente, se necessario conservare per diversi giorni. Risospesso le cellule in 200 microlitro di tampone di colorazione FACS, 2% FBS in PBS. Acquisire i dati nel citometro a flusso.

Le immagini delle placche di agar SS mostrate qui, indicano il carico di CFU d'organo nel fegato e nella milza dei topi settici. L'organo omogeneizzato Lys6 è stato diffuso alla diluizione di 10 alla potenza meno uno e incubato a 37 gradi Celsius. Le colonie di S.Typhimurium pigmentate di nero sono apparse dopo circa 12 ore dopo l'incubazione.

Una parte della piastra è mostrata qui come inserto ingrandito per evidenziare le colonie. Questi risultati suggeriscono che l'agente patogeno ha disseminato con successo sistemicamente e colonizzato gli organi interni. Questa figura mostra i sieri isolati da topi sani e settici.

Il volume di sangue raccoglibile dai topi settici è inferiore ai controlli sani, quindi il siero ottenuto è inferiore. Ciò accade a causa dell'aumento della coagulazione nella sepsi. Anche i sieri dei topi settici, mostrano una distinta colorazione rossa, che indica il verificarsi di un'emolisi estesa.

La figura mostra grafici citometrici di cellule peritoneali di topi sani e settici, colorati con anticorpi anti-Ly6G. Queste immagini sono rappresentative di un topo sano e due infetti. I topi settici hanno visto una maggiore infiltrazione di neutrofili nella cavità peritoneale.

In questo video, abbiamo mostrato un metodo per indurre la sepsi batterica nei topi, mediante iniezione intraperitoneale di Salmonella Typhimurium. Questo è un modello utile per studiare gli effetti degli interventi terapeutici nell'attenuazione della sepsi. In questo sistema modello, la composizione cellulare della cavità peritoneale cambia drasticamente per combattere l'agente patogeno.

Pertanto, è un modello utile, nello studio dei cambiamenti cinetici nelle composizioni e nelle funzioni delle cellule immunitarie durante la sepsi. Il modello è anche utile per comprendere l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno intercellulare, i livelli di citochine pro-infiammatorie, l'emolisi e la coagulazione del sangue, che si verificano durante la sepsi.