Name: Studio del meccanorilevamento murino dellintestino tenue del particolato luminale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Esplora il meccanorilevamento intestinale nel topo studiando il transito di particolati luminali nell'intestino tenue. Questo metodo in vivo analizza le decisioni di transito basate su stimoli meccanici con alta risoluzione spaziale.

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Ringraziamo la signora Lyndsay Busby per l'assistenza amministrativa e il signor Joel Pino per il supporto dei media. Le sovvenzioni NIH hanno sostenuto questo lavoro: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 e Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Mayo Clinic.
1. Configurazione
<ol><li>Topi veloci da 8 a 10 settimane per 4 ore. Fornire ai topi l'accesso all'acqua. NOTA: Utilizziamo topi C57BL / 6J maschi wild-type per tutti gli esperimenti presentati qui, ma possono essere eseguiti su topi di qualsiasi ceppo, sesso e genotipo.</li>
	<li>Raffreddare 15 mL di acqua distillata in un tubo conico da 50 mL in frigorifero a 4 °C.</li>
	<li>Riscaldare altri 15 ml di acqua distillata in un becher utilizzando una piastra riscaldante con una barra di agitazione magnetica a circa 80-90 °C.</li>
	<li>Misura 0,5% metilcellulosa per un totale di 30 ml (0,15 g).</li>
	<li>Aggiungere delicatamente la metilcellulosa a 15 ml di acqua calda in modo che non si aggreghi. La soluzione di metilcellulosa sarà torbida durante questo processo.</li>
	<li>Una volta sciolto, rimuovere il becher dalla piastra riscaldante e aggiungere i 15 ml di acqua refrigerata al becher caldo.</li>
	<li>Mettere in frigorifero a 4 °C fino a quando la soluzione è limpida, circa 15-20 min.</li>
	<li>Quando limpido, pesare 3 mg di isotiocianato di rodamina (RITC)-destrano per 5 ml di soluzione di metilcellulosa allo 0,5% e mescolare per combinare. Questa è la condizione liquida nella sezione Risultati rappresentativi .<ol><li>In alternativa, pesare 25 mg di microsfere fluorescenti di polietilene e mescolare con 200 μL della soluzione di metilcellulosa fino a quando non è ben incorporato. L'incorporazione completa delle microsfere è assicurata dal vortice prima del gavage. Lo sperimentatore deve visualizzare una distribuzione omogenea delle microsfere sospese nella miscela.</li>
		<li>Poiché la soluzione RITC-destrano è sensibile alla luce, refrigerare la soluzione. Preparare in anticipo la soluzione RITC-destrano e la miscela di microshpere e utilizzare entro 2 mesi. Risospendere la miscela di microsfere prima dell'uso. NOTA: Microsfere di varie dimensioni vengono utilizzate per studiare la manipolazione gastrointestinale di materiali diversi. Nella sezione Risultati rappresentativi , dimostriamo i risultati dell'utilizzo di microsfere piccole (diametro: 75-90 μm) e più grandi (diametro: 180-212 μm).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Gavage del contenuto intraluminale
<ol><li>Preparare la sonda gastrica collegando un tubo di alimentazione da 18 Ga x 50 mm a una siringa da 1 mL e aspirando 200 μL di soluzione RITC o soluzione di microsfere.</li>
	<li>Trattenere manualmente l'animale a digiuno usando la tecnica di ritenuta con una sola mano25. Fare riferimento alle informazioni dell'istituzione sulle corrette tecniche di contenzione murina.</li>
	<li>Inserire delicatamente il tubo di alimentazione attraverso la bocca e l'esofago del topo fino a quando non entra nello stomaco. NOTA: il passaggio gavage è fondamentale per un esperimento di successo. Richiede mani esperte in grado di inserire costantemente il tubo all'incirca alla stessa distanza in ciascun mouse. Questo passaggio deve essere standardizzato dagli sperimentatori che eseguono il protocollo. Lo stesso sperimentatore dovrebbe sondare tutte le coorti di topi che saranno confrontate tra loro.</li>
	<li>Espellere lentamente il contenuto della siringa nello stomaco e rimuovere con attenzione il tubo dal mouse.</li>
	<li>Dopo il gavage, riportare il topo nella gabbia.</li>
	<li>Smaltire il tubo di gavage.</li>
	<li>Ripetere il processo secondo necessità per il numero desiderato di animali.</li>
</ol>3. Dissezione intestinale
<ol><li>Prima di iniziare le dissecazioni, accendere lo strumento di imaging in vivo per consentirgli di raggiungere la temperatura.</li>
	<li>Sacrificare il mouse 30 minuti dopo il gavage. Utilizzare l'inalazione di anidride carbonica per sacrificare il topo, seguita da dislocazione cervicale per garantire il successo dell'eutanasia.</li>
	<li>Dopo aver confermato il successo dell'eutanasia, posiziona il topo in posizione supina su uno stadio di dissezione e appunta le sue quattro appendici sul palco per avere accesso all'addome. Bagnare la superficie dell'addome con etanolo al 70% per bagnare i peli addominali.</li>
	<li>Utilizzare una pinza da micro-dissezione # 5 per tirare la pelle e acquisire forbici chirurgiche affilate per fare un'incisione trasversale 1 cm sopra l'ano. Per esporre la cavità intraperitoneale, continuare l'incisione verticalmente sull'addome fino alla gabbia toracica.</li>
	<li>Spostare delicatamente il cieco a sinistra con la pinza da micro-dissezione per esporre il colon distale.</li>
	<li>Tagliare il colon distale con le forbici da microdissezione appena prossimali al retto.</li>
	<li>Sbrogliare delicatamente il colon, il cieco e l'intestino tenue tirando lentamente nella direzione opposta. NOTA: Mantenere le viscere sezionate in un segmento continuo creerà la massima facilità per lo sperimentatore. Strappe e strappi lungo il segmento renderanno più difficili i passaggi successivi.</li>
	<li>Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare prossimalmente allo stomaco.</li>
	<li>Utilizzare una pinza per trasferire le viscere sezionate sul foglio di misurazione (Figura 1). Posizionare lo stomaco a 0 mm e disporre le viscere lungo il righello fino a 200 mm. Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare a 200 mm. Ripeti questo processo di allineamento delle viscere da 0 mm a 200 mm lungo i righelli rimanendo sicuro che l'orientamento delle viscere non si confonda.<ol><li>Fai attenzione a evitare di allungare le viscere mentre ti allinei ai righelli.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta che il tessuto è disposto sul righello, disporre il cieco in modo che sia parallelo al tessuto ma non in contatto diretto con esso (se si trova una fluorescenza all'interno di quella regione, allora sarà necessaria una chiara distinzione di differenza tra il cieco e l'intestino).</li>
	<li>Posizionare il foglio di misurazione con il tessuto sezionato in un'area scura in modo che la fluorescenza possa essere conservata fino al momento dell'immagine.</li>
</ol>4. Imaging ex vivo
<ol><li>Aprire il software di imaging in vivo e accedere.</li>
	<li>Inizializzare lo strumento di imaging in modo che sia pronto per l'acquisizione delle immagini.</li>
	<li>Impostare i campi 'Eccitazione' ed 'Emissione' sul colore corrispondente utilizzato per il tallone o il gavage RTC. Rosso (liquido): eccitazione 535 nm / emissione 600 nm. Verde (microsfere): eccitazione 465 nm / emissione 520 nm.</li>
	<li>Imposta l'esposizione su "Auto".</li>
	<li>Selezionare il campo visivo.</li>
	<li>Prima di inserire il foglio di misurazione nello strumento, assicurarsi che l'intestino non si sia spostato durante il trasporto.</li>
	<li>Posizionare il foglio di misura nello strumento all'interno del campo visivo.</li>
	<li>Chiudere saldamente lo sportello dello strumento e selezionare Istantanea per fotografare il campo visivo.</li>
	<li>Salva le immagini raccolte su un'unità flash per l'analisi. Salva le singole acquisizioni delle immagini fluorescenti e fotografiche. Una sovrapposizione della fotografia e della fluorescenza indica la posizione del materiale fluorescente nel tratto gastrointestinale (Figura 1). NOTA: si consiglia di salvare i file nel formato Tag Image File (.tif) per l'elaborazione a valle.</li>
</ol>5. Analisi
<ol><li>Aprire i file di immagine fluorescenti e fotografati in un software di modifica delle immagini.</li>
	<li>Regola la dimensione in pixel di entrambe le immagini in modo che abbiano esattamente le stesse dimensioni (la nostra convenzione era di impostare entrambe le immagini su 1280 pixel per 850 pixel [altezza x larghezza]).</li>
	<li>Chiudere il file della fotografia. I passaggi seguenti riguardano solo l'immagine fluorescente.</li>
	<li>Utilizzare uno strumento gomma per rimuovere lo sfondo e renderlo trasparente. Potrebbe essere necessaria una gomma per rimuovere le patch dello sfondo rimanente.</li>
	<li>Create un nuovo livello. Rendilo uno sfondo completamente nero per il segnale fluorescente. Ciò può essere ottenuto scegliendo un riempimento nero sul livello e trascinando il livello sotto il livello con l'immagine fluorescente.</li>
	<li>Salvate la nuova immagine fluorescente, contenente solo il segnale fluorescente su sfondo nero, come nuovo file .tif.</li>
	<li>Aprire le nuove immagini fluorescenti e fotografare in ImageJ.</li>
	<li>Trasforma ogni immagine in un'immagine a 32 bit scegliendo Immagine > Digitare > 32 bit.</li>
	<li>Create un'immagine unita di entrambi scegliendo Immagine > Colore > Unisci canali. Nella finestra di dialogo visualizzata, selezionate il file della fotografia per il canale grigio e il file fluorescente sotto i canali colorati.</li>
	<li>Disattivate la scala dell'immagine unita selezionando Analizza > Imposta scala > Fare clic per rimuovere scala.</li>
	<li>Selezionare lo strumento "Rettangolo" in ImageJ.</li>
	<li>Disegna un rettangolo attorno a una sezione dell'intestino tenue. Presta molta attenzione all'ampiezza di questa regione di interesse (ROI), poiché dovrebbe rimanere costante tra tutti i ROI. Il valore nominale non è essenziale, solo che è mantenuto coerente tra tutti i ROI disegnati su questa immagine [poiché l'intestino tenue occupa diverse righe, i singoli ROI verranno disegnati su ciascuna sezione dell'intestino tenue in una riga diversa (Figura 1)]. Nella Figura 2 viene illustrata la posizione del valore della larghezza nella barra degli strumenti di ImageJ.</li>
	<li>Duplica il ROI selezionando Immagine > Duplica. Selezionare solo il canale corrispondente al canale colorato.</li>
	<li>Usa di nuovo lo strumento rettangolo per disegnare un ROI su tutta la nuova immagine.</li>
	<li>Recuperare un profilo della fluorescenza selezionando Analizza > Profilo di tracciatura. Il grafico risultante traccia sull'asse y l'intensità media per ciascun pixel lungo la lunghezza del ROI. Questo è stato selezionato nel passaggio 5.12 per essere la lunghezza della sezione analizzata dell'intestino tenue</li>
	<li>Apri l'elenco dei valori e copiali in un software per fogli di calcolo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.12-5.16 per ogni sezione dell'intestino tenue su una riga di righello diversa. Continua a incollare i valori sullo stesso file di foglio di calcolo immediatamente sotto ogni set precedente di valori, in modo che tutte le righe continue in quella colonna contengano il valore di intensità media per l'intera lunghezza dell'intestino tenue.</li>
	<li>Nel software del foglio di calcolo, moltiplicare ogni valore di intensità media per la larghezza costante del rettangolo ROI creato nel passaggio 5.12. Questo produrrà il valore di intensità reale lungo l'intestino tenue in ogni punto. NOTA: diversi animali avranno lievi variazioni sulla lunghezza dell'intestino tenue. Per evitare che le differenze di lunghezza influiscano sul risultato dell'analisi dei dati a valle, la stringa di valori di intensità deve essere collegata in un numero consistente di contenitori in tutti i campioni sperimentali (i risultati della Figura 3, della Figura 4 e della Figura 5 visualizzano i risultati per tre dimensioni dei contenitori). </li>
	<li>Dividere il numero di valori di intensità per il numero di contenitori desiderati. Il quoziente S risultante determina il numero di valori di intensità inclusi in ciascun contenitore.</li>
	<li>Determinare il contenitore in cui andrà ogni valore di intensità non elaborato utilizzando una formula di arrotondamento. Questo passaggio inserisce ogni valore di intensità non elaborato in un contenitore. Ogni valore di intensità grezzo è indicizzato cronologicamente con il numero intero N. Il quoziente N/S determina il numero di bin assegnato a ciascun valore non elaborato. La formula di arrotondamento deve arrotondare questo quoziente a un numero intero senza decimali.</li>
	<li>Generare il valore per ogni raccoglitore utilizzando una formula averageif. L'obiettivo è fare la media dei valori grezzi assegnati a un contenitore specifico nel passaggio 5.20. Quindi, gli argomenti nella formula dovrebbero essere: (1) contenitori assegnati generati nel passaggio 5.20, (2) numero di bin, (3) valori di intensità grezzi. NOTA: La prima analisi che possiamo eseguire sui dati binned è un'analisi geometrica del centro, che quantifica fino a che punto osserviamo la massima intensità fluorescente lungo l'intestino tenue (Figura 4).</li>
	<li>Normalizzare ogni valore di intensità sull'intensità fluorescente totale. In altre parole, dividere ogni valore di intensità per la somma di tutte le intensità.</li>
	<li>Moltiplicare ogni valore normalizzato per il numero bin. Il prodotto riflette il peso relativo di ciascun contenitore, contribuendo all'intensità totale della fluorescenza.</li>
	<li>Sommando tutti i valori generati nel passaggio 5.23 si ottiene il numero bin al centro del segnale fluorescente. Dividere per il numero di contenitori per esprimere il centro geometrico come la frazione di intestino tenue percorsa dal centro fluorescente. NOTA: Per riflettere la distribuzione spaziale del segnale, il passo successivo consiste nel generare lo spettro di potenza del set di dati sull'intensità binned (Figura 5).</li>
	<li>Aprire una procedura guidata FFT (Fast Fourier Transform) nel software del foglio di calcolo. Selezionare l'input come set di dati associato e l'output come set vuoto dello stesso numero di righe dei raccoglitori.</li>
	<li>Estrarre il componente del valore reale della FFT.</li>
	<li>Aumentare ogni valore reale della FFT alla seconda potenza. Questo produce un set di dati di spettri di potenza.</li>
	<li>Selezionare la prima metà del set di dati degli spettri di potenza e spostarlo in modo che si trovi al di sotto della seconda metà. Questo ha l'effetto di centrare gli spettri di potenza attorno alla frequenza centrale quando viene tracciata nel passo successivo.</li>
	<li>Tracciare gli spettri di potenza sull'asse y di un grafico x-y dove i valori dell'asse x sono l'intervallo da -1 x (numero di bin/2) a (numero di bin/2) -1. Nel caso di 1000 contenitori, i valori degli assi sarebbero compresi tra -500 e 499.</li>
	<li>Gli spettri di potenza per ciascun animale dovrebbero essere confrontati sulla base della diffusione di picchi diversi da zero e delle altezze di questi picchi diversi da zero.</li>
</ol>

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</ol>

Il tratto gastrointestinale, come altri organi tubulari, come i vasi sanguigni, richiede sensori meccanici ed effettori per mantenere l'omeostasi26,27,28. Tuttavia, il tratto gastrointestinale è unico in quanto le proprietà fisiche dei materiali che lo attraversano non sono costanti tra i pasti. Contenuti intraluminali di varie proprietà fisiche (solido, liquido e gas) transitano nell'intestino, generando diversi input meccanici...

Il tratto gastrointestinale umano (GI) è un sistema di organi lungo più piedi, approssimativamente approssimato come un tubo di varie dimensioni e proprietà fisiche1. Mentre il contenuto si muove attraverso la sua lunghezza, la funzione primaria del tratto gastrointestinale è quella di assorbire sostanze critiche per la vita. L'intestino tenue è specificamente responsabile dell'assorbimento dei nutrienti. Il transito dell'intestino tenue è strettamente regolato per abbinare le funzioni di digestione e assorbimento, con conseguente vari modelli di motilità. Bayliss e Starling descrissero la "legge dell'intestino"2 nel 1899, mostrando il programma di propulsione contrattile nell'intestino noto oggi come riflesso peristaltico; Il segmento prossimale al bolo alimentare si contrae per spingerlo in avanti e il segmento distale si rilassa per riceverlo. In teoria, questo modello da solo potrebbe essere sufficiente per trasportare materiale abortivamente, ma oltre un secolo di ricerca ha dipinto un quadro più complesso dell'attività contrattile nel tratto gastrointestinale. Nell'uomo sono riconosciuti tre periodi di motilità dell'intestino tenue: il complesso motorio migrante (MMC), il periodo di digiuno e il periodo postprandiale3. Gli stessi modelli sono stati riportati nei topi 4,5. La MMC è un modello motorio ciclico conservato nella maggior parte dei mammiferi 6,7. La MMC ha un caratteristico pattern a quattro fasi che funge da utile marcatore clinico nei disturbi gastrointestinali funzionali7. Le quattro fasi, in ordine di occorrenza, sono (I) quiescenza, (II) contrazioni irregolari a bassa ampiezza, (III) contrazioni regolari ad alta ampiezza e (IV) periodo di rampa dell'attività decrescente7. L'MMC segna il principale modello motorio del periodo di digiuno3. Le MMC del periodo di digiuno chiariscono il contenuto dell'intestino tenue in preparazione del pasto successivo.
I modelli motori del periodo postprandiale sono ottimizzati per le funzioni digestive e assorbenti3. Indipendentemente dalla composizione calorica, il transito iniziale è rapido lungo l'intestino tenue, il contenuto viene distribuito lungo la lunghezza dell'intestino e il transito successivamente rallenta8. L'assorbimento è ottimizzato aumentando la superficie di contatto e rallentandola per aumentare il tempo di permanenza. Una volta che i nutrienti sono all'interno del lume, il modello dominante consiste in contrazioni ravvicinate (<2 cm di distanza) non coordinate (contrazioni segmentanti), con alcune contrazioni sovrapposte di grande ampiezza che coprono l'intera lunghezza dell'intestino tenue (contrazioni peristaltiche)9. Le contrazioni segmentanti mescolano i contenuti intraluminali in posizione. Le occasionali grandi contrazioni peristaltiche spingono il contenuto verso il colon.
La tempistica di questa transizione verso MMC dipende dal volume del cibo e dalla composizione calorica10. Pertanto, l'intestino tenue campiona segnali luminali per regolare quando passare tra i periodi di motilità. I segnali meccanici, come le proprietà fisiche del contenuto luminale11, il volume luminale e la tensione della parete, impegnano le cellule meccanorecettrici nella parete GI 12,13,14,15,16. Infatti, aumentare la componente solida di un pasto porta ad un aumento del transito dell'intestino tenue17. Ipotizziamo che le proprietà fisiche, come lo stato liquido o solido dei contenuti intraluminali, debbano impegnare diversi meccanorecettori a causa delle varie forze che generano sulla parete GI18.
Il gold standard per misurare il transito GI in vivo nell'uomo, come nei topi, è l'uso di traccianti radioattivi misurati mediante scintigrafia mentre escono dallo stomaco o transitano lungo il colon19,20. Nei mammiferi, l'intestino tenue si muove in modi imprevedibili rendendo l'intestino tenue difficile da visualizzare in vivo in modo affidabile, ma si stanno facendo progressi21. Inoltre, attualmente mancano strumenti per quantificare come l'intestino tenue gestisce particolati di varie proprietà e dimensioni. Il punto di partenza qui è stata una tecnica gold standard che standardizza lo studio del transito dell'intestino tenue 22,23,24 e della funzione barriera 22. Consiste nel gavagare topi con un materiale fluorescente, in attesa della motilità gastrointestinale per trasportare il materiale, asportando il tratto gastrointestinale, segmentandolo in diverse sezioni dallo stomaco al colon, sezionando e omogeneizzando il contenuto intraluminale per la quantificazione della fluorescenza. Abbiamo apportato due miglioramenti. In primo luogo, abbiamo modificato la composizione del contenuto gavaged per includere perline microscopiche fluorescenti per determinare come l'intestino tenue distribuisce il particolato fisico. In secondo luogo, abbiamo migliorato la risoluzione spaziale visualizzando l'intero tratto gastrointestinale dallo stomaco al colon ex vivo e abbiamo utilizzato il binning di dimensioni variabili per standardizzare la nostra analisi tra gli animali. Ipotizziamo che questo riveli nuove intuizioni sull'equilibrio delle contrazioni propulsive rispetto a quelle segmentanti durante la fase postprandiale.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>altri topi possono essere utilizzati con questo protocollo</td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Software Excel</td><td>Microsoft</td><td>n/a</td><td>utilizzato per l'analisi di fogli di calcolo</td></tr><tr><td>Microsfere di polietilene verde fluorescente 1.00g/cc 75-90um - 10g</td><td>UVPMS-BG-1.00 Cospheric 75-90um - 10g</td><td></td> <td>"perline più piccole" nel manoscritto</td></tr><tr><td>Microsfere di polietilene verde fluorescente 1.00g/cc 180-212um - 10g</td><td>Cospheric</td><td>UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g</td><td>"perle più grandi" nel</td></tr><tr><td>manoscritto Aghi Gavage</td><td>Instech</td><td>FTP-18-50-50</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>utilizzato per estrarre il profilo di fluorescenza</td></tr><tr><td>Carta per righello laminata (preparata internamente)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa (viscosità: 400 cP)</td><td>Sigma</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop software</td><td>Adobe</td><td>n/a</td><td>utilizzato per l'elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Isotiocianato di rodamina B-destrano</td><td>Sigma</td><td>r8881-100mgcondizione</td> <td>"liquida" nel manoscritto</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Sistema di imaging in vivo</td></tr></tbody></table>

studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

La motilità gastrointestinale (GI) è fondamentale per la normale digestione e assorbimento. Nell'intestino tenue, che assorbe i nutrienti, la motilità ottimizza la digestione e l'assorbimento. Per questo motivo, alcuni dei modelli di motilità nell'intestino tenue includono la segmentazione per la miscelazione dei contenuti luminali e la peristalsi per la loro propulsione. Le proprietà fisiche dei contenuti luminali modulano i modelli di motilità dell'intestino tenue. La stimolazione meccanica dei circuiti meccanosensoriali GI mediante il transito dei contenuti luminali e della motilità intestinale sottostante avvia e modula complessi schemi motori GI. Tuttavia, i meccanismi meccanosensoriali che guidano questo processo rimangono poco conosciuti. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di strumenti per sezionare come l'intestino tenue gestisce materiali di diverse proprietà fisiche. Per studiare come l'intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell'intestino tenue. Gavage topi vivi con liquido fluorescente o minuscole perline fluorescenti. Dopo 30 minuti, sezioniamo le viscere per visualizzare la distribuzione del contenuto fluorescente su tutto il tratto gastrointestinale. Oltre alle misurazioni ad alta risoluzione del centro geometrico, utilizziamo il binning di dimensioni variabili e l'analisi spettrale per determinare in che modo i diversi materiali influenzano il transito dell'intestino tenue. Abbiamo esplorato come un meccanismo di "tocco intestinale" recentemente scoperto influisce sulla motilità dell'intestino tenue usando questo approccio.

Mostriamo risultati rappresentativi dalla fase 3 in poi. La figura 1 mostra le viscere espiantate intatte, con misurazioni fluorescenti sovrapposte. Lo stomaco (viola) è disposto lungo lo stesso asse dell'intestino tenue (arancione), ma preferiamo spostare il cieco (blu) di lato per evitare sovrapposizioni con l'intestino crasso (arancione). Come evidenziato nel pannello di sinistra, questo non è sempre possibile a causa delle dimensioni dell'organo. Tagliamo l'intestino tenue a ~ 200 mm per...

Per studiare come l'intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell'intestino tenue.

Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Questo è un protocollo che studia come l'intestino tenue gestisce materiali di diverse proprietà fisiche e come distribuisce tali materiali nello spazio. È uno strumento complementare nel nostro studio della meccanosensibilità intestinale. I principali vantaggi di questo protocollo sono che può essere utilizzato per studiare materiali o miscele con proprietà fisiche diverse e che la risoluzione ci consente di risolvere transiti regionali su brevi segmenti intestinali.Questa tecnica si aggiunge alla nostra comprensione della meccanosensibilità intestinale. Ci aiuta a capire come l'intestino tenue prende decisioni di transito in base ai segnali meccanici che riceve dal contenuto intraluminale. Per iniziare, preparare il gavage collegando un tubo di alimentazione di spessore 18 gauge e lunghezza di 50 millimetri a una siringa da 1 millilitro e aspirando 200 microlitri di soluzione RITC o soluzione di microsfere.Quindi, trattenere manualmente l'animale a digiuno usando la tecnica di ritenuta con una sola mano, quindi inserire delicatamente il tubo di alimentazione attraverso la bocca e l'esofago del topo fino a quando non entra nello stomaco. Una volta inserito, espellere lentamente il

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Ileo postoperatorio (POI) è una complicanza della chirurgia addominale che porta a un aumento della morbilità e degenza prolungata. Poiché le strategie profilattiche o terapeutiche mancano intensificazione della ricerca è necessaria. Pertanto abbiamo stabilito un modello di topo standardizzata e possibile esaminare la fisiopatologia di POI e di studiare i potenziali opzioni terapeutiche.

Valutazione funzionale della motilità intestinale e Wall infiammazione intestinale nei roditori: Analisi in un modello standardizzato di manipolazione intestinale

Questo video dimostra la generazione di un modello di ansa ileale per studiare la permeabilità intestinale in un modello murino. Questo metodo fornisce un modello in tempo reale per comprendere la funzione della barriera epiteliale e la conseguente risposta immunitaria.

Modello di ansa ileale del topo: un modello chirurgico per studiare la permeabilità intestinale nel topo

In questo video, descriviamo una procedura chirurgica per generare un'ansa del colon prossimale di topo o un segmento pcLoop seguita da un'iniezione intraluminale di marcatori fluorescenti nel segmento per studiare la permeabilità epiteliale intestinale.

Generazione di un modello di ansa del colon prossimale di topo: una procedura chirurgica per generare un'ansa del colon prossimale e misurare la permeabilità intestinale rilevando marcatori fluorescenti nel siero dopo l'iniezione intraluminale

La misurazione in vivo delle contrazioni della muscolatura liscia lungo il tratto gastrointestinale degli animali da laboratorio rimane una tecnica potente, anche se sottoutilizzata. Gli estensimetri flessibili a doppio elemento non sono disponibili in commercio e richiedono la fabbricazione. Questo protocollo descrive la costruzione di estensimetri affidabili ed economici per l'impianto acuto o cronico nei roditori.

Fabbricazione e impianto di miniatura a doppio elemento Estensimetri per misurazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinale Contrazioni nei roditori.

Questo protocollo descrive l'uso di preparati di tessuto intestinale asportati o "sacche intestinali" come modello ex vivo della funzione della barriera intestinale. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'integrità sia della barriera epiteliale che dello strato di gel mucoso in specifici siti intestinali in modelli animali di malattia digestiva.

Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

Questo articolo descrive una tecnica di imaging video e una mappatura spazio-temporale ad alta risoluzione per identificare i cambiamenti nella regolazione neurale della motilità del colon nei topi adulti. Effetti sottili sulla funzione gastrointestinale (GI) possono essere rilevati utilizzando questo approccio in preparati tissutali isolati per migliorare la nostra comprensione della malattia gastrointestinale.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

La funzione di barriera epiteliale intestinale disregolata e le risposte immunitarie sono segni distintivi della malattia infiammatoria intestinale che rimangono scarsamente studiate a causa della mancanza di modelli fisiologici. Qui descriviamo un modello di loop intestinale del topo che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore per studiare la permeabilità della mucosa e il reclutamento di leucociti in vivo.

Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale

Questo studio presenta un metodo di imaging 3D che utilizza tessuti intestinali a montaggio intero e microscopia multi-fotone per quantificare il muco secreto, consentendo un'analisi volumetrica precisa e la visualizzazione della dinamica del muco in risposta a stimoli come il cloruro di carbamilcolina.

Quantificazione tridimensionale del muco intestinale mediante imaging tissutale a montaggio intero

Questo articolo descrive: (1) somministrazione orale tramite gavage di molecole di prova ai topi neonatali già a partire dal DOL 6; e (2) valutazione ex vivo della funzione della barriera epiteliale del colon nelle biopsie dai cuccioli DOL 10 allo svezzamento (DOL 20) valutando la permeabilità paracellulare e transcellulare con camere di Ussing.

Gavage orale nei cuccioli neonatali di topo e valutazione funzionale dell'integrità della barriera intestinale utilizzando camere di uso

Esplora il meccanorilevamento intestinale nel topo studiando il transito di particolati luminali nell'intestino tenue. Questo metodo in vivo analizza le decisioni di transito basate su stimoli meccanici con alta risoluzione spaziale.

Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

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